pH- en akoestisch-responsieve platforms op basis van perfluorpentaan-geladen eiwitnanodeeltjes voor ovariële tumor-gerichte echografie en therapie

Abstract

In deze studie hebben we een multifunctioneel therapeutisch middel voor ultrageluid (VS) ontwikkeld dat perfluorpentaan (PFP) inkapselt in ferritine (FRT) en het tumorgerichte molecuul foliumzuur (FA) (FA-FRT-PFP) conjugeert. De bereide FA-FRT-PFP had een gemiddelde deeltjesdiameter van 42,8 ± 2,5 nm, een zeta-potentiaal van -41,1 ± 1,7 mV en vertoont een goede stabiliteit in fysiologische oplossing en temperaturen. FRT is een pH-gevoelig kooi-eiwit dat bij pH 5,0 uiteenvalt om poriën te vormen die PFP kunnen laden. De aanpassing aan neutrale pH sluit de poriën en kapselt de PFP in de FRT in om nanodeeltjes te vormen. Bij pH 5,0, 3 min gefocusseerde ultrageluid met lage intensiteit (LIFU, 2 W/cm² ) aanzienlijk verbeterd het Amerikaanse signaal van FA-FRT-PFP door het akoestische druppelverdamping (ADV) effect. Onder identieke omstandigheden zorgde 4 min LIFU-bestraling ervoor dat de door FA-FRT-PFP gegenereerde bellen braken. FA-FRT-PFP kan efficiënt worden gericht op eierstokkankercellen en het Amerikaanse contrast van FA-FRT-PFP na 3 minuten LIFU-bestraling aanzienlijk verbeteren. Na 4 minuten LIFU-bestraling nam de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk af als gevolg van necrose, waarschijnlijk als gevolg van de FA-FRT-PFP-gemedieerde afgifte van PFP in de zure omgeving van lysosomen na binnenkomst in de tumorcellen. PFP wordt vervolgens omgezet in bellen die barsten onder LIFU-bestraling, waardoor fysieke schokgolven worden gevormd die leiden tot de vernietiging van de celstructuur en necrose, waardoor tumorbehandeling wordt bereikt. Alles bij elkaar genomen toont dit aan dat FA-FRT-PFP zowel een nieuw als veelbelovend theranostisch middel in de VS is voor toekomstige klinische toepassingen.

Inleiding

Eierstokkanker is wereldwijd een van de meest dodelijke vormen van kanker bij vrouwen [1,2,3]. De behandeling van eierstokkanker blijft klinisch afhankelijk van bestralingstherapie, chemotherapie, chirurgie en andere aanvullende therapieën [4,5,6]. Echter, tekortkomingen in deze strategieën blijven verbeteringen in de overlevingskansen van patiënten belemmeren. Om deze tekortkomingen te verhelpen, zijn effectievere en veiligere diagnostische methoden nodig. In de afgelopen jaren is de integratie van beeldvorming en therapieën in een enkel behandelingsplatform naar voren gekomen als een hot topic [7,8,9].

Echografie (VS)-technologie wordt vanwege zijn niet-invasieve, niet-radiatieve, goedkope en specifieke kenmerken veel gebruikt bij klinische diagnose en tumorbehandelingen [10,11,12]. In de afgelopen decennia is een akoestisch responsplatform (ARP) met Amerikaanse beeldvormings- en therapeutische mogelijkheden ontwikkeld voor effectieve tumordiagnose en -behandeling [13,14,15,16]. ARP omvat voornamelijk microbellen of nanobellen (MB of NB) en op nanodeeltjes (NP) gebaseerde platforms [16, 17]. Van deze ARP's vertonen MB of NB goede akoestische responsmogelijkheden, maar vanwege hun grote omvang is de in vivo weefselpenetratie zwak en is de monsterstabiliteit slecht. NP vertoont een sterkere weefselpermeabiliteit en een langere farmacokinetische cyclus vanwege zijn kleine formaat. De akoestische responsmogelijkheden van NP's zijn echter beperkt. Het is daarom dringend noodzakelijk om ARP's van klein formaat te ontwerpen, met een hoge stabiliteit en een sterk reactievermogen.

Vloeibare fluorkoolstoffen ondergaan een gasfaseovergang in de vloeibare fase als reactie op externe stimulatie [18, 19]. Natalya en collega's ontwikkelden een nano-emulsie met vloeibare fluorkoolstof die akoestische druppelverdamping (ADV) effecten produceerde onder gefocusseerde ultrageluid met lage intensiteit (LIFU) [20,21,22]. De emulsies vormden bellen en zorgden tegelijkertijd voor de afgifte van het geneesmiddel, waardoor tumorbehandeling mogelijk werd. Een laag afdichtingsmateriaal gewikkeld rond de vloeibare fluorkoolstof leidde echter tot een toename van de intensiteit en tijd van het ultrageluid dat nodig is voor tumorbehandeling, wat resulteerde in schade aan het omliggende gezonde weefsel. Verdere optimalisatie van de vloeibare fluorkoolstofdrager is daarom op aanvraag.

In deze studie ontwikkelden we een ferritine (FRT) nanodeeltje geladen met vloeibaar fluorkoolstofperfluorpentaan (PFP) dat verder werd gecombineerd met het tumordoelmolecuul foliumzuur (FA) om FA-FRT-PFP te vormen. Ferritine is een zeer biocompatibel endogeen nanocage-eiwit dat pH-gevoeligheid vertoont [23,24,25]. Het eiwit kan in een zure omgeving uiteenvallen en in een alkalische omgeving weer worden opgebouwd. Dit maakt het gecontroleerd laden en vrijkomen van ferritine mogelijk als reactie op pH-veranderingen [26,27,28]. PFP is een veelgebruikt fasetransformatiemateriaal met een kooktemperatuur van 29 ^o C. De lage kooktemperatuur vergemakkelijkte de gemakkelijke fase-transformatie door LIFU die veiliger was dan HIFU. De PFP werd geladen in ferritine en de resulterende FA-FRT-PFP had een diameter van ~ -47,3 ± 2,8 nm met hoge stabiliteit bij fysiologische oplossingen en temperaturen. Volgens de resultaten had FA-FRT-PFP de volgende voordelen:(1) PFP kon gemakkelijk in FRT worden geladen door de pH van zuur naar neutraal te veranderen; (2) onder gerichte echografie met lage intensiteit (LIFU, 2 W/cm² , 3 min) en pH =5,0, FA-FRT-PFP geeft PFP af en ondergaat faseveranderingen om Amerikaanse beeldvormingssignalen te verbeteren door middel van akoestische druppelverdamping (ADV); 3) Bij langdurige LIFU-bestraling (4 min) en pH =5,0 explodeerde de PFP die vrijkwam uit FA-FRT-PFP en produceerde een fysieke schokgolf die tumorcellen effectief kon vernietigen door middel van necrose. Voor zover wij weten, is dit het eerste voorbeeld van het laden van PFP in FRT als een Amerikaanse tumortheranostica. Deze resultaten geven aan dat FA-FRT-PFP + LIFU een nieuwe strategie is voor geïntegreerde tumordiagnose en -behandeling.

Materialen en methoden

Materialen

Agarosegel, ferritine (FRT), foliumzuur (FA) en perfluorpentaan (C₃ F₈ , PFP) werden gekocht bij Sigma (St. Louis, MO, VS). NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA en NH₂ -PEG₂₀₀₀ -COOH werden geleverd door Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China). 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) werden gekocht bij Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, VS). Celtelkit-8 (CCK-8) werd verkregen van Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan). Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), penicilline-streptomycine, trypsine-EDTA en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht bij Gibco (Grand Island, NY, VS).

Celcultuur

Menselijke eierstokkankercellijn SK-OV-3 werd geleverd door het Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences. Normale ovariumepitheelcellen HUM-CELL-0088 werden verkregen van PriCells, Wuhan, China. De cellen werden gekweekt in DMEM-media die 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing bevatten. De cellen werden in een incubator gehouden met een bevochtigde atmosfeer die 5% CO₂ . bevatte bij 37°C.

Voorbereiding van FA-FRT-PFP

Ten eerste werd doelmolecuul FA geconjugeerd met FRT via de veresteringsreactie [29]. Kortom, NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA (10 mg) en FRT-oplossing werden gemengd met de aanwezigheid van EDC (5 mg/mL) en NHS (20 mg/mL). Na een reactie van 3 uur bij kamertemperatuur onder licht roeren, werd het mengsel gedurende 24 uur gezuiverd door dialyse tegen gedestilleerd water (MW-grenswaarde =1,2 kDa). De resulterende oplossing was FA-FRT nanodeeltjes. Ten tweede werd het laden van PFP in de holte van FRT bereid met het proces van denaturatie en renaturatie van eiwit [30]. In het kort, FA-FRT werd verdund in 5 ml PBS tot 2 mg/ml en ingesteld op pH =5,0 met 30 min licht roeren bij kamertemperatuur om volledige dissociatie van de FRT te verzekeren. Daarna werd 500 l PFP in een ijsbad aan de oplossing toegevoegd en onderworpen aan pulssonificatie met 5 seconden aan en 5 seconden pauze in totaal 5 minuten bij 80 W in een ijsbad. Na de sonicatie werd de pH-waarde van het mengsel op neutraal ingesteld (pH =7,4). Omdat PBB in oliestaat was en onoplosbaar in water, werd de overmatige PBB gemakkelijk verwijderd door vloeistofscheiding om FA-FRT-PFP te worden. FRT-PFP werd bereid met een vergelijkbare methode, behalve voor het wijzigen van NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA naar NH₂ -PEG₂₀₀₀ -COOH.

Karakterisering van FA-FRT-PFP

De afmetingen en zeta-potentialen van de nanodeeltjes werden getest door een Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, VK). De morfologie van FA-FRT-PFP werd waargenomen door elektronische transmissiemicroscopie (TEM, Hitachi, Japan) en omgekeerde fluorescentiemicroscopie (Olympus, Japan). De chemische structuur van de nanodeeltjes werd gedetecteerd door een Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Duitsland). De cellulaire opname van de FA-FRT-PFP werd gedetecteerd door confocale laser scanning microscopie (LEXT OLS4100, Olympus, Japan). De FITC / PI-cellen met dubbele kleuring werden geanalyseerd met flowcytometrie (BD, Franklin Lakes, NJ, VS).

De prestaties van pH- en ultrasone responsieve gasgenerering

FA-FRT-PFP in pH =5,0 en 7,5 toestand werden bestraald met verschillende akoestische intensiteit van LIFU (1,5 en 2,0 W/cm² ) en gedurende verschillende totale tijdsperioden (1, 2, 3 en 4 min) in het agarosegelmodel, werden Amerikaanse beelden waargenomen door Amerikaanse apparatuur (Esaote Mylab 90, Italië) met een frequentie van 5-12 MHz en mechanische index ( MI) van 0,06. Daarna werd het uiterlijk van FA-FRT-PFP in de tijd waargenomen met lichtmicroscopie. De Amerikaanse intensiteit van het interessegebied in het Amerikaanse beeld werd geanalyseerd door ImageJ-software.

Cellulaire opname

In het kort werd 1 mg FITC opgelost in 1 ml DMSO en vervolgens gemengd met FRT-PFP en FA-FRT-PFP gedurende 30 minuten onder zacht schudden. Vervolgens werd de gemengde oplossing een nacht in gedeïoniseerd water gedialyseerd om vrije FITC en DMSO te verwijderen om FITC-gelabelde nanodeeltjes te verkrijgen. Vervolgens werden SK-OV-3 en normale eierstokcellen (HUM-CELL-0088) cellen 24 uur in het medium gekweekt en vervolgens werden vrije FITC, FITC-gelabelde FRT-PFP en FA-FRT-PFP samen geïncubeerd met SK-OV-3 cellen gedurende 5 uur. Bovendien werd FITC-gelabelde FA-FRT-PFP gedurende 5 uur geïncubeerd met FA-voorbehandelde SK-OV-3-cellen. De cellen werden 3 keer gewassen met PBS en gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gekleurd met 0, 2 mg / ml DAPI-oplossing gedurende 10 minuten. Cellen werden afgebeeld door confocale laser scanning microscopie om fluorescerende beelden vast te leggen. Het fluorescentiesignaal werd gekwantificeerd door een flowcytometer.

Ultrasone beeldvorming in vitro

SK-OV-3-cellen werden 24 uur gekweekt in FA-vrij medium en vervolgens werden PBS, FRT-PFP en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA geïncubeerd met de SK-OV-3-cellen voor 6 u. De cellen werden verzameld en gemengd met agarosegel, en vervolgens werden de cellen bestraald met of zonder LIFU gedurende 3 min (1 s aan en 1 s pauze in totaal 3 min; 1 MHz; 2,0 W/cm2 ). Eindelijk werden er Amerikaanse beelden gemaakt.

In vitro werkzaamheid tegen kanker

SK-OV-3-cellen werden gezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/putje, en men liet het gedurende 24 uur hechten. Voor de cytotoxiciteit van FA-FRT werden verschillende concentraties (0, 20, 40, 100, 200 en 500 g/mL) FA-FRT gekweekt met SK-OV-3-cellen. Na 24 uur behandeling werden de cellen gedurende 20 minuten in een incubator behandeld met DMEM-media die 10% CCK-8 bevatten. De absorptie van de cellen bij een golflengte van 450 nm werd gedetecteerd door een Multimode Plate Reader (Thermo Scientific) om de levensvatbaarheid van de cellen te karakteriseren. Bovendien werden de SK-OV-3-cellen en normale eierstokcellen (HUM-CELL-0088) gedurende 3 uur behandeld met PBS, FRT-PFP en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA en werden daarna bestraald door LIFU (1 s met een pauze van 1 s voor in totaal 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm² ). De behandelde cellen werden nog 21 uur geïncubeerd. Als controle werden de cellen zonder LIFU gedurende 24 uur behandeld met PBS, FRT-PFP en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA. Daarna werd de levensvatbaarheid van de behandelde cellen gedetecteerd met de CCK-8-assay.

Analyse van celdood

Om het type celdood te beoordelen, werden SK-OV-3-cellen gezaaid in platen met 6 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/ml. Na 24 uur werden de cellen gedurende 3 uur behandeld met PBS, FRT-PFP en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA en vervolgens bestraald met LIFU (1 s, 1 s gepauzeerd voor een totaal van 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm² ). De behandelde cellen werden nog eens 23 uur geïncubeerd. Als controle werden cellen gedurende 24 uur in afwezigheid van LIFU behandeld met PBS, FRT-PFP en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA. De cellen werden getrypsiniseerd, gecentrifugeerd bij 1500×g gedurende 3 minuten, 3 keer gewassen met ijskoude PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 200 ml bindingsbuffer. Daarna werden 5 L annexine V-FITC en 10 μL PI toegevoegd en gedurende 15 minuten in het donker met de cellen geïncubeerd. De gekleurde cellen werden geanalyseerd met behulp van een flowcytometer.

Western Blotting

De western blotting werd uitgevoerd volgens eerdere literatuur. De cellen werden behandeld met 40 g/ml PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA en FA-FRT-PFP gecombineerd met of zonder LIFU-bestraling (2,0 W/cm² sup> , 4 min) en een verdere incubatie van 21 uur. En vervolgens werden de behandelde cellen gelyseerd in RIPA-buffer (Sigma). Vijftig microgram van elk eiwit met Laemmli-monsterbuffer werd 5 minuten gekookt en onderworpen aan SDS-PAGE. De eiwitten werden overgebracht op PVDF-membraan (Bio-Rad Laboratories) met behulp van halfdroge Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories). Blots werden eerst geïncubeerd in TBS-blokkerende buffer met 2% melk of 2% BSA (voor fosfo-specifieke antilichamen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens met de respectieve primaire antilichamen verdund in TBST (met 0,1% Tween20 en 2% BSA) overnacht bij 4 °C. Vervolgens werden blots gewassen en geïncubeerd met geschikte secundaire antilichamen (Santa Cruz) in TBST en gedetecteerd met SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo).

Statistische analyse

Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van Student's t-test. *P <0,05, **P <0,01 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP werd gesynthetiseerd en gebruikt voor tumortherapie (Fig. 1). Fase-transformatiedruppeltjes werden in FRT geladen door de pH-geïnduceerde omkeerbare demontage en hermontage van FRT. De PFP met LIFU-geïnduceerde akoestische druppelverdamping (ADV) werd in cellen afgeleverd en fungeerde als een ultrasoon beeldvormend middel. Figuur 2a-c toont TEM-afbeeldingen van FRT, FRT-PFP en FA-FRT-PFP, die een bolvormige morfologie hadden. De gemiddelde deeltjesgrootten van FRT, FRT-PFP en FA-FRT-PFP waren respectievelijk 6,9 ± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm en 47,3 ± 2,8 nm (Fig. 2d), wat aantoont dat PFP-lading en FA-conjugatie de grootte van FRT. Het gemiddelde zeta-potentieel van FRT en FA-FRT-PFP waren respectievelijk -43,2 ± 3,1 mV, -46,9 ± 2,2 mV en -41,5 ± 2,7 mV (Fig. 2e). Bovendien werd de conjugatie van FA met FRT gekenmerkt door FT-IR zoals weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S1. Het FT-IR-spectrum vertoonde absorptiebanden bij ~ 1110 cm⁻¹ kan overeenkomen met de vibrationele C–O–C etherbinding van PEG; absorptiepieken bij ~ 1601 cm⁻¹ en ~ 1710 cm⁻¹ behoren tot vibrationele C=O bindingen van PEG en FRT evenals van –COOH en –CONH₂ van FA en FRT; de banden op ~ 2820 cm⁻¹ , ~ 2920 cm⁻¹ , en ~ 2950 cm⁻¹ komen overeen met asymmetrische en symmetrische C–H-rektrillingen van –CH₂ van FA en PEG; absorptiepieken bij ~ 1440 cm⁻¹ zijn geassocieerd met de fenylring van FA. Het resultaat bevestigt de succesvolle conjugatie van FA met FRT. Gedurende de opslagperiode van 28 dagen bleven de grootte en PDI van FA-FRT-PFP in water, PBS, zoutoplossing en FBS geen significante verandering (Fig. 3a, b), wat aangeeft dat FA-FRT-PFP uitstekende stabiliteit vertoont. Afbeelding 3c toont de grootteverandering van FA-FRT-PFP bij verschillende temperaturen variërend van 25 ^o C tot 45 ^o C. De grootte van FA-FRT-PFP was vrijwel onveranderd toen de temperatuur werd verlaagd tot 25-40 °C, wat aangeeft dat FA-FRT-PFP een hoge stabiliteit vertoont onder 40 ^o C. Toen de temperatuur 45 °C bereikte, varieerde de grootte van FA-FRT-PFP van 42,1 nm tot 6 nm, waarschijnlijk als gevolg van het feit dat de PFP in FA-FRT-PFP ernstige vergassing onderging, wat leidde tot breuk van de nanodeeltjes. De vergassingstemperatuur van FA-FRT-PFP steeg van 29 ^o C (vergassingstemperatuur van PBB onder normale druk) tot 45 ^o C, waarschijnlijk vanwege de dekking van de FRT-shell [21, 31,32,33].

Schematische weergave van de synthese van FA-FRT-PFP en de toepassing ervan in tumortheranostica

een –c TEM-afbeeldingen van FRT, FRT-PFP en FA-FRT-PFP. d , e De grootte en zeta-potentiaalverdeling van FRT, FRT-PFP en FA-FRT-PFP

een , b Grootte en PDI-verandering van FA-FRT-PFP in water, PBS, zoutoplossing en FBS gedurende 28 dagen. c De grootteverandering van FA-FRT-PFP bij verschillende temperaturen van 25 ^o C tot 45 ^o C

pH- en LIFU-responsieve VS-verbetering

Amerikaanse fantoomexperimenten van FA-FRT-PFP werden uitgevoerd bij verschillende pH-waarden en LIFU-vermogensintensiteit. Zoals getoond in Fig. 4a, was het US-signaal in alle groepen zwak in de afwezigheid van LIFU-bestraling (pre). Bij pH 7,5 na 3 min LIFU-bestraling vertoonde FA-FRT-PFP een laag US-signaal zowel bij 1,5 als bij 2,0 W/cm² , terwijl bij pH =5,0 onder dezelfde LIFU-bestralingstijd, FA-FRT-PFP een sterkere Amerikaanse signaalintensiteit had. Dit toonde aan dat de FA-FRT-PFP tijd- en akoestische intensiteitsafhankelijke ADV-effecten vertoonde. Dit was omdat, bij pH =5,0, FA-FRT-PFP demonteerde en PFP vrijmaakte, waardoor het gemakkelijker werd om fasetransformatie te ondergaan. Interessant is dat wanneer de LIFU-bestralingstijd werd verlengd tot 4 min, FA-FRT-PFP bij pH =5,0 en 2,0 W/cm² van LIFU had een zwakkere signaalintensiteit in de VS in vergelijking met die bij een lagere bestralingstijd, waarschijnlijk als gevolg van het feit dat de LIFU bij deze toestand te sterk is waardoor de bellen scheuren. Deze resultaten toonden aan dat de FA-FRT-PFP PFP kan afgeven, waardoor fasetransformaties en explosies worden gegenereerd bij 2,0 W/cm² van LIFU-bestraling bij pH =5,0. De resultaten van de Amerikaanse intensiteit worden getoond in Fig. 4b, c. Afbeelding 4d–g toont de morfologie van FA-FRT-PFP-oplossingen na 3 min LIFU-bestraling (2,0 W/cm² ) en bij pH =7,5 en 5,0. FA-FRT-PFP bij pH =5,0 en 2,0 W/cm² LIFU genereerde grote bellen, wat onze bevindingen verder valideerde.

een Amerikaanse afbeeldingen van FA-FRT-PFP gemengd met agarosegel bij verschillende pH-waarden en bestraald met verschillende LIFU-vermogensintensiteit. b , c De bijbehorende statistische gegevens van het Amerikaanse signaal in a . d –g De optische microscopiebeelden van FA-FRT-PFP gemengd met agarosegel bij verschillende pH-waarden en bestraald met 2,0 W/cm² gedurende 3 minuten

Celopname

Figuur 5 toont de cellulaire opnamecapaciteit van FA-FRT-PFP. Vrije FITC-behandelde cellen vertoonden verwaarloosbare fluorescentie, maar na labeling op FA-FRT-PFP was een sterk fluorescentiesignaal duidelijk, wat aangeeft dat FA-FRT-PFP een sterke cellulaire opnamecapaciteit heeft. Met FRT-PFP behandelde en met FA-FRT-PFP behandelde cellen die vooraf waren geïncubeerd met FA vertoonden een zwakkere FITC-fluorescentie. Dit toonde verder aan dat FA de actieve targeting van nanodeeltjes verbetert. Bovendien vertoonde FA-FRT-PFP een vergelijkbaar opnamegedrag als FCM (Fig. 5c, d). De opnamesnelheden van FA-FRT-PFP waren 46,5 ± 2,8%, wat significant hoger was dan die van vrij FITC (controle), FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA. Verder toont aanvullend bestand 1:figuur S2 de cellulaire opname van nanodeeltjes in normale eierstokcellen. Er zijn geen significante verschillen tussen FRT-PFP-, FA-FRT-PFP + FA- en FA-FRT-PFP-groepen in cellulaire opname. Dit komt waarschijnlijk doordat de normale eierstokcellen (HUM-CELL-0088) een lage FA-receptorexpressie hebben in vergelijking met SK-OV-3-cellen.

Cellulaire opname. een , b De confocale fluorescentiebeelden van cellen die zijn behandeld met gratis FITC en FITC-gelabelde FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA en FA-FRT-PFP. Groene en blauwe kleuren vertegenwoordigden respectievelijk FITC- en DAPI-fluorescentie. Schaalbalk =25 m. c , d Het FITC-fluorescentiesignaal en de bijbehorende statistische gegevens in cellen die zijn behandeld met gratis FITC en FITC-gelabelde FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA en FA-FRT-PFP

In vitro echografie

Om te bevestigen dat FA-FRT-PFP de ultrasone beeldvorming door ADV in vitro verbetert, werden nanodeeltjes gedurende 5 uur met de cellen geïncubeerd en bestraald met of zonder LIFU (2,0 W/cm² ). Zoals getoond in Fig. 6a vertoonden cellen in alle geteste groepen in afwezigheid van LIFU-bestraling geen verbeterde ultrasone signalen, terwijl na LIFU-bestraling, met FA-FRT-PFP behandelde cellen hoge Amerikaanse intensiteiten vertoonden vergeleken met controle FRT-PFP en FA-FRT -PFP + FA-groepen, respectievelijk. Voor echografie werd kwantitatieve analyse van de grijswaarden berekend met behulp van ImageJ-software. De resultaten waren consistent met de Amerikaanse beeldvormingsgegevens (Fig. 6b) die aantoonden dat de Amerikaanse intensiteit van met FA-FRT-PFP behandelde cellen was verbeterd na bestraling met LIFU bij 2,0 W/cm² gedurende 3 minuten. FA-FRT-PFP komt cellen binnen en wordt in de zure omgeving van lysosomen (pH =~ 5.0) gedemonteerd en PFP afgegeven in het cytoplasma [34, 35]. Na LIFU-bestraling genereerde de PFP gemakkelijk fasetransformaties van druppeltjes naar gas, wat de intensiteit van de VS verhoogde.

Echografie beeldvorming in vitro. een De echobeelden en de bijbehorende statistische gegevens (b ) van PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA en FA-FRT-PFP-behandelde cellen met of zonder LIFU-bestraling (2,0 W/cm² , 3 min)

In vitro analyse van de werkzaamheid van kanker en celdood

Figuur 7a toont de cytotoxiciteit van FA-FRT-PFP bij concentraties tot 0,5 mg/mL. In afwezigheid van LIFU-bestraling vertoonde FA-FRT-PFP geen duidelijke onderdrukking van de levensvatbaarheid in SK-OV-3-cellen. CCK-8-assays werden gebruikt om de werkzaamheid tegen kanker van FA-FRT-PFP in combinatie met LIFU te analyseren. Zoals getoond in Fig. 7b vertoonden FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA en FA-FRT-PFP in afwezigheid van LIFU-bestraling geen opmerkelijke cytotoxiciteit in vergelijking met controlegroepen. In combinatie met 4 min LIFU-bestraling vertoonde FA-FRT-PFP een significante cytotoxiciteit die hoger was dan die van FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, met piekcelremmingspercentages die 90% naderden bij 40 μg/ml. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat FA-FRT-PFP gemakkelijker wordt opgenomen in het cytoplasma en vervolgens in lysosomen in vergelijking met FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. In de zure omgeving van lysosomen gaf FA-FRT-PFP PFP vrij in het cytoplasma. Onder 4 minuten LIFU-bestraling vergast de vrijgekomen PFP, wat cavitatie en scheuren veroorzaakte, waardoor een reeks fysieke schokkrachten werd gegenereerd die de dodende effecten van de tumoren aanzienlijk versterkten [36,37,38]. Bovendien toont aanvullend bestand 1:figuur S3 de cytotoxiciteit van nanodeeltjes in normale eierstokcellen. Er zijn geen significante verschillen tussen FRT-PFP-, FA-FRT-PFP + FA- en FA-FRT-PFP-groepen in cytotoxiciteit wanneer ze worden gecombineerd met LIFU. Het resultaat kan zijn omdat HUM-CELL-0088-cellen een lage FA-receptorexpressie hebben die geen FA-targeting-effect vertoonde.

In vitro werkzaamheid tegen kanker. een Levensvatbaarheid van de cellen van SK-OV-3-cellen na 24 uur incubatie met verschillende concentraties FA-FRT-PFP. b Levensvatbaarheid van de cellen van SK-OV-3-cellen behandeld met 40 μg/ml PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA en FA-FRT-PFP gecombineerd met of zonder LIFU-bestraling (2,0 W/cm ² , 4 min) en verdere incubatie van 21 uur

Zoals getoond in Fig. 8a, b, vertoonden cellen in afwezigheid van LIFU-bestraling minimale celdood in alle groepen. Na 4 minuten LIFU-bestraling vertoonden met FA-FRT-PFP behandelde cellen significante necrose (~ 91,6%) in vergelijking met andere groepen vanwege de fysieke schokgolven die werden gegenereerd door LIFP-geïnduceerde PFP-cavitatie of bellenstralen. Verder toont aanvullend bestand 1:figuur S4 het TNF-eiwitexpressieniveau van cellen. Zonder LIFU brachten de cellen het TNF-eiwit nauwelijks tot expressie. Terwijl met LIFU de cellen in de FA-FRT-PFP-groep een hoog niveau van TNF-expressie hebben, vergeleken met die in FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA-groepen, wat aangeeft dat het TNF-eiwit een essentiële FA-FRT-PFP was + LIFU-geïnduceerd doodgerelateerd eiwit [39]. Op basis van het uitstekende in vitro effect van kankertherapie [40,41,42], is FA-FRT-PFP veelbelovend voor toekomstige kankertherapie in vivo.

een Flowcytometrie-analyse en de bijbehorende statistische gegevens van SK-OV-3-cellen behandeld met 40 g/mL PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA en FA-FRT-PFP gecombineerd met of zonder LIFU bestraling (2,0 W/cm² , 4 min) en verdere incubatie van 23 uur

Conclusie

Samenvattend hebben we met succes FRT-gebaseerde en PFP-geladen fasetransformatie-nanodeeltjes ontwikkeld die zijn gemodificeerd met een FA-doelmolecuul (FA-FRT-PFP). Als een nieuw gericht Amerikaans theranosticum had FA-FRT-PFP meerdere voordelen:(1) FA-FRT-PFP had een deeltjesgrootte op nanoschaal; (2) FRT werd gebruikt als drager, die kon demonteren en weer in elkaar zetten om PFP-druppels te uploaden en af te geven bij respectievelijk zure en neutrale omstandigheden; (3) onder 3 min LIFU-hulp en zure omstandigheden, gaf FA-FRT-PFP PFP vrij en genereerde fase-transformaties via ADV, wat het Amerikaanse contrast aanzienlijk zou kunnen verhogen; (4) onder 4 min bestraling door LIFU en een zure omgeving, zou de vrijgekomen PFP gemakkelijk een intracellulair "explosie-effect" kunnen veroorzaken, resulterend in fysieke antitumoreigenschappen. Deze resultaten tonen aan dat FA-FRT-PFP met LIFU-hulp een nieuwe strategie biedt voor ultrasone moleculaire beeldvorming en tumortherapie.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De conclusies in dit manuscript zijn gebaseerd op de gegevens die allemaal in dit artikel worden gepresenteerd en getoond.

Afkortingen

ADV:: Akoestische druppelverdamping
ARP:: Akoestisch responsplatform.
CCK-8:: Celtelkit-8
EDC:: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
FA:: Foliumzuur
FBS:: Foetaal runderserum
FITC:: Fluoresceïne isothiocyanaat
FRT:: Ferritine
LIFU:: Gefocuste echografie met lage intensiteit
NHS:: N-hydroxysuccinimide
PFP:: Perfluorpentaan
VS:: Echografie

CuFe2O4/MoS2 gemengd-dimensionale heterostructuren met verbeterde gasdetectierespons Analoog schakelen en kunstmatig synaptisch gedrag van Ag/SiOx:Ag/TiOx/p++-Si Memristor-apparaat

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal