Beschermende effecten van koolstofstippen afgeleid van Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata tegen deinagkistrodon acutus Door gif geïnduceerd acuut nierletsel

Abstract

Achtergrond

Als een opkomend nanomateriaal hebben koolstofdots (cd's) enorm veel aandacht gekregen voor biomedische toepassingen. Er is echter weinig informatie beschikbaar over hun biologische activiteit bij het remmen van acuut nierletsel (AKI) veroorzaakt door slangengif.

Methoden

Deze studie rapporteert de ontwikkeling van een groen, eenstaps pyrolyseproces om cd's te synthetiseren met Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) als de enige voorloper, en hun mogelijke toepassing als een beschermer tegen Deinagkistrodon acutus (D. acutus) gif-geïnduceerde AKI werd voor het eerst onderzocht. Het AKI-model is tot stand gekomen door D. acutus gif in de buikholte van muizen en de mogelijke beschermende effecten van PCC Carbonisata-CD's (PCCC-CD's) op nierafwijkingen, waaronder disfunctie, ontstekingsreacties, weefselbeschadiging en trombocytopenie op zes tijdstippen (1, 3 en 12 uur, en 1, 2 en 5 dagen) werden onderzocht.

Resultaten

Deze resultaten toonden aan dat PCCC-CD's de nierdisfunctie significant remden (verlaagd serumcreatinine (SCR), bloedureumstikstof (BUN), urinair totaal eiwit (UTP) en microalbuminurie (MALB) concentraties) en de productie van chemoattractant (monocyt chemotactisch eiwit). 1 (MCP-1)), pro-inflammatoire cytokines (interleukine (IL)-1β) en anti-inflammatoire cytokine (IL-10) als reactie op intraperitoneale injectie van D. acutus venijn. Het gunstige effect van PCCC-CD's op de vergiftigde muizen was vergelijkbaar met dat op de verandering in nierhistologie en trombocytopenie.

Conclusies

Deze resultaten demonstreerden de opmerkelijke beschermende effecten van PCCC-CD's tegen AKI veroorzaakt door D. acutus gif, dat niet alleen de biomedische toepassingen van CD's zou verbreden, maar ook een potentieel doelwit zou vormen voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische geneesmiddelen voor AKI geïnduceerd door D. acutus slangenbeet envenomation.

Inleiding

Deinagkistrodon acutus (D. acutus) , behorend tot de familie Viperidae, wordt beschouwd als een van de gevaarlijkste terrestrische slangen in China [1]. Envenomation door D. acutus wordt geassocieerd met een reeks symptomen zoals bloedingen, trombocytopenie en mogelijke directe schade aan de nieren [2, 3]. Acuut nierletsel (AKI) is het ernstigste systemische effect en de meest voorkomende complicatie van envenomatie door D. acutus dat direct leidt tot aanhoudende nierdisfunctie en hoge morbiditeit [4, 5]. De huidige lokale behandeling omvat het gebruik van van paarden afgeleide hyperimmune antivenin als tegengif. De effectiviteit ervan is echter beperkt in het neutraliseren van lokale weefselschade, vooral bij het optreden van AKI, en heeft verschillende onbevredigende effecten zoals anafylactische en pyrogene reacties [6]. Bovendien dragen de relatief hoge kosten en de slechte stabiliteit van antivenine ook bij aan de onbevredigende behandeling van mensen die zijn gebeten door D. acutus , vooral in het wild of op het platteland [7,8,9]. Daarom is er dringend behoefte aan effectieve, veilige en betaalbare aanvullende geneesmiddelen voor de behandeling van D. acutus gif-geïnduceerde AKI.

Carbon dots (CD's), een nieuwe klasse koolstofnanomaterialen met een grootte < 10 nm, werden in 2004 bij toeval ontdekt door scheiding en zuivering van enkelwandige koolstofnanobuizen [10] en hebben het afgelopen decennium veel belangstelling getrokken vanwege hun opmerkelijke nieuwe eigenschappen zoals merkbare biocompatibiliteit, lage toxiciteit, hoge oplosbaarheid in water en overvloedige grondstoffen [11,12,13]. De komst van cd's heeft bijgedragen aan onderzoek naar de ontwikkeling van verschillende "slimme" nanosystemen, voornamelijk die voor bio-imaging [14], biomedicine [15], medicijnafgifte [16] en fotokatalyse [17].

Merk op dat de ontwikkeling van CD's met inherent bioactiviteitspotentieel veel strategieën biedt voor de ontdekking van een nieuwe generatie geneesmiddelen voor de effectieve controle of behandeling van sommige ziekten vanwege de opmerkelijke bovengenoemde voordelen. In verschillende biologische activiteiten, zoals antibacteriële voor de behandeling van bacteriële keratitis [18], zijn hemostatische [19], peroxidase-achtige [20], antikanker-, antivirale en ontstekingsremmende activiteiten [21] gemeld. Deze effecten hebben de aandacht van wetenschappers getrokken om aanvullende farmaceutische en biomedische toepassingen van cd's te bestuderen. Vooral de verlichtende werking van cd's die zijn afgeleid van Schizonepetae Spica Carbonisata [22] op D. acutus door gif geïnduceerde bloedingen hebben een nieuw perspectief gegeven op het onderzoek naar de gunstige effecten van CD's op AKI geïnduceerd door D. acutus slangenbeet, die tot nu toe minder werd begrepen.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC)-CD's worden gesynthetiseerd door directe pyrolyse van PCC (een type traditionele Chinese geneeskunde, dat al> 1000 jaar wordt gebruikt) met behulp van een eenstaps pyrolysebehandeling. PCCC-CD's zijn hypotoxische CD's met een diameter van 1,2 tot 4,8 nm. Van PCCC-CD's is gemeld dat ze opmerkelijke hemostatische effecten hebben, wat niet alleen de biomedische toepassing van CD's heeft verbreed, maar ook een pioniersrol heeft gespeeld bij het ophelderen van de hemostatische materiële basis van PCCC [23]. Merk op dat PCCC, een traditioneel Chinees medicijn bereid door houtskoolverwerking, voor het eerst werd opgenomen in de Taiping Holy Prescriptions for Universal Relief (978–992 AD, in China). Het veiligheidsprofiel en de bevredigende therapeutische werkzaamheid van PCCC, zoals hemostase en ontstekingsremmers, moedigden de voortdurende klinische toepassing ervan gedurende meer dan 1000 jaar aan, wat werd erkend in de Pharmacopoeia van de Volksrepubliek China (PPRC, 2015). De studie van aanvullende onderliggende biologische activiteiten van PCCC-CD's was echter een uitdaging. Er is vooral weinig informatie over de remming van AKI geïnduceerd door D. acutus envenomatie.

Bovendien is gemeld dat slangenbeetvergiftiging de nierfysiologie mogelijk rechtstreeks in gevaar brengt via de nefrotoxische componenten of door activering of modulatie van immuun- en ontstekingsmediatoren [24]. Deze effecten hebben voornamelijk betrekking op biomedische parameters [25] (serumcreatinine (SCR), bloedureumstikstof (BUN), concentratie van totaal eiwit in de urine (UTP) en microalbuminurie (MALB), inflammatoire cytokines (interleukine (IL)-1β), anti-inflammatoire cytokine (IL-10), en monocyt chemotactisch eiwit 1 (MCP-1), de verandering in renale histologie en aantal bloedplaatjes (PLT). In de huidige studie hebben we PCCC-CD's gesynthetiseerd met behulp van een groene, eenstaps pyrolysemethode en, voor de eerste keer, hun beschermende effecten onderzocht tegen de ontwikkeling van deze afwijkingen bij AKI veroorzaakt door intraperitoneale injectie van muizen met D. acutus gif.

Materiaal en methoden

Chemische stoffen

Het PCC-materiaal werd gekocht bij de Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, China) en het PCCC werd in ons laboratorium bereid. Dialysemembranen met een molecuulgewicht van 1000 Da werden gekocht bij Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, China). De celtelkit (CCK)-8 werd gekocht bij Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japan). Het gevriesdroogde slangengif van D. acutus werd geleverd door An Ren Snake Farm (Yujiang County, Yingtan, Jiangxi, China) voor experimenteel gebruik. Andere chemische reagentia van analytische kwaliteit werden verkregen van Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, China). MCP-1-, IL-10- en IL-1β-enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)-kits werden gekocht bij Cloud-Clone Crop. (Wuhan, China). Alle experimenten werden uitgevoerd met gedeïoniseerd water (DW).

Dieren

Diermanagement- en onderzoeksprotocollen werden ondersteund en goedgekeurd door de Institutionele Commissie voor Ethiek van Dierproeven van de Beijing University of Chinese Medicine. Mannelijke Kunming-muizen (met een gewicht van 30,0 ± 2,0 g) werden gekocht bij Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., met een conformiteitscertificaat voor proefdieren, en werden in kooien gehouden bij constante temperatuur en vochtigheid op een 12-uurs licht / donkere cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water.

Voorbereiding van gifoplossing

Gevriesdroogd gif werd 20 min onder milde menging opgelost in normale zoutoplossing (eindconcentratie:5 mg/ml) en bewaard bij -20 °C totdat het nodig was.

Voorbereiding van PCCC-CD's

De PCCC werd bereid met behulp van een eenstaps pyrolysemethode met PCC als de enige voorloper volgens eerdere methoden [23]. In het kort werden de PCC-monsters in afzonderlijke porseleinen kroezen geplaatst en gedurende 1 uur bij 350 ° C in een voorverwarmde oven verwarmd. Na afkoeling tot 30°C werden de verkregen homogene zwarte resten vermalen tot fijn poeder en tweemaal gekookt in water, beide bij 100°C gedurende 1 h per keer. Vervolgens werd de oplossing verzameld door de suspensie voor te filtreren door een 0,22 m celluloseacetaatmembraan. Niet-koolstofhoudende onzuiverheden werden verwijderd door dialyse tegen DW gedurende 72 h (behouden molecuulgewicht:1000 Da). De PCCC-CDs-oplossing werd geconcentreerd en tot gebruik bij 4°C bewaard. Het stroomdiagram in Fig. 1 illustreert het bovenstaande proces.

Illustratie van het vormingsproces van koolstofstippen (CD's) van Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) door pyrolysebehandeling

Karakterisering van PCCC-CD's

De morfologie van de cd's werd bestudeerd met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM, JEM-2100 elektron, JEOL, Japan) met elektronenenergie van 200 kV. Structurele details werden onderzocht met behulp van TEM (HRTEM) met hoge resolutie met behulp van een Tecnai G2 20 elektronenmicroscoop (FEI, VS). Het ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectrum en de fluorescentie-eigenschappen werden geregistreerd en gemeten met respectievelijk UV-Vis (CECIL, Cambridge, VK) en fluorescentie (F-4500, Tokyo, Japan) spectroscopie. Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) werd gebruikt om de informatie over functionele oppervlaktegroepen te analyseren in een spectraal venster tussen 400 en 4000 cm^− 1 .

Cytotoxiciteitstesten

Menselijke L02-hepatocyt en de menselijke embryonale nier 293 T-cellijnen werden gebruikt om de potentiële cytotoxiciteit van PCCC-CD's te beoordelen met behulp van een CCK-8-assay. L02-cellen werden gekweekt in Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat, terwijl 293 T-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met hoge glucose, dat 10% FBS bevatte. Beide cellijnen werden geïncubeerd bij 37°C in bevochtigde 5% CO₂ .

L02- en 293 T-cellen werden gezaaid met een dichtheid van 2,0 × 10⁴ cellen/putje in platen met 96 putjes en gekweekt bij 37°C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO₂ voor 24u. Vervolgens werden beide celtypen behandeld met 100 L van verschillende concentraties (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 en 19,5 μg/mL) van de PCCC-CD-oplossingen in serumvrij medium en werden ze gedurende nog eens 24 uur geïncubeerd. H. Vervolgens werd het medium met de PCCC-CD's verwijderd en werden de cellen tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Cytotoxiciteit werd bepaald door de plaat af te lezen bij 450 nm onmiddellijk na toevoeging van 10 μL van het CCK-8-reagens en 4 uur incuberen bij 37 °C.

D. acutus Door gif geïnduceerde AKI en behandeling

D. acutus Door gif geïnduceerd AKI-model

Het AKI-muismodel is tot stand gekomen door muizen intraperitoneaal te injecteren met D. acutus slangengif. De muizen werden willekeurig verdeeld in de volgende vijf groepen van elk 36 dieren:controle; model; en behandelingsgroepen met een hoge, gemiddelde en lage dosis PCCC-CD's. De modelgroep ontving D. acutus gif bij 1 mg/kg (0,15 mg/ml, 0,2 ml) lichaamsgewicht en 0,5 ml normale zoutoplossing intraperitoneaal, terwijl de PCCC-CD-behandelingsgroepen met een hoge, gemiddelde en lage dosis een equivalent volume slangengif en PCCC kregen -CD-extract in doses van respectievelijk 8,0, 4,0 en 2,0 mg/kg. Muizen die intraperitoneaal werden geïnjecteerd met alleen normale zoutoplossing (NS) dienden als controles. Zes muizen uit elke groep werden 1, 3 en 12 uur na toediening van NS, D opgeofferd. acutus gif en PCCC-CD's volgens het hierboven beschreven schema, terwijl muizen die werden opgeofferd op dag 1, 2 en 5 continu werden toegediend met NS, D. acutus slangengif en PCCC-CD's twee keer per dag.

Analyse van UTP- en MALB-concentraties

Na toediening van de respectievelijke behandelingen werden dieren in de controle-, model- en PCCC-CDs- (4,0 mg/kg) behandelde groepen onmiddellijk in geschikte metabole kooien geplaatst voor urineverzameling totdat de incubatieperiode eindigde (24 uur). De concentraties van UTP en MALB werden geanalyseerd met behulp van een automatische biochemische analyser.

Analyse van biomarkers van nierfunctie

De nierfunctie werd beoordeeld door de niveaus van SCR en BUN te meten. Voordat de muizen werden geëuthanaseerd, werden bloedmonsters uit de retro-orbitale plexus genomen en vervolgens gedurende ten minste 4 uur bij 4 ° C in plastic buizen geplaatst. Serum werd verkregen door centrifugeren bij 750×g gedurende 15 minuten, en BUN- en SCR-niveaus werden geanalyseerd met behulp van een automatische biochemische analysator.

Detectie van ontstekingscytokineniveaus

De rechter nieren van de muizen werden verwijderd, snel ingevroren in droogijs en bewaard bij -80 ° C tot gebruik in de volgende procedures. Weefselmonsters (100 mg) van de verschillende groepen werden gehomogeniseerd met PBS op ijs en vervolgens gecentrifugeerd bij 750×g gedurende 15 minuten. De supernatanten werden verzameld om de niveaus van MCP-1, IL-10 en IL-1β te bepalen met behulp van respectievelijke ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.

Nierhistologie

De linkernierweefselmonsters van de muis werden gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline bij 4 ° C gedurende meer dan 48 ° C, gedehydrateerd, ingebed in paraffine, in secties gesneden en vervolgens gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E). Morfologische veranderingen werden vergeleken tussen de controle-, model- en de met PCCC-CD's behandelde groepen.

Thrombocytopenische activiteit

De PLT werd uitgevoerd op bloed dat aan de muizen was onttrokken uit de retro-orbitale plexus en gedetecteerd met behulp van een geautomatiseerde hematologieanalysator (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japan).

Statistische analyse

Statistische analyse is uitgevoerd met behulp van het Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, versie 13.0). De normaal verdeelde gegevens en homogene varianties worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). Een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de test met het minst significante verschil (LSD) werd gebruikt voor meerdere vergelijkingen. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisering van PCCC-CD's

TEM werd gebruikt om de morfologie en grootteverdeling van PCCC-CD's direct te observeren (Fig. 2a, c en d). De bereide cd's waren bolvormig en uniform van grootte, met de meeste bij 2,84 ± 0,89 nm zonder duidelijke aggregaties. Het HRTEM-beeld toonde roosterranden (0,24 nm) van de cd's, die overeenkwamen met grafietkoolstof zoals weergegeven in figuur 2b.

een en c Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beelden van Phellodendri Cortex Carbonisatus carbon dots (PCCC-CD's), b TEM-afbeelding met hoge resolutie van PCCC-CD's, d Grootteverdeling van PCCC-CD's

Zoals weergegeven in Fig. 3a, vertoonden de CD's duidelijk blauwe fluorescentie met een piekmaximum bij 445 nm na 370 nm-excitatie. Dienovereenkomstig vertoonde de optische informatie op de PCCC-CD's weergegeven in het UV-Vis-spectrum een sterke absorptiepiek bij 265 nm, wat overeenkomt met de π-π * -overgang van geconjugeerde organische moleculen op de CD's-oppervlakken (Fig. 3b).

Optische eigenschappen van Phellodendri Cortex Carbonisatus carbon dots (PCCC-CD's). een Fluorescentiespectra, b ultraviolet-zichtbare spectra (UV-Vis) en c Fourier-transformatie infrarood spectrum (FTIR)

Bovendien werden de functionele groepen van de geformuleerde CD's geïdentificeerd op basis van het FTIR-spectrum in detail, zoals weergegeven in Fig. 3c. De piek bij 3433 cm^− 1 werd toegewezen aan de absorptiebanden van O–H en N–H strektrillingen terwijl C–H rektrillingen verschenen op 2923 cm^− 1 en 2853 cm^− 1 . Bovendien is de absorptiepiek bij 1624 cm^− 1 duidde op de aanwezigheid van C=O. C–O–C bindingen werden waargenomen bij 1109 cm^− 1 , en de piek op 1400 cm^− 1 werd toegeschreven aan C-N-strekking. Deze bevindingen kwamen overeen met die van eerdere rapporten.

In vitro cytotoxiciteit

Om de cytotoxiciteit te beoordelen, werden L02- en 293 T-cellen gedurende 24 uur blootgesteld aan verschillende concentraties van de PCCC-CD's en werd de levensvatbaarheid onderzocht met behulp van de CCK-8-assay. Zoals geïllustreerd in Fig. 4a, was de levensvatbaarheid van L02-cellen behandeld met PCCC-CD's> -85% vergeleken met die van de controlecellen, zelfs bij een concentratie zo hoog als 5 mg / ml. Evenzo hadden de PCCC-CD's geen invloed op de groei van 293 T-cellen bij concentraties tot ongeveer 2500 μg / ml (figuur 4b). Deze resultaten gaven aan dat de PCCC-CD's een lage cytotoxiciteit vertoonden.

Levensvatbaarheid van de cellen door CCK-8-assay van (a ) L02-cellen en (b ) 293 T-cellen geïncubeerd met PCCC-CD's gedurende 4 uur

Effect van PCCC-CD's op UTP- en MALB-concentraties

Vergeleken met het UTP-niveau in de controlegroep (0.98 ± 0.38 mg/L), stegen de UTP-niveaus significant in de D. acutus met gif behandeld (3,08 ± 0,92 mg/L, P < 0.01) en PCCC-CD's (2.36 ± 0.83 mg/L, P <-0.05) groepen (Fig. 5a). Bovendien nam het UTP-niveau af na behandeling met PCCC-CD in vergelijking met het niveau na toediening van gif (P < 0.05). Bovendien nam het niveau van MALB duidelijk toe met 24 uur na intraperitoneale injectie van D. acutus gif (17,78 ± 5,96 mg/L, P < 0.01) vergeleken met die van de controlegroep (2.02 ± 0.91 mg/L). Daarentegen vertoonden de met PCCC-CD behandelde muizen een afnameneiging in het niveau van MALB (14,25 ± -4,16 mg/L, Fig. 5b).

Effecten van Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CD's) op urinair totaal eiwit (UTP) en microalbuminurie (MALB) in de urine. een UTP en b MALB. Muizen werden behandeld met normale zoutoplossing (NS), D.acutus gif (Dav, 1 mg/kg) en PCCC-CD's (4 mg/kg) + Dav (1 mg/kg). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van zes dieren van elke groep. *p < 0,05 en ** p < 0,01 vergeleken met controlegroep behandeld met NS. ^# p 0,05 vergeleken met Dav-groep

PCCC-CD's verlichtten nierfunctiestoornissen in D. acutus Door gif geïnduceerde AKI-muizen

De nierfunctie werd beoordeeld door de niveaus van BUN en SCR te meten, die worden getoond in Fig. 6 en 7. De muizen behandeld met D. acutus gif had significant hogere niveaus van BUN (12,07 ± 1,00 mmol/L [1 dag], P < 0,01; 11,43 ± 1,37 mmol/L [2 dagen], P < 0,01; 14,83 ± 2,53 mmol/L [5 dagen], P < 0,01) en SCR (12,83 ± 1,43 μmol/L [1 dag], P < 0,01; 13,48 ± 2,26 μmol/L [2 dagen]; P < 0,01. 13,80 ± 1,90 μmol/L [5 dagen], P <-0,01) dan de met NS behandelde muizen (BUN:8,95 ±-1,04 [1 dag], 9,53 ±-1,40 [2 dagen] en 9,07 ±-1,57 [5 dagen] mmol/L; SCR:9,40 ± -0,89 [1 dag] , 10,27 ± -2,04 [2 dagen] en 9,85 ± -1,99 [5 dagen] μmol/L) van dag 1 tot 5 (Fig. 6a en 7a). Merk op dat, vergeleken met de modelgroep, behandeling met laaggedoseerde PCCC-CD's de toename van de SCR-spiegels significant remde (9,77 ± 0,79 μmol/ml, P < 0.01) en BUN (10.50 ± 1.38 mmol/L, P < 0,05), terwijl hoog (9,62 ± 1,87 μmol/ml, P < 0,01) en gemiddeld (10,75 ± 1,48 μmol/ml, P <-0,05) doses remden de toename van SCR (Fig. 7b) maar niet BUN (Fig. 6b) geïnduceerd door D. acutus gif op dag 1. De niveaus van SCR (Fig. 7c) van de met PCCC-CD behandelde groepen met hoge, gemiddelde en lage dosis namen af (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75 en 10,68 ± 1,41 μmol/ml, respectievelijk; P <-0,05) dan in de modelgroep op dag 2. Bovendien daalden, vergeleken met de modelgroep, de BUN-niveaus significant in de hoge (9,57 ± 0,52 mmol/L, P < 0,01) en lage dosis (10,72 ± 2,04 mmol/L, P <-0,05) PCCC-CD's-groep maar niet de groep met gemiddelde dosis (Fig. 6c) op dag 2. Zoals getoond in Fig. 6d en 7d werden remmende effecten waargenomen op de niveaus van beide indexen bij hoge (12,28 ± 1,65 mmol/L, P < 0,01 (BUN); 11,38 ± 1,80 μmol/ml, P < 0,05 (SCR), respectievelijk) en medium (12,40 ± 1,33 mmol/L, P < 0,05 (BUN); 10,83 ± 2,57 μmol/ml, P < 0,05 (SCR), respectievelijk) doses PCCC-CD's. Bovendien werd er geen significant verschil waargenomen tussen de controlegroep en de met PCCC-CD's behandelde groepen in de SCR.

Effecten van Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata - koolstofstippen (PCCC-CD's) op bloedureumstikstof (BUN). een BUN-concentratie verandert in 1 uur, 3 uur, 12 uur, 1 dag, 2 dagen en 5 dagen. De niveaus van BUN in (b ) 1 dag (c ) 2 dag (d ) 5 dag. Muizen werden behandeld met normale zoutoplossing (NS), D.acutus gif (Dav, 1 mg/kg) en hoge (H), gemiddelde (M) en lage (L) doses PCCC-CD's + Dav (1 mg/kg). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van zes dieren van elke groep. *p < 0,05 en ** p < 0,01 vergeleken met controlegroep behandeld met NS. ^# p 0,05 vergeleken met Dav-groep

Effecten van Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CD's) op serumcreatinine (SCR). een SCR-concentratie verandert in 1 uur, 3 uur, 12 uur, 1 dag, 2 dagen en 5 dagen. De niveaus van SCR in (b ) 1 dag (c ) 2 dagen (d ) 5 dagen. Muizen werden behandeld met normale zoutoplossing (NS), D.acutus gif (Dav, 1 mg/kg) en hoge (H), gemiddelde (M) en lage (L) doses PCCC-CD's + Dav (1 mg/kg). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van zes dieren van elke groep. *p < 0,05 en ** p < 0,01 vergeleken met de controlegroep die werd behandeld met een normale zoutoplossing (NS). ^# p 0,05 vergeleken met Dav-groep

PCCC-CD's remden cytokinesecretie

De effecten van drie concentraties PCCC-CD's op de productie van chemoattractant (MCP-1) en pro-inflammatoire (IL-1β) en anti-inflammatoire (IL-10) cytokines als reactie op injecties van D. acutus gif werden onderzocht. Figuur 8 toonde aan dat de injectie van gif de IL-1β die vrijkwam in het muismodel verhoogde (1 h:58,19 ± 5.35 ng/mL, P < 0,01; 3 u:56,57 ± 3,54 ng/mL, P < 0,01; 12 u:49,48 ± 7,74 ng/mL, P < 0,05; dag 1:41,09 ± 4,82 ng/ml, P < 0,05; dag 2:47,96 ± 8.33 ng/mL, P < 0,05; dag 5:45,11 ± 6,95 ng/mL, P < 0.05) vergeleken met niveaus in de met NS behandelde muis (1 h:35.96 ± 4.72 ng/mL, 3 h:34.94 ± 2.58 ng/mL, 12 h:36.42 ± 5.25 ng/ml, dag 1:34.47 ± 3.67 ng /mL, dag 2:39,84 ± 3,71 ng/mL, dag 5:36,82 ± 8,27 ng/mL). Zoals getoond in Fig. 8b-d, vergelijking met de D. acutus door gif geïnduceerde groep toonde aan dat 1-,3- en 12-uurs blootstelling aan hoge (50,09 ± 7,68 ng/mL, P <-0,05 [1 uur]; 40,36 ± 8,51 ng/mL, P < 0,01 [3 uur]; 39,87 ± 4,64 ng/ml, P < 0.05 [12 h], respectievelijk) en laag- (46.64 ± 3.83 ng/mL, P < 0,01 [1 uur]; 37,65 ± 9,61 ng/mL, P < 0,01 [3 u]; 38,75 ± 6,64 ng/mL, P < 0,05 [12 uur], respectievelijk) dosis PCCC-CD's de niveaus van IL-1β significant verlagen. Bovendien verlaagden PCCC-CD's met een gemiddelde dosis het niveau van IL-1β aanzienlijk (41,50 ± 11,08 ng/ml, P < 0,01) vergeleken met die van met gif behandelde muizen na 3 uur, maar niet op andere tijdstippen.

Effecten van Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CD's) op IL-1β-niveau in het nierweefsel. een Veranderingen in het IL-1β-niveau in 1 uur, 3 uur, 12 uur, 1 dag, 2 dagen en 5 dagen. IL-1β-niveaus in (b ) 1 u, (c ) 3 uur, (d ) 12 uur, (e ) 1 dag, (f ) 2 dagen, en (g ) 5 dagen. Muizen werden behandeld met normale zoutoplossing (NS), D.acutus gif (Dav, 1 mg/kg) en hoge (H), gemiddelde (M) en lage (L) doses PCCC-CD's + Dav (1 mg/kg). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van zes dieren van elke groep. *p < 0.05 en ** p < 0,01 vergeleken met de controlegroep die werd behandeld met een normale zoutoplossing (NS). ^# p 0,05 vergeleken met Dav-groep

De niveaus van het ontstekingsremmende cytokine IL-10 namen dramatisch toe in de D. acutus met gif behandelde groep op verschillende tijdstippen (23.27 ± 0.72 ng/mL, P < 0,01; 22,03 ± 0,96 ng/mL, P < 0,05; 21,76 ± 1,99 ng/ml, P < 0,05; 26,31 ± 6,55 ng/mL, P < 0,01; respectievelijk 3 uur, 12 uur, dag 1 en dag 2) vergeleken met de met NS behandelde groep (Fig. 9). In scherp contrast, behandeling met hoge en middelhoge dosis PCCC-CD's (respectievelijk 17,17 ± 4,04 en 17,25 ± 5,64 ng/mL, beide P <-0,05) remde door gif geïnduceerde secretie van IL-10 na 3 uur, terwijl lage dosis PCCC-CD's de niveaus remden na 3 uur, 12 uur en dag 1 (17,17 ± 5.24, 17.83 ± 4.11 en 18.31 ± 2.14 ng/ ml, respectievelijk, alle P < 0.05). Er werd geen significant verschil waargenomen tussen de met PCCC-CD's behandelde en de NS-groep.

Effecten van Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CD's) op het niveau van IL-10 in het nierweefsel. een Veranderingen in het IL-10-niveau in 1 uur, 3 uur, 12 uur, 1 dag, 2 dagen en 5 dagen. Het niveau van IL-10 in (b ) 1 u, (c ) 3 u, (d ) 12 u, (e ) 1 dag, (f ) 2 dagen en (g ) 5 dagen. Muizen werden behandeld met normale zoutoplossing (NS), D.acutus gif (Dav, 1 mg/kg) en hoge (H), gemiddelde (M) en lage (L) doses PCCC-CD's + Dav (1 mg/kg). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van zes dieren van elke groep. *p < 0.05 en ** p < 0,01 vergeleken met de controlegroep die werd behandeld met een normale zoutoplossing (NS). ^# p 0,05 vergeleken met Dav-groep

Bovendien toont Fig. 10 dat injectie van D. acutus gif verhoogde de afgifte van MCP-1 in de modelgroep significant (1 h:197,45 ± 22,34 ng/mL, P < 0,01; 3 u:182,42 ± 12,94 ng/mL, P < 0,01; 12 u:169,20 ± 26,74 ng/mL, P < 0,01; 24 u:142,81 ± 25,85 ng/mL, P < 0.05) vergeleken met de met NS behandelde controle (1 h:115.82 ± 14.80 ng/mL; 3 h:106.46 ± 13.76 ng/mL; 12 h:120.35 ± 15.75 ng/ml; en 24 h:108.81 ± 25.60 ng/ ml). Meer opmerkelijk was dat de behandeling van vergiftigde muizen met de drie PCCC-CD-doses de toename van MCP-1-niveaus remde. De medium- (3 h:136,84 ± 39,94 ng/mL, P < 0,01; 12 u:127,48 ± 13,75 ng/mL, P < 0.01) en laag- (1 h:152.13 ± 18.89 ng/mL, P < 0,05; 3 u:129,54 ± 30,85 ng/mL, P < 0,01; 12 u:118,75 ± 19,96 ng/mL, P <-0,01) dosis PCCC-CD's remden de verhoging van de niveaus van MCP-1 na 1, 3 en 12 h, behalve bij gemiddelde dosis, bij 1 h (178,20 ± 22,79 ng/ml). Behandeling met hooggedoseerde PCCC-CD's nam alleen effectief af in het niveau van MCP-1 na 3 h (131,42 ± 24,62 ng/ml, P < 0.01).

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on MCP-1 level in the kidney tissue. een MCP-1 level changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. MCP-1 levels in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

In contrast, IL-1β, IL-10, and MCP-1 levels of the PCCC-CDs-treated groups at certain time points were not significantly different from those of the model group, and showed a decreasing tendency.

Effect of PCCC-CDs on the Inhibition of Thrombocytopenia

PLTs have a specific role in the pathogenesis of AKI; therefore, the PLT count was investigated and the results are shown in Fig. 11 [26]. Compared with the PLT values of the control group (1 h:[1228 ± 51] × 10⁹ ; 3 h:[1120 ± 36] × 10⁹ ; 12 h:[1245 ± 111] × 10⁹ ; day 1:[1177 ± 69] × 10⁹ ; day 2:[1195 ± 51] × 10⁹ ; and day 5:[1181 ± 46] × 10⁹ ), a drastic reduction occurred as early as 1 h after D. acutus venom administration, with a nadir occurring at 3 h. Subsequently, the PLT steadily increased up to day 5 (1 h:[354 ± 70] × 10⁹ , P < 0.01; 3 h:[315 ± 77] × 10⁹ , P < 0.01; 12 h:[435 ± 91] × 10⁹ , P < 0.01; day 1:[663 ± 226] × 10⁹ , P < 0.01; day 2:[941 ± 248] × 10⁹ , P < 0.05; day 5:[1083 ± 89] × 10⁹ ). Of note, even at this time interval, the PLT values were significantly lower than those of control mice. In addition, administration of PCCC-CDs at a dose of 8 mg/kg markedly inhibited the venom-induced thrombocytopenia induced at 1 h ([435 ± 91] × 10⁹ , P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10⁹ , P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10⁹ , P < 0.01), day 1 ([1028 ± 248] × 10⁹ , P < 0.01), and day 2 ([1183 ± 89] × 10⁹ , P < 0.01). This inhibitory effect was also observed at a dose of 2 mg/kg PCCC-CDs at 3 h and day 2 and 4 mg/kg PCCC-CDs at day 2, in addition to increased PLT. Although there was no significant difference between the model and medium-dose groups, an increasing tendency was observed at other different time points.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on platelet (PLT) counts in the blood. een PLT changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. PLT in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

Histopathological Observations

The renal injury in the venom group was histologically evaluated. As shown in Fig. 12a, in contrast to the NS-treated group, which showed normal glomeruli and tubular cellularity, marked changes were observed in the renal parenchyma of the D. acutus venom-treated group. These changes include marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration. Cotreatment with PCCC-CDs prevented D. acutus venom-induced renal damage, and the histopathological examination of the architecture of the renal tissues was almost normal with mild haemostasis, renal tubular dilation, and degeneration.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on histopathological changes in kidney tissues in D.acutus venom (Dav)-induced AKI mice. After D.acutus venom challenged, kidney tissues from each experimental group were prepared for histological evaluation. Histological changes of kidney obtained from mice of different groups normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg) in (a ) 1 h, (b ) 3 h, (c ) 12 h, (d ) 1 day, (e ) 2 days, and (f ) 5 days

Discussion

As an emerging nanomaterial, CDs are beginning to occupy an important niche as innovative materials for next-generation nanomedicines. Compared to traditional heavy-metal-based quantum dots, CDs are good candidates for biomedical application because of their unique characteristics that have considerable potential advantages in the development of novel medicines with relatively low toxicity [27, 28].

The derived PCCC-CDs particles were quasi-spherical and well-dispersed in water, with abundant functional groups present on the surface. This observation is consistent with previously reported findings [23]. In addition, the as-prepared CDs showed low toxicity against L02 and 237 T cells, which indicated its suitability for biomedical applications.

The current study is the first, to the best of our knowledge, to demonstrate the remarkable bioactivities of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus snakebite. D. acutus is widely called “five pacer” or “hundred pacer” in Chinese folk medicine on account of the folkloric description that the people or animals bitten by D. acutus could not walk more than 100 steps. More than 90% of the population of D. acutus is found in China, and the frequency of critical conditions and even death related to the bite of this snake is higher than that by many other venomous snakes [29]. AKI is the most serious systemic effect and common complication, which leads to secondary renal ischemia and failure. An enhanced knowledge of relevant information on AKI induced by D. acutus envenomation would contribute to the development of novel therapeutic approaches. However, in contrast to the considerable knowledge available on the nephrotoxicity of snake venom in general [30, 31], information on the AKI induced by D. acutus venom is rare, which led us to investigate this potential medicine that is still in the early stages of development.

In this study, we established an AKI model by intraperitoneally injecting D. acutus venom into mice to assess the complex and multifactorial pathogenesis of venom-induced AKI. Furthermore, the model provided a tool for investigating the protective effects of PCCC-CDs against AKI induced by D. acutus venom.

Current experiments have shown the development of substantial AKI with distinct changes in inflammatory cytokines and serum and urinary biochemical index, as well histopathological evidence of renal injury after intraperitoneal injection of snake venom [31]. These findings indicated the possible factors that may mainly contribute to the venom toxicity are [32] (1) direct venom cytotoxicity against the kidney and (2) renal inflammatory reactions.

Specifically, renal insufficiency was confirmed approximately 24 h post venom injection based on oliguria associated with proteinuria and elevated serum biomarkers (SCR and BUN). We further affirmed the renal involvement in the D. acutus venom-treated group using biochemical analysis, which showed significantly elevated UTP and MALB levels compared with those of the control group. These findings indicated the presence of glomerular malfunction and tubular reabsorption in the venom-treated group [33], which were supported by evidence of histopathological change. In contrast, a significant reduction in the levels of UTP and MALB was observed in the envenomated medium-dose PCCC-CD-treated group. In addition, serum biochemical indicators (SCR and BUN) are other vital parameters used to determine the elevation of renal dysfunction in AKI and they remain clinical indicators in its diagnosis [34]. Injecting snake venom from day 1 to 5 also dramatically increased the levels of SCR and BUN, whereas treatment with PCCC-CDs reversed these effects, resulting in a faster recovery than that of the control group. More importantly, the distinct changes in the kidney tissue, marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration further indicated the direct impairment of the kidney by the venom. The attenuating effects of PCCC-CDs on the histopathological changes were demonstrated in this study. These results suggested that PCCC-CDs inhibited the AKI-induced abnormal manifestation of urinary and serum biochemical markers associated with kidney dysfunction as well as renal histological damage. Furthermore, these effects may be attributable to the amelioration of the direct nephrotoxicity of the D. acutus venom by the PCCC-CDs [35]. The protective effects of PCCC-CDs were evidenced by the inhibition of D. acutus venom-induced direct kidney damage.

An intense inflammatory response is a common feature induced by envenomation by venomous animals such as snakes and caterpillars [35,36,37]. The signs of systemic inflammation with mononuclear cell infiltration, neutrophilic leukocytosis, tubular epithelial cell degeneration, and necrosis have also been shown in kidney impairment induced by injecting snake venom. MCP-1 is a small molecule protein that plays a vital role in recruiting and activating leukocytes during inflammatory responses [38]. In addition, mononuclear phagocytes and lymphocytes may contribute to acute renal cell injury by different mechanisms such as the secretion of proinflammatory mediators, which may then induce resident renal cells to express chemokines [39]. The involvement of MCP-1, inflammatory cytokines (IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) in the inflammatory response in the pathogenesis of AKI in mice injected with D. acutus venom only was demonstrated in the present study. This observation indicated that the underlying mechanism of the D. acutus venom-induced AKI may be associated with the renal inflammatory response. The evidence that exposure to PCCC-CDs significantly reduced levels of IL-1β, IL-10, and MCP-1 suggests that CDs may exhibit renoprotection by inhibiting renal inflammatory reactions.

Furthermore, PLTs play a crucial role in acute haemostatic and inflammatory processes and are associated with diverse inflammatory pathologies [40, 41]. They are highly sensitive and respond quickly to biological changes when an organism is injured or bleeding, as the first cells to arrive at the site of acute injury to interact with endothelial cells and leukocytes [42]. PLTs are involved in the pathogenesis of AKI [43], and are considered a prognostic marker that is significantly associated with a worse outcome of AKI [44]. This study provided evidence that D. acutus venom conspicuously decreased the PLT count, which was consistent with the results of studies reporting that thrombocytopenia can be induced by snake venom [34, 45]. We observed that exposure to PCCC-CDs significantly elevated the PLT counts, which was consistent with the findings of a previous study [23].

The abnormalities of AKI induced by D. acutus venom were, to our knowledge, demonstrated for the first time in the current study and mainly included renal dysfunction associated with proteinuria, oliguria, elevated BUN and SCR levels, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia.

Remarkably, the PCCC-CDs demonstrated protective activity against D. acutus venom-induced AKI by inhibiting the associated impairments, as evidenced in this study for the first time. This study was a preliminary evaluation of the beneficial effects of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus venom, and further investigations of the underlying mechanism would be the focus of future studies.

Conclusion

The impressive protective effects of PCCC-CDs on D. acutus venom-induced AKI have been demonstrated in this study, for the first time, to the best of our knowledge. The AKI-related effects were mainly manifested as renal dysfunction, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia. These results indicated that PCCC-CDs have potential application prospects for use as a complementary medicine for the treatment of abnormalities induced by D. acutus venom-induced AKI. Furthermore, this provides a novel strategy for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine formulations, and further broadens the biomedical applications of CDs.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

All data generated or analysed during this study are included in this published article.

Afkortingen

AKI:: Acute kidney injury
BUN:: Bloedureumstikstof
CD's:: Koolstofstippen
D. acutus :: Deinagkistrodon acutus
HE:: Haematoxylin and eosin
IL:: Interleukin
MALB:: Microalbuminuria
MCP-1:: Monocyte chemotactic protein 1
PCC:: Phellodendri Chinensis Cortex
PCCC-CDs:: Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots
PLT:: Platelet counts
SCR:: Serum creatinine
UTP:: Urinary total protein

Lithia-gebaseerde nanocomposieten geactiveerd door Li2RuO3 voor nieuwe kathodematerialen geworteld in de zuurstof-redoxreactie Verwarmingsefficiëntie van cilindrische magnetische nanodeeltjes met drievoudige vortextoestand

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal