Synergetisch verbeterde remmende effecten van door pullulan nanodeeltjes gemedieerde co-afgifte van lovastatine en doxorubicine aan triple-negatieve borstkankercellen

Abstract

Triple-negatieve borstkanker (TNBC) is een subtype van borstkanker dat vatbaar is voor resistentie tegen geneesmiddelen en moeilijk te behandelen is. In deze studie hebben we in water oplosbaar pullulan geënt met lovastatine (LV) om een nieuw amfifiel conjugaat te ontwikkelen, pullulan-ingekapseld LV (PLV). Het PLV-conjugaat werd gesynthetiseerd met drie verschillende verhoudingen van pullulan tot LV en gekarakteriseerd door Fourier-transformatie-infrarood (FTIR). De substitutiegraad (DS) van LV in termen van molverhouding was respectievelijk 7,87%, 3,58% en 3,06% voor PLV (1/2), PLV (1/3) en PLV (1/4) door proton NMR-analyse. We selecteerden het PLV (1/2) conjugaat om met doxorubicine (DXR) geladen PLV-nanodeeltjes (PLV/DXR NP's) te bereiden vanwege zijn superieure eigenschappen. De gemiddelde grootte en zeta-potentiaal voor PLV (1/2) NP's waren respectievelijk 177,6 nm en -11,66 mV, bepaald door dynamische lichtverstrooiing, en die voor PLV/DXR NP's waren respectievelijk 225,6 nm en -10,51 mV. In vitro profilering van geneesmiddelafgifte toonde aan dat PLV/DXR NP's duurzaam DXR afgeven binnen 72 h, wat robuuster was bij pH 5,4 (97,90%) dan pH 7,4 (76,15%). In het cytotoxiciteitsonderzoek vertoonden PLV/DXR NP's een grotere remming van de proliferatie van TNBC MDA-MB-231 dan niet-TNBC MDA-MB-453 cellen (IC₅₀ 0,60 versus 11,05 M). FITC-geladen PLV / DXR NP's werden voorbereid om de cellulaire opname te onderzoeken:beide cellijnen vertoonden een tijdsafhankelijke opname van NP's, maar het aantal NP's dat MDA-MB-231-cellen binnenging was groter dan het aantal NP's dat de MDA-MB-453-cellen binnenging . Op Pullulan gebaseerde NP-co-afgifte van LV en DXR zou TNBC-cellen efficiënt kunnen remmen, wat kan helpen bij het ontwerpen van een krachtig medicijnafgiftesysteem voor de behandeling van TNBC.

Inleiding

Triple-negatieve borstkanker (TNBC) is een speciaal subtype van borstkanker dat een oestrogeenreceptor (ER), progesteronreceptor (PR) en humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2) mist en een slechtere prognose heeft dan andere subtypes van borstkanker [ 1,2,3]. Beschikbare gerichte therapieën zijn meestal afhankelijk van het richten op specifieke receptoren op het oppervlak van de tumorcel. Omdat TNBC geen specifieke oppervlaktemarker heeft voor actieve targeting voor behandeling, zijn andere targetingbenaderingen het onderzoeken waard. Passieve targeting, waarbij een uniek verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect op solide tumoren [4] betrokken is, maakt het bijvoorbeeld mogelijk dat deeltjes met een specifiek groottebereik zich op de tumorplaats richten [5, 6]. Een nanodeeltje (NP) is een soort medicijndrager die kan profiteren van het EPR-effect en verrijkt kan worden op vaste tumorplaatsen [4].

Onlangs hebben we aangetoond dat lovastatine (LV), een van de lipofiele statines die worden gebruikt om hyperlipidemie te behandelen [7], selectief TNBC remt door zich te richten op kankerstamcellen [8, 9]. Verder hebben we aangetoond dat NP-inkapseling het remmende effect van LV op TNBC kan versterken in een muismodel voor implantatie van borstkankercellen [8]. Onze studies, samen met eerdere bevindingen [10, 11], suggereren dat lipofiele statines, met name LV, kunnen worden hergebruikt als geneesmiddelen tegen kanker voor de behandeling van TNBC. Of LV chemoresistentie kan overwinnen of de therapeutische effecten van chemotherapeutische geneesmiddelen bij TNBC kan versterken, blijft echter onbekend.

De synergie tussen LV en verschillende soorten chemotherapeutica zoals doxorubicine (DXR), 5-fluorouracil [12], cisplatine [13] en 1-β-D-arabinofuranosylcytosine [14] is gemeld in verschillende typen kankercellen. DXR is een antracyclineverbinding met ingewikkelde kenmerken van binding aan DNA en remming van nucleïnezuursynthese. Bovendien induceerde LV apoptose van eierstokkankercellen in synergie met DXR [15]. LV is ook een directe remmer van het efflux-eiwit P-glycoproteïne [16], een door ATP aangedreven pomp die DXR gemakkelijk naar het extracellulaire compartiment kan afvoeren [17, 18]. LV kan dus het therapeutische effect van andere therapeutische middelen verhogen, en de combinatie van LV en deze geneesmiddelen kan de therapeutische werkzaamheid tegen TNBC versterken.

De huidige combinatietherapieën zitten vol uitdagingen. Aan de ene kant kan combinatiechemotherapie ernstig worden beperkt door het snelle metabolisme, de slechte oplosbaarheid in water en de lage biologische beschikbaarheid van chemotherapeutische geneesmiddelen [19, 20]. Aan de andere kant, met de variërende farmacokinetiek, membraantransporteigenschappen en niet-specifieke biodistributie van verschillende geneesmiddelen, is het moeilijk om voldoende concentraties en specifieke verhoudingen van toegediende geneesmiddelen in individuele cellen te bereiken [21,22,23]. Deze factoren beïnvloeden de therapeutische werkzaamheid en het niveau van synergisme of antagonisme voor de combinatie. Het samen inkapselen van twee therapeutische middelen in een medicijndrager op nanoschaal is een efficiënte manier om deze uitdagingen het hoofd te bieden, omdat het de medicijnen die in de drager zijn geladen, in staat stelt een juiste verhouding te behouden voor de synergetische effecten [24, 25].

Co-ingekapselde nanodragers omvatten voornamelijk liposomen, polymere micellen en micro- of nanobolletjes [26,27,28,29]. Polymere micellen hebben vanwege hun superieure prestaties (bijvoorbeeld met chemisch geconjugeerde en fysiek ingekapselde dubbele medicijnbelading, hoge medicijnbelading en hoge biocompatibiliteit) veel aandacht getrokken [26, 30]. In onze vorige studie hebben we een reeks NP's voorbereid met pullulan, een hydrofiel polysacharide met een hoge biocompatibiliteit, en de effecten van verschillende factoren op het afgiftegedrag van geneesmiddelen bestudeerd [31]. In deze huidige studie hebben we een nieuwe PLV polymere micel met verschillende voedingsverhoudingen van pullulan en LV gemaakt en de verdeling van grootte en zeta-potentieel en morfologie gekarakteriseerd. We kozen de kleinste resulterende NP voor het laden met DXR omdat het waarschijnlijker was dat deze door cellen zou worden geïnternaliseerd onder de premisse van het gebruik van het EPR-effect. Verder hebben we de hoeveelheid geneesmiddellading, inkapselingsefficiëntie en geneesmiddelafgiftehoeveelheid van PLV/DXR NP's gemeten in media met verschillende pH-waarden. We evalueerden de cellulaire opname van FITC-geladen PLV/DXR NP's om de ingang van NP's in tumorcellen en het synergisme van DXR en LV in combinatie te onderzoeken, evenals de cytotoxiciteit van NP's op MDA-MB-231 (TNBC) en MDA-MB -453 (niet-TNBC) cellen (schema 1).

Schematische illustratie van nanodeeltjes (NP's) en in vitro celexperiment. De pullulan-lovastatine (PLV) NP werd gevormd door zelfassemblage van een polymeer gevormd door pullulan en LV in een waterige oplossing. Tijdens het vormen van het NP werd DXR geladen in de hydrofobe kern van het NP. Vervolgens werd PLV/DXR gebruikt voor in vitro celexperimenten met MDA-MB-231- en MDA-MB-453-cellen die respectievelijk triple-negatieve borstkanker (TNBC) en niet-TNBC-cellen vertegenwoordigen.

Materialen en methoden

Materialen

Pullulan (200 kDa) kwam uit Hayashibara (Tokyo). LV en DXR hydrochloride waren van J&K Scientific (Beijing). 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide-hydrochloride (EDCI) en 4-dimethylaminopryidine (DMAP) waren van Aladdin Reagent (Shanghai). Andere reagentia zoals oplosmiddelen waren van Sinopharm Chemical Reagent Co. (Beijing). De borstkankercellijnen MDA-MB-231 (TNBC) en MDA-MB-453 (niet-TNBC) werden gekocht bij het Center for Cell Resource, Shanghai Institutes for Biological Sciences. CellTiterBlue-reagens was van Promega (Madison, WI, VS). Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) (Cat#SH30022.01) was van HyClone (VS) en foetaal runderserum (FBS) (Cat#04-001-1ACS) was van Biological Industries (Israël).

Synthese van LV-geënte pullulan (PLV)

Eerst werd LV-barnsteenzuurmonoester (LV-SA) gesynthetiseerd door de volgende stappen. In het kort werden 0,60 g barnsteenzuuranhydride (SA, 6,0 mmol) en 2,0 g LV (5,0 mmol) opgelost in 20 mL watervrije pyridine en 48 u bij 50°C geroerd. De resulterende reactieoplossing werd langzaam gegoten in een 1500 ml ijskoude HCl-oplossing van pH 3 onder constant roeren om een grote hoeveelheid van een wit precipitaat neer te slaan, en de pH van de suspensie werd ingesteld op pH 3 met geconcentreerd HCl, gevolgd door vacuümfiltratie . Het neerslag werd vervolgens gewassen met een pH-3 glaciale HCl-oplossing en vervolgens met ddH₂ O tot neutraal om een ruw product te geven. Ten slotte werd het ruwe product herkristalliseerd uit een aceton-wateroplossysteem om zuiver LV-SA te verkrijgen en de opbrengst was 72%. PLV werd geproduceerd door de carbonzuurgroep van LV-SA te conjugeren met de hydroxyl van pullulan bij molaire verhoudingen van LV-SA tot pullulan van 1/2, 1/3 en 1/4. In het kort, 0,5 g (1,03 mmol) bereide LV-SA, 0,15 g DMAP (1,23 mmol) en 0,24 g EDCI (1,23 mmol) werden opgelost in 20 mL dimethylsulfoxide (DMSO) en 4 uur bij 50°C geroerd. Pullulan (0,33 g, 1/2; 0,50 g, 1/3; 0,67 g, 1/4) werd opgelost in DMSO om een 2% (w/v) oplossing te verkrijgen. Vervolgens werd de pullulanoplossing langzaam toegevoegd aan de reactieoplossing voor reactie bij 50°C gedurende 48 uur. De reactiemengsels werden in dialysezakken (MWCO = 8~12 kDa) geplaatst en gedialyseerd tegen 25% ethanol/water en water. Daarna werden de monsters gevriesdroogd [32]. De PLV-conjugaten met een andere voedingsverhouding van LV tot pullulan werden gekarakteriseerd door FTIR-analyse met behulp van een FTIR-spectrofotometer (KBr-pellets, Nicolet, TM Nexus 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). PLV-conjugaten werden ook bevestigd door ¹ H NMR-spectroscopie (DMSO-d6-oplosmiddel, BRUKER AVANCE-500, Bruker, Billerica, MA, VS) en de substitutiegraad (DS) voor LV voor elk conjugaat werd berekend.

Voorbereiding en karakterisering van NP's

Een hoeveelheid PLV-conjugaat van 50 mg werd opgelost in 12,5 mL DMSO onder zacht schudden bij 37 °C (om het conjugaat volledig te laten zwellen) om een conjugaatoplossing van 4 mg/ml te verkrijgen. Een hoeveelheid van 5 ml geconjugeerde oplossing werd verdund tot 2 mg / ml met DMSO voor dialyse tegen 1000 L gedestilleerd water gedurende 8 h met 10 keer uitwisselingen met behulp van een dialysezak (8 ~ 14 kDa). Vervolgens werd de oplossing gesoniceerd met behulp van een sonde-type sonifier (GA92-IIDA Ultrasonic cell pulverizer, Suzhou Jiangdong Precision Instruments) bij 100 W met pulseren (puls aan 2,0 s, uit 2,0 s) gedurende 2 min in een ijswaterbad . Zelf-geassembleerde PLV NP's werden verkregen en monsters werden bewaard bij 4 ° C. Om de PLV / DXR NP's te bereiden, werd 2 mg DXR opgelost in 5 mL DMSO en vervolgens druppelsgewijs toegevoegd aan 5 mL geconjugeerde oplossing, waarna PLV / DXR NP's met dezelfde methode werden bereid. In een typische procedure voor het bereiden van FITC-geladen PLV / DXR NP's, werd 1 mg DXR opgelost in 2 mL DMSO en vervolgens druppelsgewijs toegevoegd aan 2,5 mL geconjugeerde oplossing. Vervolgens werd druppelsgewijs 1 mL FITC-oplossing (0,6 mg/ml) in DMSO toegevoegd en werden met FITC geladen PLV/DXR NP's met dezelfde methode bereid.

PLV NP's, PLV / DXR NP's en FITC-geladen PLV / DXR NP's werden gefilterd door membranen van 0,45 μm, waarna deeltjesgrootten, zeta-potentialen en polydispersiteitsindexen (PDI) werden bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS, Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, VK). De morfologische kenmerken van PLV NP's werden waargenomen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM; Tecnai G2 20 S-Twin, FEI Hong Kong) bij een versnellingsspanning van 80 kV.

Bepaling van laadvermogen en efficiëntie van beknelling

Een PLV / DXR NP-oplossing (5 mL) werd gedurende 5 min gesoniceerd (puls aan 2,0 s, uit 2,0 s) om het medicijn uit NP's vrij te maken. De DXR-absorptie in de oplossing werd gemeten bij 480 nm met behulp van een UV-zichtbare spectrofotometer (Shimadzu UV-2550, Kyoto, Japan) om de geneesmiddelconcentraties te berekenen. DXR-inkapselingsefficiëntie (EE) en laadcapaciteit (LC) werden als volgt berekend:

$$ \mathrm{EE}\%=\frac{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{total}\ \mathrm{toegevoegd}\ \mathrm{drug}}\times 100\% $$ $$ \mathrm{LC}\%=\frac{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{NP}\ \mathrm{weight}}\times 100\% $$

In vitro geneesmiddelafgifte

Het afgifteprofiel van DXR uit PLV/DXR NP's werd gemeten in 0,1 M fosfaatbufferoplossing bij 37°C met de dialysemethode zoals beschreven [33]. Doorgaans werden 6 mL PLV/DXR NP's (gelijk aan 139,4 mg DXR) overgebracht in een dialysezak (MWCO = 3500 Da) en vervolgens geïncubeerd bij 37 °C in 15 mL PBS (pH 7.4 en 5.4). Op vooraf bepaalde tijdstippen werd 3 mL externe bufferoplossing teruggetrokken en vervangen door 3 mL verse PBS (pH 7,4 of 5,4). De hoeveelheid vrijgekomen DXR werd gemeten door middel van fluorescentiespectrofotometrie. Het percentage geneesmiddelafgifte (Q %) werd als volgt berekend:

$$ Q\%=\left({C}_n\times V+{V}_n\sum \limits_{t=0}^n{C}_i\right)/\left({W}_{\mathrm{ NP}}\times \mathrm{LC}\%\right) $$

waar W is het NP-gewicht, C _n is de monsterconcentratie bij Tn , V is het totale volume van het releasemedium, V _n is het monstervolume (2 mL), en C _ik is de monsterconcentratie bij T _ik (ik = 0, 0,5, 1,…n uur, beide V ₀ en C ₀ zijn gelijk aan nul).

Celcultuur

Menselijke borstkankercellijnen MDA-MB-231 en MDA-MB-453 werden gekweekt in DMEM compleet medium met 10% FBS onder vochtige omstandigheden van 37 °C, 5% CO₂ , en normoxie (21% O₂ ). De experimentele cellen waren allemaal afgeleid van logaritmische cellen in de groeifase.

In vitro cytotoxiciteit

MDA-MB-231- en MDA-MB-453-cellen gezaaid in platen met 96 putjes (4× 10³ cellen / putje in een volume van 100 L) werden gedurende 24 h onder routinematige kweekomstandigheden gekweekt. Vervolgens werden PLV / DXR NP's met verschillende geneesmiddelconcentraties (massaverhouding van DXR en LV was 8,13) toegevoegd en 48 h geïncubeerd. Ten slotte werd 20 L CellTiter Blue-reagens (Promega) dat werd gebruikt om celproliferatie te meten, toegevoegd en 1-4 uur bij 37 ° C geïncubeerd. Absorptie bij 530/590 nm werd gemeten met behulp van een automatische microplaatlezer. De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgedrukt als een percentage van de absorptie ten opzichte van die voor controlegroepen zonder behandeling.

In vitro synergetische effectanalyse

Isobolenanalyse werd gebruikt om het synergisme en antagonisme dat door gepaarde geneesmiddelen wordt geproduceerd, kwantitatief te beoordelen. Volgens het dosis-equivalentprincipe van Tallarida en het Loewe-additiefmodel wordt een isobool gegenereerd, een lijn om het additieve effect van gepaarde geneesmiddelen te definiëren [34, 35]. In de praktijk hebben we, zoals we eerder [8] beschreven, eerst de dosis-effectcurves voor vrije DXR en vrije LV verkregen en na transformatie van de dosis en het effect van het geneesmiddel, lineaire regressie gebruikt om lineaire regressievergelijkingen te verkrijgen om de gecombineerde doses van de gepaarde medicijnen die een bepaald effect geven. De gegevens voor het uitzetten van de isobool worden geïllustreerd in tabel 1. De punten op de isobool stellen de DXR/LV in op verschillende verhoudingen om een maximaal effect van 50% te produceren. Een IC₅₀ van de gepaarde geneesmiddeldosis die zich onder de isobool bevindt, duidt op een synergetisch effect, terwijl een IC₅₀ boven de isobool duidt op een antagonistisch effect.

In vitro cellulaire opname

PLV / DXR FITC NP's werden verkregen door dialyse. De cellulaire opname van PLV/DXR FITC NP's werd getest met behulp van een fluorescentie-microplaatlezer. MDA-MB-231- en MDA-MB-453-cellen werden gezaaid (2 × 10⁵ /putje) op schalen van 2,5 cm en 24 uur bij 37°C geïncubeerd. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met concentraties van PLV-DXR FITC NP's bij 37 ° C gedurende 1, 2 en 4 uur. Het kweekmedium werd vervolgens verwijderd en tweemaal gewassen met koude PBS. Cellen werden gedurende 5 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde en op dia's gemonteerd met behulp van montagemedium dat DAPI bevat. Vervolgens werd de cellulaire opname van NP's gevisualiseerd door fluorescentiemicroscopie.

Statistische analyse

Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD en werden geanalyseerd door Student's t test. Verschillen werden als statistisch significant beschouwd bij P < 0.05.

Resultaten

In vitro cytotoxiciteit en synergetisch effect van DXR en LV

Om het remmende effect van LV en DXR tegen TNBC- en niet-TNBC-celproliferatie te evalueren, werd de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld met Alamar Blue-assay. We bepaalden eerst het remmende effect van LV en DXR op de twee TNBC-cellijnen door een gratis drugstest. Een reeks LV/DXR-concentratieverhoudingen werd verkregen door de concentratie van het ene geneesmiddel constant te stellen en die van het andere geneesmiddel te veranderen. Voor de MDA-MB-231-cellijn zorgden zowel LV als DXR voor een concentratieafhankelijke remming, maar LV had een significant remmend effect bij concentraties tot 3,0 M (Fig. 1).

Cytotoxiciteit van vrij doxorubicine (DXR) en vrij lovastatine (LV) in borstkankercellen. In vitro cytotoxiciteit van vrij DXR, LV, en DXR en LV gecombineerd tegen MDA-MB-231 (a , b ) en MDA-MB-453 (c , d ) kankercellen

De IC₅₀ waarden voor LV onder verschillende DXR-behandelingen en voor DXR onder verschillende LV-behandelingen worden weergegeven in tabel 2 en we hebben deze IC₅₀ ook uitgezet waarden (Fig. 2a) om het gecombineerde effect van DXR/LV visueel weer te geven. De IC₅₀ voor gratis DXR alleen was 0,865 M, en dat voor gratis LV alleen was 10,07 M. Toen de concentratie van DXR toenam van 0,125 tot 0,625 M (vijfvoudige toename), werd de IC₅₀ voor LV nam af van 10,92 tot 0,28 M (39-voudige verlaging), en wanneer de DXR-concentratie toenam van 0,625 tot 3,125 M (vijfvoudige toename), de IC₅₀ waarde voor LV daalde van 0,28 tot 0,0004085 μM (685-voudige reductie). Evenzo, toen de LV-concentratie toenam van 1,0 tot 3,0 M (drievoudige toename), de IC₅₀ waarde voor DXR daalde van 1,005 tot 0,3033 M (3,3-voudige verlaging) en wanneer de LV-concentratie toenam van 3,0 tot 10 μM (3,3-voudige toename), de IC₅₀ waarde voor DXR daalde van 0,3033 tot 0,007196 M (42-voudige reductie). Dus voor dezelfde remmingssnelheid van MDA-MD-231-celproliferatie, zou DXR de benodigde hoeveelheid LV aanzienlijk kunnen verminderen, en LV zou ook de benodigde hoeveelheid DXR aanzienlijk kunnen verminderen. Deze bevinding is essentieel voor tumorchemotherapie omdat DXR een zeer krachtig chemotherapeutisch medicijn is met ongewenste nadelige bijwerkingen en in een lage concentratie moet worden gehouden, en LV heeft minimale nadelige bijwerkingen [36]. Voor MDA-MB-453-cellen vertoonde DXR een concentratieafhankelijke remming, maar LV vertoonde geen significante remming bij de onderzochte concentraties. Bovendien had DXR een significant remmend effect op MDA-MB-453-cellen bij concentraties tot 3,0 M, wat veel minder effectief was dan voor MDA-MB-231-cellen (Fig. 1). We hebben onlangs ontdekt dat LV selectief een panel van TNBC-cellijnen remde in vergelijking met niet-TNBC-cellijnen [8]; daarom zou de combinatie van LV en DXR geschikt kunnen zijn voor de behandeling van TNBC, maar niet voor niet-TNBC-cellen.

Synergisme van DXR en LV. IC₅₀ waarden voor DXR en LV met verschillende LV- en DXR-concentraties berekend door GraphPad Prism 7 (a ) en de isobole-methode (b )

Om het synergisme van DXR en LV verder kwantitatief te beoordelen, hebben we de isobole-methode gebruikt. Met verschillende DXR / LV-verhoudingen om een maximaal effect van 50% te bereiken (tabel 1), hebben we een isobool uitgezet die het additieve effect van de DXR / LV-verhouding aangaf (figuur 2b). De IC₅₀ doses DXR/LV bij 0,025/7,09, 0,3033/3,0 en 0,625/0,28 (μM/μM) waren onder de isobool, wat suggereert dat DXR/LV bij deze verhoudingen een synergetisch effect zou hebben. Dit synergetische effect (1 + 1 > 2) zou dus verder farmacologisch statistisch geminimaliseerde geneesmiddeldoses met een maximale werkzaamheid van het geneesmiddel bereiken [37]. Deze drie synergetische verhoudingen leken deze resultaten weer te geven:(1) een lage dosis DXR (0,025 M) zou de therapeutische werkzaamheid van LV beter kunnen verbeteren, omdat 0,025 M DXR een grotere negatieve helling zou kunnen produceren voor de dosis-effectcurve van LV (Fig. . 2b); (2) met een hoge DXR-concentratie zou het toevoegen van een kleine hoeveelheid LV het DXR-effect tegen MDA-MB-231-cellen enorm kunnen helpen, omdat de IC₅₀ voor DXR alleen was 0,865 M, maar het toevoegen van slechts 0,28 μM LV verminderde de IC₅₀ van DXR tot 0,625 M, dat wil zeggen, 0,28 M LV verving de werkzaamheid van 0,24 M DXR volledig (tabel 2); en (3) wanneer de dosis LV ongeveer 10 keer die van DXR was, zou de DXR/LV-verhouding het beste synergetische effect moeten hebben omdat het punt (0,3033, 3,0) het verst van de isobool verwijderd was (Fig. 2b).

Synthese en structurele karakterisering van PLV-conjugaten

De amfifiele PLV-conjugaten werden gesynthetiseerd zoals weergegeven in Schema 2. PLV werd verkregen door verestering van pullulan en LV. De structuren van PLV-conjugaten werden bevestigd door FTIR en ¹ H NMR-spectra (Fig. 3). Volgens FTIR-analyse (Fig. 3a) werden PLV-conjugaten met succes geproduceerd. Voor de spectra van PLV-conjugaten, naast het behoud van de karakteristieke pieken van pullulan (1644, 1642 en 1648 cm⁻¹ ), de verbeterde pieken bij 1459 cm⁻¹ en 1360 cm⁻¹ toonde ook de buigtrillingspieken van –CH₃ en –CH₂ – respectievelijk voor LV. Verder zagen we een hoge golfgetalverschuiving van –C=O strekkende absorptiepieken (esterbinding in LV) bij 1725 cm⁻¹ van PLV-conjugaten vanwege de nieuw gegenereerde esterbinding, en deze pieken werden versterkt met een verhoogde molaire verhouding van LV tot pullulan (Fig. 3a).

Chemische synthese van amfifiele PLV-conjugaten. LV en barnsteenzuuranhydride (SA) reageerden onder de katalyse van pyridine om LV-SA te vormen bij 50 ° L. Vervolgens werd LV-SA gekoppeld aan pullulan door een esterbinding onder de katalyse van EDC en DMAP om het PLV-polymeer te vormen

Structurele karakterisering van pullulan-lovastatine (PLV) conjugaten. een FTIR-spectra voor pullulan, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) en PLV (1/4), met een piek van 1644, 1642 en 1648 cm⁻¹ als karakteristieke pieken van pullulan. De stippellijnen op 1360, 1459 en 1725 cm⁻¹ toon de buigtrillingspieken van –CH₃ – en –CH₂ – voor LV. b ¹ H NMR-spectra voor pullulan, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) en PLV (1/4)

We hebben de succesvolle synthese van PLV-conjugaten bevestigd door ¹ H NMR-spectra (figuur 3b). De ¹ H-NMR-spectra toonden de karakteristieke pieken van pullulan en nieuwe pieken toegewezen aan de CH₃ , CH₂ , en CH-protonen van de LV-groep bij 0,5 ~ 2,7 ppm (rood kader), wat de succesvolle conjugatie van LV aan pullulan aangaf. We gebruikten de karakteristieke pieken van pullulan bij 4,94 ~ 5,14 ppm (a) overeenkomend met de α-1,6 en α-1,4 glycosidische bindingsprotonen van C₁ om de glucose-eenheden in pullulan te definiëren [38]. De signalen bij 4.12 ppm (b) kwamen overeen met het proton van de C₁₃ in LV. Zo werd de DS van LV-residuen per 100 glucose-eenheden pullulan berekend door de verhouding van C₁₃ protonen (4,05~4,15 ppm) van LV tot suikerprotonen (4,94~5,14 ppm) met de volgende vergelijking:DS = I _4.05~4.15 /Ik _4.94~5.14 × 100%. De DS-gegevens voor LV staan in Tabel 3.

Kenmerken van PLV-NP's

Het gesynthetiseerde PLV-conjugaat zou zichzelf kunnen assembleren tot micellen in een waterige oplossing. De gemiddelde grootte en polydispersiteitsindex (PDI) waren respectievelijk 177,2 nm en 0,138 voor PLV (1/2) NP's; 189,7 nm en 0,160 voor PLV (1/3) NP's; en 219,8 nm en 0,050 voor PLV (1/4) NP's (Tabel 3; Fig. 4a, b). Bovendien was het zeta-potentieel voor PLV (1/2), PLV (1/3) en PLV (1/4) NP's respectievelijk -11,66, -10,51 en -8,30 mV. De grootte van PLV NP's nam af met toenemende DS van LV, zonder significante verandering in zeta-potentiaal. De verandering in grootte wordt voornamelijk toegeschreven aan de versterking van de hydrofobe interactie tussen LV-groepen, wat resulteert in de vorming van compactere hydrofobe kernen [39]. We hebben eerder pullulan-NP's met verschillende DS-waarden van cholesterol bestudeerd en ontdekten dat tot op zekere hoogte, hoe groter de hydrofobe DS van het amfifiele polymeer, hoe kleiner de grootte van de gevormde NP's [33]. In deze studie, omdat de DS van de hydrofobe groep LV groter was, was de grootte van de NP's ook kleiner. Ook toonden TEM-afbeeldingen (figuur 4c) aan dat de NP's over het algemeen bolvormig waren met een goede monodispersiteit. PLV (1/2) NP's, met de hoogste DS die leidde tot de hoogste LV-belasting en de kleinste grootte, werden geselecteerd voor de volgende experimenten.

Karakterisering van nanodeeltjes (NP's). een Deeltjesgrootte en distributie van PLV. b Zeta-potentiaal van PLV. c Transmissie-elektronenmicroscopiebeeld van PLV (1/2). d Deeltjesgrootte en distributie van PLV/DXR en FITC-geladen PLV/DXR. e Zeta-potentiaal van PLV/DXR en FITC-geladen PLV/DXR. v Foto van PLV, PLV/DXR en FITC-geladen PLV/DXR

PLV/DXR NP's vertoonden ook sferische morfologie en een grotere afmeting, 225,6 nm, dan lege PLV NP's. De inkapselingsefficiëntie en laadcapaciteit van PLV/DXR NP's was respectievelijk 20,92% en 1,93%. De hydrofobe interactie tussen de hydrofobe kern van de NP's en de hydrofobe groep van het medicijn bepaalt de hoeveelheid medicijnbelading in de NP's. Aangezien de wateroplosbaarheid van DXR-hydrochloride dat in dit experiment werd gebruikt iets groter was, was de hydrofobe interactie tussen DXR en de hydrofobe kern van de NP's zwak, wat leidde tot een kleinere hoeveelheid DXR die feitelijk in de NP's was ingekapseld. Om de opname van NP's door tumorcellen verder te verduidelijken, werd FITC in PLV / DXR NP's geladen. Met FITC-lading was de gemiddelde grootte van FITC-geladen PLV/DXR NP's 253,8 nm en de gemiddelde zeta-potentiaal − 15,09 mV (Fig. 4d, e).

In vitro geneesmiddelafgifte

Om het afgiftegedrag van DXR van PLV / DXR NP's te onthullen, werden in vitro DXR-afgifteprofielen beoordeeld in PBS bij pH 7,4 en 5,4, waarbij respectievelijk de omstandigheden in normale fysiologische weefsels en de intracellulaire micro-omgeving werden nagebootst. PLV / DXR NP's vertoonden twee fasen van DXR-afgifte:een snelle afgifte in de eerste 8 h en een aanhoudende afgifte daarna (figuur 5), wat consistent is met het afgifteprofiel van typische NP's. Bovendien, met een daling van de pH van 7,4 naar 5,4, werd de cumulatieve DXR-afgifte aanzienlijk versneld tot respectievelijk 76,15% en 97,90% bij 72 h. Daarom was de afgifte van DXR uit PLV/DXR NP's tot op zekere hoogte pH-gevoelig, wat vooral nuttig is bij het verbeteren van de therapeutische werkzaamheid en het verminderen van bijwerkingen in vivo [40].

In vitro afgifteprofielen van DXR van PLV/DXR in fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7,4 versus 5,4 op verschillende tijdstippen na dialyse

Cellulaire opname van FITC-geladen PLV/DXR NP's

We verkregen fluorescentiemicroscopiebeelden van MDA-MB-231 (Fig. 6a) en MDA-MB-453 (Fig. 6b) cellen bij respectievelijk 0,5, 1 en 4 h, na blootstelling aan FITC-geladen PLV/DXR NP's en vond een tijdafhankelijke toename in intensiteit van zowel rode als groene fluorescentie van 0, 5 tot 4 uur na NP-behandeling (figuur 6), wat wijst op een tijdafhankelijke cellulaire opname van respectievelijk DXR- en FITC-geladen NP's. Ook was de hoeveelheid FITC die MDA-MB-231-cellen binnenging groter dan die in MDA-MB-453-cellen. Verdere kwantificering van de fluorescentie-intensiteit onthulde een significant verschil in opname van DXR tussen MDA-MB-231- en MDA-MB-453-cellen op 1 uur na NP-behandeling (Fig. 6c).

Borstkankercelopname van medicijnen geladen in PLV / DXR NP's. Fluorescentiemicroscopiebeelden van met FITC geladen PLV/DXR opgenomen door MDA-MB-231 (a ) en MDA-MB-453 (b ) cellen op 0,5, 1 en 4 h (blauw voor DAPI, rood voor DXR, groen voor FITC). c Kwantitatieve analyse van cellulaire opname van DXR in MDA-MB-231- en MDA-MB-453-cellen na PLV/DXR-behandeling

In vitro cytotoxiciteit van PLV/DXR NP's

Na bevestiging van het remmende effect van DXR en LV op de levensvatbaarheid van MDA-MB-231- en MDA-MB-453-cellen en het aantonen van het synergetische effect van DXR en LV, hebben we de in vitro cytotoxiciteit van PLV/DXR NP's op deze twee cellen bepaald. lijnen. MDA-MB-231- en MDA-MB-453-cellen werden geïncubeerd met PLV/DXR NP's in een concentratie die gelijk is aan die van de vrije DXR. De cytotoxiciteit van PLV / DXR NP's nam toe met toenemende DXR-concentratie en was groter voor MDA-MB-231 dan voor MDA-MB-453-cellen (figuur 7a). This finding is consistent with the cytotoxicity trend of free drugs (Fig. 7b) and indicates that loading free drugs in NPs did not affect the inhibitory behavior of the drugs. PLV/DXR NPs had higher inhibitory effect on the proliferation of MDA-MB-231 than MDA-MB-453 cells, which was consistent with the preferential inhibitory effect of LV on TNBC. Growth inhibition of MDA-MB-231 cells was greater with PLV/DXR NPs than free DXR (IC₅₀ 0.6012 vs 0.865 μM), which suggests that NPs might facilitate cellular uptake and retention of the loaded drug inside the cell, causing enhanced cytotoxicity as compared with free drug.