Een groep complexen op basis van PAMAM en Quantum Dots gebruikt in klinische immunoassays

Resultaten en discussie

De groep complexen omvat twee delen, een PAMAM-deel en een QDs-deel. Het PAMAM-deel is een aan PAMAM geconjugeerd anti-konijn IgG van geit. We gebruikten vijfde generatie amino-getermineerde PAMAM-dendrimeren (G5 PAMAM) als oppervlaktestabiliserend middel om oplosbaarheidskenmerken te bieden die ideaal zijn voor waterige omgevingen, maar dit dendrimeer heeft een sterke positieve lading die schadelijk is voor antilichaambinding. Om de positieve lading te neutraliseren, hebben we PAMAM opgelost in DMSO en barnsteenzuuranhydride (dihydro-2,5-diketotetrahydrofuran) toegevoegd om de PAMAM-aminogroep te neutraliseren. De aminogroep in PAMAM reageert met barnsteenzuuranhydride om amidebindingen te vormen [6,7,8,9,10]. Na de reactie werd het product gedialyseerd, gevriesdroogd, gewogen en opnieuw opgelost, de productie is bijna neutraal en we noemden het product "N-PAMAM", dat kan conjugeren met anti-konijn IgG van geiten. PAMAM, vooral G5 PAMAM, bevat een groot aantal holtes en het IgG kan ingekapseld zijn in de lege ruimten van G5 PAMAM [11]. Geiten-anti-konijn IgG werd eerst opgelost in MES-buffer (0,1 mol / L, pH - 6,0), vervolgens werden EDC en sulfo-NHS (in een molaire verhouding van 1:1) toegevoegd en het mengsel werd gedurende 15 min geïncubeerd. Ten slotte werd N-PAMAM (neutraal PAMAM) toegevoegd, gevolgd door een nacht incubatie bij 4°C in een schudbed. Dit polymeer assembleerde zichzelf in een waterige oplossing om polymere micellen te vormen die de anders onoplosbare gasten met een laag molecuulgewicht inkapselden [12]; na de reactie was dialyse vereist om de niet-gereageerde materialen te verwijderen. Vervolgens werd de productie gevriesdroogd, gewogen en opnieuw opgelost in conserveringsbuffer, en ten slotte werd het N-PAMAM-geconjugeerde anti-konijn IgG van geit gemaakt.

De fluorescentie- en UV-vis-spectra van N-PAMAM-IgG (geit-anti-konijn) in MES worden getoond in Fig. 1. Vergeleken met N-PAMAM (neutrale PAMAM) en IgG, is de fluorescentie-emissiepiek van N-PAMAM-IgG was van de laagste intensiteit. Het UV-vis spectrum laat zien dat in vergelijking met IgG, MES buffer, PAMAM en N-PAMAM alleen N-PAMAM-IgG een absorptiepiek had bij een golflengte van 200 nm. Of het nu gaat om het fluorescentiespectrum of het UV-vis-spectrum, N-PAMAM-IgG vertoont verschillende kenmerken in vergelijking met N-PAMAM en IgG, wat indirect bewijst dat N-PAMAM en IgG zijn gecombineerd in plaats van gewoon gemengd. Om de antilichaamactiviteit van N-PAMAM-IgG te detecteren, werd ELISA uitgevoerd. Zoals getoond in Fig. 2, ging de IgG (geiten-anti-konijn) antilichaamresistentie niet verloren bij koppeling met N-PAMAM.

een Fluorescentiespectra van PAMAM-IgG (geit-anti-konijn) in MES. De excitatiegolflengte was 548 nm. b UV-vis-spectra van PAMAM-IgG (geit-anti-konijn) in MES en emissiespectra over een reeks golflengten

ELISA-methode om resistentie tegen N-PAMAM-IgG (geiten-anti-konijn) antilichaam te detecteren. N-PAMAM-IgG werd gebruikt als een antigeen en verdund tot verschillende concentraties. Konijn-IgG-HRP werd gebruikt als een antilichaamsonde om de resistentie van N-PAMAM-IgG te detecteren. De absorptiemeting werd gedaan bij een golflengte van 450 nm

Het deel van de QDs is een QDs-geconjugeerd geit anti-muis IgG. Aan antilichaam geconjugeerde QD's worden meestal gevormd door kruiskoppelingsreacties, waarbij antilichaammoleculen binden aan functionele groepen zoals carboxylgroepen of aminogroepen op het oppervlak van de QD's [13, 14]. In deze studie gebruikten we kern / schaal CdSe / ZnS wateroplosbare kwantumdots gestabiliseerd met carboxylliganden en de carbodiimide-koppelingsreactie met behulp van EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidehydrochloride). Deze methode is een van de meest populaire methoden voor het conjugeren van een antilichaam aan het oppervlak van QD's [15,16,17]. De micellen van de CdSe / ZnS QD's werden eerst geïncubeerd in aanwezigheid van EDC en sulfo-NHS in boraatbuffer (5 mM BS, pH 7,2). Vervolgens werd geit-anti-muis-IgG toegevoegd en het mengsel werd een nacht in het donker bij 4°C in een schudbed geïncubeerd. Ten slotte werd 10% BSA (runderserumalbumine) toegevoegd om de niet-gereageerde QD's te blokkeren, en de productie werd gezuiverd door achtereenvolgens centrifugeren en opnieuw oplossen om de niet-gereageerde materialen te verwijderen. De antilichaamactiviteit van het QDs-geconjugeerde IgG (geiten-anti-muis) kan 3  maanden behouden blijven na bewaring bij 4 °C in het donker.

De deeltjesgrootte van de QD's-IgG (geiten-anti-muis) en QD's in conserveringsbuffer (2,5 mM BS, pH   8,0, 0,1% BSA) worden getoond in Fig. 3a. Na de koppelingsreactie nam de diameter van de producten duidelijk toe en hadden de producten een goede homogeniteit en stabiliteit. Deze kenmerken zijn de sleutel tot hun gebruik als detectiesonde. De fluorescentiespectra van de QDs-IgG en QD's worden getoond in Fig. 3b, en zoals getoond in Fig. 3a, toont de toegenomen productiediameter aan dat het IgG werd gecombineerd met de QD's, maar de QDs-IgG fluorescentie-emissiepiek was hetzelfde als de QD's. Dit resultaat betekent dat de koppeling van IgG en QD's de optische kenmerken van de QD's niet veranderde, wat nuttig is voor hun toepassing in immunoassays. Om de antilichaamactiviteit van het QDs-IgG te detecteren, gebruikten we een ELISA-methode met een PVDF-membraan. Het muis-anti-AKT-antilichaam werd verdund tot concentraties van 1 g/ml, 10 g/ml, 100 g/ml en 200  μg/ml, en de vier concentratiegradiëntantigenen werden gehybridiseerd met QDs-IgG (geiten-anti-muis) bij dezelfde concentratie van 0,1 mg/ml. Na hybridisatie gedurende 40 min bij 37°C in het donker, werd het PVDF-membraan 3 keer gewassen met PBST (pH -6,0, 0,1% Tween 20) en werd het PVDF-membraan bestraald met UV-licht. De fluorescentie-intensiteit werd getoond in Fig. 3c, de fluorescentie-intensiteit nam toe met toenemende antigeenconcentratie, wat aangeeft dat QDs-IgG een hoge antilichaamactiviteit heeft.

een Verdeling van de hydrodynamische diameter van de QD's en QD's-geconjugeerde IgG (geiten-anti-muis). (een ) Diameters van QD's en (b ) QDs-geconjugeerd IgG (geit-anti-muis). De gemiddelde diameter van de QD's is 64,87 nm en die van QDs-IgG is 211,4 nm, gedetecteerd door DLS. b Fluorescentiespectra van QD's-IgG (geit-anti-muis), QD's en conserveringsbuffer (2,5 mM BS, pH   8,0, 0,1% BSA). De QDs-IgG-fluorescentie-emissiepiek was dezelfde als die van de QD's, wat aangeeft dat de koppeling van IgG aan QD's de optische kenmerken van de QD's niet veranderde. c ELISA-methode om de antilichaamresistentie van QDs-IgG (geiten-anti-muis) te detecteren, het PVDF-membraan werd beoordeeld met UV

In deze sectie wordt uitgelegd hoe u deze groep complexen in FCM kunt gebruiken. Zoals hierboven vermeld, kunnen we veel soorten antigenen detecteren, zoals kleine eiwitten, virussen en cytokinen [18], en we gebruikten het HSP27-eiwit als voorbeeld, laten we het proces nu in detail bespreken. HSP27 bevindt zich in het cytoplasma en wordt in grote hoeveelheden uitgescheiden in tumorcellen, vooral bij longkanker, pancreaskanker, urine-epitheelkanker, nierkanker, borstkanker en melanoom huidkanker. Aangezien een klein deel van HSP27 extracellulair wordt uitgescheiden, moeten we de cel lyseren om het eiwit te extraheren. In dit experiment selecteerden we twee cellijnen, MCF-7 (menselijke borstkankercellen) als testgroep en L02 (normale menselijke levercellen) als controlegroep. De cellen werden gelyseerd om de intracellulaire eiwitten te extraheren. De totale eiwitten werden verzameld, vervolgens werden anti-HSP27 van konijnen en anti-HSP27 van muizen toegevoegd volgens de eiwitconcentratie, gevolgd door incubatie bij 37°C gedurende 50 min. Vervolgens werd N-PAMAM-IgG aan het mengsel toegevoegd, het mengsel werd 30 min bij 37°C geïncubeerd en vervolgens in twee gelijke groepen verdeeld:een testgroep en een PAMAM-groep. Ten slotte werd QDs-IgG aan de testgroep toegevoegd en 30 min in het donker bij 37°C geïncubeerd. Figuur 4 toont de fluorescentieanalyse voor de twee groepen cellen door middel van flowcytometrie. De fluorescentie-intensiteit van de testcurve was veel hoger dan die van de PAMAM-curve in de MCF-7-groep, terwijl in de L02-groep de twee curven elkaar bijna overlappen. Wanneer HSP27 voorkomt in celextracten, zullen N-PAMAM-IgG en QDs-IgG indirect aan elkaar binden om een ​​sandwichcombinatie te vormen in de aanwezigheid van konijnen-anti-HSP27 en muizen-anti-HSP27. Als HSP27 niet bestaat, zal slechts een kleine hoeveelheid QDs-IgG door niet-specifieke adsorptie aan N-PAMAM-IgG binden. Daarom, als de fluorescentie-intensiteit van de testcurve hoger is dan die van de controle PAMAM-curve, is HSP27 in het monster aanwezig. Figuur 4 laat zien dat MCF-7-cellen meer HSP27-eiwit afscheiden dan L02-cellen.

Fluorescentie-analyse van HSP27 door flowcytometrie. een L02 cellen. b MCF-7-cellen. De testgroep werd geïncubeerd met N-PAMAM-IgG en QDs-IgG, PAMAM-groep als de controle, die alleen werd geïncubeerd met N-PAMAM-IgG om een ​​pseudocel te vormen voor micromolecuul-eiwit gedetecteerd door FCM. Wanneer de twee curven elkaar bijna overlappen, kan worden vastgesteld dat er geen HSP27 in het monster zit; daarom, of QDs-IgG wordt toegevoegd of niet, de fluorescentie-intensiteit zal niet veranderen

Zoals hierboven vermeld, kunnen deze complexen uitgescheiden intracellulaire eiwitten detecteren door FCM; in principe kunnen deze complexen op elk soort antigeen worden toegepast. Bovendien kunnen de twee delen van de combinatie afzonderlijk worden gebruikt. Als het antigeen dat we willen detecteren zich in de cel of op het celoppervlak bevindt, kunnen we alleen het deel van de QD's gebruiken. β-actine is bijvoorbeeld een van de belangrijkste componenten van het cytoskelet dat zich in cellen bevindt en komt veel voor in eukaryote cellen. Figuur 5a toont dat de fluorescentieanalyse alleen QD-deel gebruikte voor β-actine in HeLa-cellen door FCM. HeLa-cellen werden gewassen en behandeld met methanol om de penetratie van het celmembraan te verbeteren en vervolgens verdeeld in twee gelijke groepen. De β-actine-groep werd gedurende 30 min bij 37 ° C geïncubeerd met anti-β-actine van de muis en de controlegroep werd geïncubeerd met BSA. Na wassen met PBS werden beide groepen gedurende 30 minuten bij 37 ° C geïncubeerd met QDs-IgG (geiten-anti-muis). Na tweemaal wassen met PBS werden beide groepen gedetecteerd met FCM. De fluorescentie-intensiteit van de β-actinecurve was veel hoger dan die van de controlecurve, wat aangaf dat de HeLa-cellen het β-actine-eiwit bevatten.

een Fluorescentie-analyse voor β-actine in HeLa-cellen. De β-actinegroep werd geïncubeerd met muis-anti-β-actine en QDs-IgG (geit-anti-muis), en de controlegroep werd geïncubeerd met BSA en QDs-IgG. De controlegroep kan zorgen voor de uitsluiting van de achtergrondfluorescentie veroorzaakt door de niet-specifieke adsorptie van QDs-IgG. b Fluorescentiemicroscoopbeelden van HeLa-cellen onder UV-vis bestraling. DAPI kleurde de celkernen en straalde blauwe fluorescentie uit; QDs-IgG indirect gecombineerd met β-actine en uitgezonden rode fluorescentie. Schaalbalk 20 μm

Daarnaast kunnen deze complexen ook worden toegepast op ICC. Voor ICC is het echter vereist dat het doelantigeen zich in de cel of op het celoppervlak bevindt en in grote hoeveelheden aanwezig is [19]; anders zal het experimentele doelwit moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond. We namen bijvoorbeeld het β-actine-eiwit en zaaiden HeLa-cellen in een celplaat van 10  cm en plaatsten er een dekglaasje aan van een microscoop, gebruiken methanol om cellen te immobiliseren. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met muis-anti-β-actine (PBS, 1% BSA) bij 37 ° C gedurende 1 uur, tweemaal gewassen met PBST en geïncubeerd met QDs-IgG (geiten-antimuis) bij 37 ° C in de 1 u donker. Na twee keer wassen met PBST en het kleuren van de celkern met DAPI, werd de fluorescentie gedetecteerd met een fluorescentiemicroscoop [20, 21]. Figuur 5b toont de fluorescentiemicroscoopbeelden van de HeLa-cellen. Het voordeel van QD's als fluorescerende kleurstof is dat het signaal van de QD's en het DAPI-signaal gelijktijdig kunnen worden waargenomen onder de bestraling van het ultraviolette kanaal; daarom kan volgens de kern het doelwit duidelijk worden gelokaliseerd. In dit experiment is β-actine cytoskeleteiwitten rond de celkern en kan duidelijk worden waargenomen.