Gemakkelijke in-situ preparatie en in vitro antibacteriële activiteit van op PDMAEMA gebaseerde zilverdragende copolymeermicellen

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van lineaire/stercopolymeren

Lineaire copolymeren PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA en stercopolymeren (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ werden gesynthetiseerd door ARGET ATRP-polymerisatie van DMAEMA, HEMA en PEGMA met CuBr₂ /HMTETA als katalysator, Sn(Oct)₂ als reductiemiddel, en EBiB of pentaerythritol dat eerder was geacyleerd met BIBB als initiator in tolueen (schema 2). De structuur en samenstelling van doelpolymeren werden geverifieerd door ¹ H NMR. Polymere micellen werden zelf samengesteld uit PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA of (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄ met de DMAEMA als het functionele blok, waarbij de Ag ⁺ ionen werden aangetrokken en gereduceerd tot AgNP's zonder de deelname van extra reductiemiddel. De effecten van topologische structuren van copolymeren op AgNP's werden besproken en geëvalueerd op basis van de fysisch-chemische eigenschappen, antibacteriële en antikankeractiviteiten.

Synthetische routes van a PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA en b (PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA)₄

De chemische structuren van lineaire/stercopolymeren werden bevestigd door ¹ H NMR. Ten eerste werden de eindhydroxylgroepen van pentaerythritol volledig overgebracht naar de eindstandige broomgroep (Br)₄ , zoals weergegeven in ¹ H NMR-spectrum (aanvullend bestand 1:figuur S2). De piek bij 4,33 ppm werd toegeschreven aan de -CH ₂ O- in pentaerythritol, terwijl de nieuwe -(CH ₃ )₂ - signaal bij 1,94 ppm verscheen. En de integratieverhoudingswaarden van de pieken bij 1,94 ppm tot 4,33 ppm waren rond 3. Zoals weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S3 en S4, de piek van -C(CH ₃ )₂ - verscheen op 1,94 ppm. De signalen bij 1,83 ppm, 1,00 ppm werden toegewezen aan -CH ₂ - en -CCH ₃ - respectievelijk in de hoofdketens van methylmethacrylaat. De pieken bij 2,58 ppm en 4,08 ppm behoorden tot de karakteristieke resonanties van de samenvallende twee methyleenprotonen -CH ₂ CH ₂ - in DMAEMA-blok, en de piek bij 2,29 ppm werd toegewezen aan methylprotonen -CH ₃ -, die was gehecht aan een tertiaire aminegroep. De aanwezigheid van -CH ₂ CH ₂ - methyleenprotonen verbonden aan de terminale hydroxylgroep in de HEMA-eenheid bleken respectievelijk 4,08 ppm en 3,57 ppm te zijn. De karakteristieke PEG-pieken van -OCH ₂ CH ₂ - en terminal -CH ₃ protonen verschenen bij respectievelijk 3,67 en 3,39 ppm. Dubbele bindingspieken bij 5,5–6,1 ppm verdwenen in de ¹ H NMR-spectra. Berekend uit de integratieverhoudingswaarden van signaal (f) tot (a) (I _f /Ik _een ), signaal (g) naar (a) (I _g /Ik _een ), en sein (h) naar (a) (I _u /Ik _een ), respectievelijk PDMAEMA_19.3 -b -PHEMA_12,5 -b -PPEGMA_24.6 en (PDMAEMA_5.0 -b -PHEMA_5.6 -b -PPEGMA_5.0 )₄ zijn verkregen.

Voorbereiding en karakterisering van de lineaire/stercopolymeer micellen gestabiliseerde AgNP's

Het vormingsproces van AgNP's werd getoond in Schema 1. Een eenzaam elektronenpaar op het N-atoom dat behoort tot de tertiaire aminegroep in de PDMAEMA-moleculaire keten, met een vermogen tot coördinatie en reductie, dus het kan zowel als een vangmiddel worden gebruikt en een reductiemiddel. Ten eerste werden zilverionen gevangen door PDMAEMA vanwege de complexering tussen Ag ⁺ en N-atoom, vormend (Ag ⁺ )-PDMAEMA-complex. Vervolgens Ag ⁺ werden in situ gereduceerd om zilveratomen te vormen in de kiemvormingsfase. Daarna ging de kiemvorming van Ag verder met de groei van Ag-kristal, wat resulteerde in de vorming van AgNP's [26]. Het hydrofiele blok PPEGMA fungeerde als micellaire schil, die voor een stabiele beschermende laag zorgde en de stabiliteit van AgNP's verder verbeterde. Het sterische stabilisatie-effect van zelf-geassembleerde micellen in het systeem werd bepaald door het thermodynamische evenwicht van micellen op de stabilisatie van AgNP's en de agglomeratie tussen AgNP's. In het geval van een kleine hoeveelheid AgNP's, zou de sterische stabilisatie van het copolymeer verdere aggregatie van de AgNP's kunnen voorkomen. Naarmate het aantal Ag toeneemt, zou de stabiliteit van de micellen voor de AgNP's worden verzwakt en dan zou de mogelijkheid van botsing tussen deeltjes toenemen, wat resulteert in de groei van AgNP's in grootte. Door gebruik te maken van de ruimtelijke stabilisatie van micellen, hebben de AgNP's die we hebben bereid een gecontroleerde deeltjesgrootte, wat een groot potentieel is voor antibacteriële toepassingen.

DPD-simulatie werd uitgevoerd om het groeiproces en de distributie van AgNP's te onderzoeken, met dezelfde concentraties van het werkelijke experiment (PDMAEMA/AgNO₃ molaire verhouding =1/1, waarbij de volumefracties van lineaire copolymeren, Ag en waterparels respectievelijk 10%, 0,23% en 89,77% zijn). Figuur 1 onthulde dat de kralen van PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA en AgNP's vertoonden aanvankelijk een onregelmatig verdeelde toestand in waterige oplossing. Naarmate de tijd verstreek, werden uiteindelijk acht zelf-geassembleerde copolymeermicellen gevormd en uniform gedispergeerd, terwijl alle Ag-korrels in de micellen werden geladen. Men kon zien dat AgNP's in evenwicht in de copolymeermicellen konden worden gestabiliseerd zonder verdere aggregatie, wat aangeeft dat de zelf-geassembleerde micellen de verdere aggregatie van AgNP's konden voorkomen en vervolgens het doel bereikten om hun deeltjesgrootte en distributie te regelen.

DPD-simulatie van het groeiproces en de distributie van AgNP's met PDMAEMA-b -PHEMA-b -PPEGMA bij PDMAEMA/AgNO₃ molaire verhouding =1/1 in verschillende simulatietijd. een De watermoleculen waren voor de duidelijkheid verborgen. b Alleen de AgNP's werden getoond

De FT IR-karakterisering van lineaire/stercopolymeren en hun micellen gestabiliseerde AgNP's werden getoond in aanvullend bestand 1:figuur S5. Het is duidelijk dat, vergeleken met de eenvoudige lineaire/stercopolymeren, de -COOR-rektrilling bij 1730 cm ⁻¹ en de buigtrilling van C-N binding in PDMAEMA bij 1457 cm ⁻¹ nam af na de vorming van AgNP's, wat aangeeft dat de AgNP's met succes op copolymeermicellen zijn geladen. De kristallijne aard van lineaire / stercopolymeren micellen gestabiliseerde AgNP's werd bevestigd door röntgendiffractiespectrum (aanvullend bestand 1:figuur S6). De diffractiepiekenwaarden van 38,5°, 44,8°, 64,2° en 78,0° kwamen overeen met de (111), (200), (220) en (311) kristalvlakken van de vlakgecentreerde kubische (fcc) kristalstructuur van Ag-bevatte nanodeeltjes [33, 34]. De zeta-potentialen van lineaire/stercopolymeren micellen gestabiliseerde AgNP's werden gemeten. Zoals getoond in Fig. 2, waren de zeta-potentialen van deze met copolymeermicellen gestabiliseerde AgNP's ongeveer 15,0-23,2 mV. Bovendien, met de toenemende hoeveelheid AgNO₃ , het zeta-potentieel van micellen gestabiliseerde AgNP's nam opmerkelijk toe vanwege de decoratie van meer AgNP's. Om de dispersie van AgNP's en het stabiliserende effect van micellen op AgNP's verder te onderzoeken, stabiliseerden DPD-simulaties van lineaire/stercopolymeren micellen AgNP's op verschillende PDMAEMA/AgNO₃ molaire verhoudingen werden uitgevoerd. Zoals getoond in Fig. 2, toonden de resultaten ook aan dat de grootte van AgNP's evenredig was met de verhoudingen waarbij het aantal geaggregeerde kleine AgNP's toenam en de afstand ertussen afnam, wat leidde tot een toenemende kans op botsingen en agglomeratie.

De zeta-potentialen en de doorsneden van a lineair en b stercopolymeren micellen gestabiliseerde AgNP's. De gegevens zijn verzameld met verschillende PDMAEMA/AgNO₃ molaire verhoudingen van (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

De spectra voor vier lineaire copolymeren micellen gestabiliseerde AgNP's hadden een klein verschil bij de maximale absorptiepiek rond 437 nm, wat een karakteristieke oppervlakteplasmonresonantie (SPR) absorptiepiek was van sferische / bijna-sferische AgNP's, gerelateerd aan zowel resonantie-excitatie als interbandovergang van hen (Fig. 3a). Het resultaat bewees dat de tertiaire aminegroep in de lineaire copolymeren kon reageren met zilvernitraat en dat de vorming van AgNP's nauwelijks afhing van de sterische hindering van de micellen van de lineaire copolymeren. Vervolgens namen stercopolymeren met een vergelijkbare blok- en polymerisatiegraad onder dezelfde omstandigheden de deeltjesgrootte van AgNP's af wanneer de PDMAEMA/AgNO₃ molaire verhouding verhoogd. Het werd weerspiegeld door de hypsochrome verschuiving in de UV-Vis-spectra waar de maximale absorptiepieken respectievelijk 429 nm, 426 nm, 421 nm en 414 nm waren, vanwege de verschillende hoeveelheid AgNP's gevormd door coördinatiereductie op het tertiaire amine van stercopolymeermicellen (Fig. 3b). Met andere woorden, de sterische stabilisatie van de stercopolymeren zou de AgNP's beter kunnen stabiliseren en de verdere aggregatie ervan bij een kleine hoeveelheid AgNP's kunnen voorkomen. Daarentegen verzwakte de toename van de hoeveelheid AgNP's het stabiliserende effect, wat meer kansen bood voor de botsing van AgNP's, en uiteindelijk resulteerde in grotere AgNP's. Als we Fig. 3a vergelijken met Fig. 3b, bezaten de absorptiepieken bij 437 nm van AgNP's in lineaire copolymeermicellen een bredere golflengteverdeling, terwijl AgNP's in stercopolymeermicellen ongeveer 422 nm waren. Hierin werd er geen blauwverschuiving getoond in de spectra van de lineaire copolymeren, wat verklaard kan worden door het feit dat de blokken van lineaire copolymeren-micellen een zwakker effect hebben op de sterische hindering voor AgNP's, wat resulteerde in het vergroten van de kans op botsingsagglomeratie tussen AgNP's.

UV-Vis-spectra van a lineair en b stercopolymeren micellen gestabiliseerde AgNP's op verschillende PDMAEMA/AgNO₃ molaire verhoudingen van (a) 1/1, (b) 3/1, (c) 6/1, (d) 9/1

Vervolgens werden TEM-metingen uitgevoerd om de grootte, grootteverdeling en morfologie van de AgNP's te bepalen. De TEM-beelden van AgNP's waren afhankelijk van AgNO₃ voedingsverhoudingen werden getoond in Fig. 4. Toen de PDMAEMA/AgNO₃ molaire verhoudingen waren 6 en 1, berekend met behulp van ImageJ-software, de deeltjesgrootte van lineaire copolymeren micellen gestabiliseerde AgNP's waren 11,1 nm en 25,7 nm, terwijl de diameter van stercopolymeren micellen gestabiliseerde AgNP's respectievelijk 3,7 nm en 6,4 nm waren. De toename van AgNO₃ gehalte leidde tot meer zilveratomen in micellen, hogere oppervlakte-energie en het aantal geaggregeerde AgNP's neemt dienovereenkomstig toe met een grotere AgNP's-grootte. Het was duidelijk dat door micellen gestabiliseerde AgNP's monodispers en bolvormig waren met enigszins ongelijkmatige lineaire copolymeermicellen gestabiliseerde AgNP's. De afmetingen van met micellen gestabiliseerde AgNP's waren een verdere aanvulling op de UV-Vis-resultaten.

TEM image of a , b linear copolymers and c , d star copolymers micelles stabilized AgNPs at different PDMAEMA/AgNO₃ molar ratios:a , c 6/1, b , d 1/1

Stability of the Linear/Star Copolymers Micelles Stabilized AgNPs

The stability of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs is of great influence for the development of biomedical field. Obviously, the SPR peak in UV-Vis spectra (Fig. 5) of star copolymer micelles stabilized AgNPs did not display any significant changes for at least 1 month even after further diluted by one time, three times, and six times, indicating that the prepared AgNPs appeared well long-term colloidal stability within the experimental concentration range. However, the results of linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed that the UV absorption wavelength decreased slightly as the increase of dilution ratios. And the micelles concentration of linear copolymer decreased after 1 month of placement may lead to insufficient provision of steric hindrances to stabilize AgNPs.

UV-Vis spectra of a linear copolymers and b star copolymers micelles stabilized AgNPs solution at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1 after 1 month at the diluted times of 1 (a), 3 (b), and 6 (c), respectively

From the thermogravimetric analysis curves in Fig. 6, it was shown that the initial decomposition temperature (T _onset ) of linear copolymers micelles was 217 °C, which shifted to 172 °C after silver loading, suggesting that the linear copolymer micelles stabilized AgNPs showed lower thermal stability than the pure linear copolymers micelles. It may be due to the fact that the chemical structure of PDMAEMA in the molecular chain changes and the catalytic effect of AgNPs in the thermal degradation process cannot be ignored [35]. As for star copolymers and their stabilized AgNPs, T _onset were around 213 °C. The two T_onset of star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs showed very few gaps, which could be speculated that the more stable star-shaped copolymers have better effect on stabilizing AgNPs than the linear copolymers. Combined the results of UV-Vis, TEM, and TGA measurements, it could be inferred that compared to the linear copolymers, the star copolymers have superior advantages in topology for stabilizing AgNPs, such as better stability, more uniform dispersion, slower nucleation rate during reduction, and the better product with a smaller and more uniform size of AgNPs.

TGA curves of a linear copolymers and b star copolymers micelles and their micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1

Antibacterial Activity and Cell Viability

To evaluate the antibacterial activities of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs by optical density (OD₆₀₀ ) measurements, E . coli DH5α was selected as the Gram-negative bacterial model. The absorbance at 600 nm after incubation was tested by incubating the bacteria with the eight different concentrations of micelles and micelles stabilized AgNPs at 37 °C. Results shown in Fig. 7a illustrated that the bacterial growth curves were highly correlated with the AgNPs concentration in the LB medium. The inhibition of linear/star copolymers micelles on the growth of bacteria was weak, which was not fatal to bacteria. However, as the concentration of linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs increased, the survival rate of E . coli DH5α was significantly inhibited, indicating a strong antibacterial efficacy of AgNPs against E . coli DH5α. The concentrations of linear copolymers micelles stabilized AgNPs preventing the bacterial growth in the experiments were relatively higher than those of star copolymers micelles stabilized AgNPs, which might due to the fact that bigger size of AgNPs could lead to a lower antibacterial performance because of the inefficient exposure of bacteria to AgNPs and relatively slow release behavior of AgNPs.

een Antibacterial activity and b cell viability of linear copolymers and star copolymers micelles stabilized AgNPs at PDMAEMA/AgNO₃ molar ratio =6/1. *p <0.05, two-tailed Student t testen

Cancer is an uncontrollable disease of cell growth that can occur in any part of the body. The most common cancers are liver cancer, breast cancer, colorectal cancer, and lung cancer. Among them, the liver cancer has the much higher prevalence in both developed and developing countries. Therefore, the toxicity experiments of the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs on HepG2 cells were carried out, in which HepG2 cells were incubated with linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs at different concentrations (10, 50, 100, 200, 400 mg/L, respectively) for 48 h and the cell viability with MTT assay was the most intuitive data to evaluate the biocompatibility of the composite material. As shown in Fig. 7b, the percentage of viable cells for the linear/star copolymers micelles stabilized AgNPs exhibited negligible cytotoxicity, and was about 90% viability even at the highest concentration applied (400 μg/mL) after 48-h incubation, indicating the advantageous cytocompatibility of the micelles stabilized AgNPs within a relatively wide range of concentration.