Op polydopamine gebaseerde composiet nanodeeltjes met redox-labiele polymeeromhulsels voor gecontroleerde geneesmiddelafgifte en verbeterde chemo-fotothermische therapie

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van PDA@PMAA-nanodeeltjes

PDA-bol wordt bereid onder basisconditie via oplossing-oxidatie methode. De chemische coating van PDA-bol met een disulfide-verknoopte polymeerlaag werd bereikt door middel van destillatie-precipitatie-polymerisatiemethode die MAA en BAC gebruikt als respectievelijk het monomeer en de crosslinker (Fig. 1). Dit multifunctionele composiet nanodeeltje biedt in drie opzichten veel voordelen ten opzichte van andere therapeutische nanodeeltjes. Ten eerste vertoont de PDA-kern uitstekende fotothermische prestaties onder NIR-straling. Ten tweede biedt de opname van disulfidebinding selectieve afbraak van polymeerschillen en gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen bij het binnendringen van kankercellen. Ten derde biedt de PMAA-schaal de nanodeeltjes een uitstekende colloïdale stabiliteit. De dikte van de PMAA-laag kan worden geregeld door de massaverhouding van MAA- en PDA-bollen aan te passen. Figuur 2 toont de TEM-afbeeldingen van de verkregen PDA-bollen en PDA@PMAA-nanodeeltjes. Het is duidelijk dat zowel PDA- als PDA@PMAA-nanodeeltjes mono-gedispergeerd en bolvormig zijn. De PDA-bollen hadden een gemiddelde diameter van ~-100 nm, en de grootte van PDA@PMAA hybride nanodeeltjes varieerde van 120 ± 5 tot 200 ± 10 nm, met een massaverhouding van PDA tot MAA variërend van 0,5 tot 6. De hydrodynamische grootte (D _u ) en de grootteverdeling van de PDA en PDA@PMAA-nanodeeltjes werden ook gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing (DLS), zoals weergegeven in tabel 2. De PDA@PMAA-nanodeeltjes hadden een smalle grootteverdeling, meestal met een PI-waarde van 0,09-0,14. De D_h van de reeks PDA@PMAA-nanodeeltjes varieerden van 176 tot 349 nm door de massaverhouding van PDA tot MAA te variëren, wat in overeenstemming was met de trend van groottegroei uit TEM-waarneming. Met name de D_h van composiet nanodeeltjes waren groter dan de grootte bepaald door TEM, wat suggereert dat de composiet nanodeeltjes sterk gezwollen zijn in waterig medium [29]. Het ζ-potentieel van PDA-nanodeeltjes was -26,8 mV vanwege de catecholgroepen op het oppervlak van PDA. Het ζ-potentieel van PDA@PMAA-nanodeeltjes veranderde van − 30,2 naar 33,2 wat aangeeft dat carboxylgroepen bestaan ​​uit de PMAA-schaal.

Schematische illustratie van de synthese, het fotothermische effect, het laden van geneesmiddelen en de op stimuli reagerende geneesmiddelafgifte van PDA@PMAA-nanodeeltjes

TEM-afbeeldingen van PDA@PMAA-nanodeeltjes (schaalbalk, 200 nm). een PDA. b [email protected]. c PDA@PMAA-1. d PDA@PMAA-2. e PDA@PMAA-4. v PDA@PMAA-6

Aangezien MAA pH-gevoelig is, kan worden afgeleid dat PDA@PMAA-nanosferen ook een pH-gevoeligheid hebben. Zoals getoond in Fig. 3, werden de PDA@PMAA-1 nanodeeltjes als voorbeeld genomen om de pH-afhankelijkheid van de hydrodynamische grootte van PMAA-gecoate nanodeeltjes te onderzoeken. Men kan zien dat in een fosfaatbuffer van pH 8,5 de PDA@PMAA-1 nanodeeltjes een hydrodynamische diameter hebben van ongeveer 240 nm; terwijl in een zure omgeving van pH 3,0 hun hydrodynamische grootte sterk kromp tot ca. 150nm. Omdat de PMAA-polymeerketens sterk geïoniseerd zijn bij hoge pH en de sterke elektrostatische afstoting tussen polymeerketens resulteerde in een vergroting van de hydrodynamische grootte, terwijl bij lage pH de lage ionisatiegraad van PMAA-ketens leidt tot een krimp in grootte [30]. De pH-responsieve PDA@PMAA-nanodeeltjes vertonen een groot potentieel bij gecontroleerde geneesmiddelafgifte in tumorcellen (pH lager dan 6,5), aangezien de ineenstorting van de sponsachtige polymeerlaag de geneesmiddelafgifte zou kunnen vergemakkelijken. De chemische structuren van PDA@PMAA-nanodeeltjes werden gekarakteriseerd door Fourier-transform infrarood (FTIR) spectroscopie (Fig. 4). In de spectra van BAC en PDA@PMAA nanodeeltjes verschijnen de banden op 1650 en 1550 cm ⁻¹ , die worden toegeschreven aan de typische amide I- en II-banden van BAC, toonden aan dat de crosslinker BAC met succes in het composiet nanodeeltje was geïntroduceerd [25]. De piek op 1706 cm ⁻¹ , die behoort tot de rektrilling van C =O-groepen in PMAA, is duidelijk te zien in PDA@PMAA-nanodeeltjes anders dan PDA-nanodeeltjes, wat suggereert dat de PMAA-laag met succes is bekleed.

Hydrodynamische diameter van PDA@PMAA-1 nanodeeltjes in fosfaatbuffer bij verschillende pH's

FTIR-spectra van BAC-crosslinkers, PDA-nanodeeltjes en PDA@PMAA-nanodeeltjes (van boven naar beneden)

Fotothermisch effect van PDA@PMAA-nanodeeltjes

De absorptie-intensiteit in het NIR-gebied is de belangrijkste factor die het PTC-vermogen van een PTC-agens bepaalt. Om het lichtabsorptievermogen van PDA@PMAA-nanodeeltjes te onderzoeken, zijn hun UV-vis-spectra samengevat in figuur 5a. Het is te zien dat elk monster een duidelijke absorptie heeft in het NIR-gebied van 600 tot 1000 nm. Vergeleken met PDA@PMAA heeft PDA de hoogste absorptie bij 808 nm bij een equivalente massaconcentratie. De absorptie van PDA@PMAA-nanodeeltjes nam toe met de afname van de PMAA-schaaldikte (van PDA@PMAA-6 tot [email protected]). De sterke optische absorptie in het NIR-gebied moedigde ons aan om het fotothermische effect van PDA@PMAA verder te onderzoeken. Zoals getoond in Fig. 5b, werd het fotothermische effect van PDA en PDA@PMAA waterige dispersie gemeten bij een concentratie van 100 μg mL ⁻¹ bestraald met een 808-nm laser bij 5 W cm ⁻² voor 300 s. Als negatieve controle werd zuiver water gebruikt. De temperatuur van de PDA-dispersie werd verhoogd met 41 ^° C en hoger dan alle PDA@PMAA-monsters, wat consistent was met de maximale absorptie bij 808 nm. De temperatuur verhoogd met PDA@PMAA-dispersies kan oplopen van 17 tot 33 ^° C met de afname van de dikte van de PMAA-schaal (van PDA@PMAA-6 tot [email protected]), veel hoger dan die veroorzaakt door zuiver watercontrole (bereik slechts 3,5 ^° C). Eerdere studies suggereerden dat thermische therapie met een temperatuur boven 55 ^° C toonde grote voordelen bij thermische ablatie van solide tumor [31]. Vergelijking van de maximale temperatuurstijging van een reeks PDA@PMAA-nanodeeltjes, alleen [email protected] (58 ^° C) en PDA@PMAA-1 (56 ^° C) kan oplopen tot 55 ^° C. Aangezien de PMAA-schaal een bepaalde dikte moet hebben om de capaciteit voor het laden van medicijnen te garanderen, werd PDA@PMAA-1 als representatief gekozen in de volgende experimenten.

een UV-vis spectra van PDA en PDA@PMAA waterige dispersie in een concentratie van 100 μg mL ⁻¹ . b Fotothermisch effect van PDA en PDA@PMAA waterige dispersie bij een concentratie van 100 μg mL ⁻¹ werden gemeten door laserbestraling (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² )

In vitro geneesmiddelafgifte

Doxorubicine (DOX) werd gekozen als een modelgeneesmiddel om het potentiële vermogen van PDA@PMAA-1 composiet nanodeeltjes om het ingekapselde geneesmiddel onder reductieve omstandigheden af ​​te geven, te bevestigen. Het laden van DOX in composiet nanodeeltjes werd uitgevoerd bij een theoretisch gehalte aan geneesmiddellading van 9,1 gew.% en een polymeerconcentratie van 10 mg ml ⁻¹ , en het uiteindelijke gehalte aan geneesmiddellading en inkapselingsefficiëntie was respectievelijk 5,1% en 53,7%. Het gaf aan dat DOX efficiënt in het polymeernetwerk kan worden geladen. DOX-geladen PDA-nanodeeltjes werden ook bereid ter vergelijking, waarvan het DOX-laadgehalte 3,7% was. Het hogere geneesmiddel-laadvermogen van PDA@PMAA-1 nanodeeltjes kan worden toegeschreven aan de sterke elektrostatische interactie tussen de aminogroep van de DOX-moleculen en de carboxylgroepen van PMAA-ketens [25]. Met het oog daarop draagt ​​de PMAA-schaal redox-splitsbare disulfidebindingen, de voorgeladen geneesmiddelen zullen worden geactiveerd om de vooraf geladen geneesmiddelen efficiënt af te geven in reducerende omstandigheden. Rekening houdend met de licht zure micro-omgeving van de tumor en het enorme verschil in GSH-concentratie tussen intracellulair (1-10 mM) en plasma (20-40 μM), werden de in vitro experimenten met geneesmiddelafgifte ontworpen en uitgevoerd met behulp van fosfaatbuffers van pH 7,4 en 5,5 met of zonder 10 mM GSH om de tumorcel- en bloedbaanomgeving na te bootsen [23, 32, 33]. Zoals getoond in Fig. 6, is de afgiftehoeveelheid van het medicijn slechts 10,8% over een periode van 24 uur, wat suggereert dat DOX stabiel werd gehouden in de PDA@PMAA-1 nanodeeltjes wanneer ze werden gedispergeerd in fysiologische omstandigheden. In aanwezigheid van 10 mM GSH werd een opmerkelijk snelle afgifte van geneesmiddel gedetecteerd, waarbij de cumulatieve afgifte van DOX binnen 24 uur ongeveer 72,8% was, als gevolg van de afbraak van door disulfide gebonden PMAA-omhulsels in een reducerende omgeving. Toch behoudt de structuur van de PDA-kern de integriteit na de redox-responsieve degradatie (aanvullend bestand 1:figuur S2). Bovendien werd een burst-afgifte (ca. 87% binnen 24 uur) van DOX waargenomen in fosfaatbuffers van pH 5,5 met 10 mM GSH, doordat de carboxylgroepen in PMAA onder zure omstandigheden werden geprotoneerd, waardoor het polymeer verder instortte netwerken. Deze afgifteprofielen impliceerden het veelbelovende kenmerk van PDA@PMAA-nanodeeltjes voor gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen, aangezien de nanodeeltjes een lage lekkage van geneesmiddelen in plasma vertonen, maar geneesmiddelen snel vrijgeven wanneer ze de tumorcellen binnenkomen. Verder werd een langzame afgifte van het geneesmiddel (ca. 13% binnen 24 uur) voor DOX-geladen PDA@PMAA-nanodeeltjes met NIR-bestraling in fosfaatbuffers van pH 7,4 gedetecteerd, wat aangeeft dat de PDA@PMAA-nanodeeltjes de structurele integriteit behouden bij bestraling. Het afgiftegedrag van PDA-nanodeeltjes in aanwezigheid van 10 mM GSH vertoonde een opmerkelijk lage afgifte van geneesmiddelen (ca. 30% in 24 uur) in vergelijking met PDA@PMAA-1 nanodeeltjes (aanvullend bestand 1:figuur S1). Het enorme verschil in afgiftegedrag van PDA- en PDA@PMAA-nanodeeltjes suggereerde dat de introductie van een afbreekbare polymeerschil verknoopt door disulfidebinding aanleiding gaf tot de door Redox veroorzaakte effectieve afgifte van medicijnen.

DOX-afgifteprofielen van PDA@PMAA-1 nanodeeltjes bij 37 ^° C in 7,4 fosfaatbuffer (○), in 7,4 fosfaatbuffer met NIR-laserbestraling (□, in 7,4 fosfaatbuffer met 10 mM GSH (rode cirkel), of in 5,5 fosfaatbuffer met 10 mM GSH (groene cirkel)

Celassays

Onderzoek naar de cellulaire opname en intracellulaire geneesmiddelafgifte van met DOX beladen PDA@PMAA-nanodeeltjes werd verder uitgevoerd tegen de A549-cellijn. Zoals getoond in Fig. 7, kan rode fluorescentie voor DOX worden waargenomen in het celcytoplasma na 1 uur incubatie, wat wijst op een snelle internalisatie van nanodeeltjes tegen tumorcellen. Na 4 uur incubatie werd sterke rode fluorescentie waargenomen door het celcytoplasma en de celkern. Het suggereerde dat meer nanodeeltjes door cellen werden endocytiseerd en dat DOX efficiënt werd afgegeven door de afbraak van polymeerschillen in de reducerende omgeving van tumorcellen.

CLSM-afbeeldingen van A549-cellen gekweekt met DOX-geladen PDA@PMAA-nanodeeltjes voor (a ) 1 uur en (b ) 4 u. In elke rij werden respectievelijk van links naar rechts differentiële interferentiecontrastmicroscopiebeelden, fluorescentiebeelden en overlaybeelden getoond. (schaalbalk, 50 m)

Om de biocompatibiliteit van PDA@PMAA te evalueren, werd een typische normale cel (HEK-293T-cellen) gekozen voor de cellevensvatbaarheidstest door MTT-assay. Zoals getoond in Fig. 8, werd er geen duidelijke cytotoxiciteit van blanco PDA@PMAA-1 nanodeeltjes gedetecteerd bij een breed concentratiebereik van 0,1-100 μg ml ⁻¹ , wat wijst op de goede biocompatibiliteit van PDA@PMAA-1 nanodeeltjes, wat hun toepassing op biomedisch gebied garandeert. Vervolgens werd de levensvatbaarheid van de cellen tegen A549-cellen (tumorcellen) als functie van de incubatieconcentratie van blanco of met DOX beladen PDA@PMAA-1-nanodeeltjes gemeten en werd elke groep onderverdeeld in groepen met of zonder NIR-laserblootstelling (Fig. 9). ). Er werd bijna geen effect op de levensvatbaarheid van de cellen waargenomen voor de blanco PDA@PMAA-1-groep zonder laser, wat aangeeft dat de blanco composiet nanodeeltjes geen cytotoxiciteit hebben. Na 5 W cm ⁻² NIR-laserbestraling gedurende 300 s, de levensvatbaarheid van de cellen voor de blanco PDA@PMAA-1-groep nam duidelijk af en ~ -54,3% van de cellen werd gedood bij een concentratie van 100 μg ml ^-1 . De resultaten impliceerden dat deze PDA@PMAA-1-nanodeeltjes cytotoxisch waren tegen A549-cellen door NIR-bestraling die hyperthermie induceerde. Wat betreft DOX-geladen groepen, vertonen DOX-geladen PDA@PMAA-1 nanodeeltjes een afname van de levensvatbaarheid van de cellen op een dosisafhankelijke manier, die een vergelijkbare werkzaamheid hebben als de vrije DOX, wat wijst op een volledige afgifte van geneesmiddelen uit met disulfidebinding verknoopte PMAA schelpen. Voor cellen die zijn behandeld met DOX-geladen PDA@PMAA-1-nanodeeltjes met NIR-laserblootstelling, vertoont de levensvatbaarheid van de cellen een diepere afname in vergelijking met de niet-bestralingsgroep, vooral bij een hoge dosis geneesmiddel. Wanneer de cellen bijvoorbeeld werden behandeld met 100 μg ml ⁻¹ DOX-geladen PDA@PMAA-1 (met 5 μg ml ⁻¹ DOX), was de levensvatbaarheid van de cellen verminderd tot ongeveer 15,7%, wat veel lager was dan fotothermische (~ -54,3%) of chemotherapie (~ -38,1%) behandeling alleen onder dezelfde dosis nanodeeltjes. Met name de 50% celremming (IC₅₀ ) waarde van DOX-geladen PDA@PMAA-1 met een kortdurende NIR-laserblootstelling werd bepaald op 2 μg ml ⁻¹ , die veel lager was dan die van vrije DOX (6,3 μg ml ⁻¹ ). Het suggereert dat de chemo-fotothermische therapie van met DOX beladen PDA@PMAA-nanodeeltjes een synergetisch effect vertoonde, wat kan worden toegeschreven aan de verhoogde cytotoxiciteit van DOX bij hogere temperaturen [34, 35]. Daarentegen vertoont de vrije DOX met NIR-lasergroep geen vergelijkbaar synergetisch effect, aangezien er geen lokale hyperthermie is veroorzaakt door NIR-laserbestraling. Fluorescentiebeelden van met Calcein-AM (groene, levende cellen) gekleurde cellen na behandeling laten zien dat het aantal levende cellen behandeld met DOX-geladen PDA@PMAA-nanodeeltjes na NIR-laserbestraling significant minder was dan bij andere groepen, wat verder de synergetische antitumorale effect van DOX-geladen PDA@PMAA-nanodeeltjes met NIR-lichtbestraling (Fig. 10). Door te profiteren van het positieve synergetische effect van chemo-fotothermische gecombineerde behandeling, kan een lagere dosering van het cytotoxische geneesmiddel hetzelfde tumordodende effect bereiken, waardoor ernstige bijwerkingen op normale weefsels bij een hoge dosering van het geneesmiddel worden vermeden. Alles bij elkaar genomen, suggereren de bovenstaande gegevens dat deze PDA@PMAA-nanodeeltjes efficiënt medicijnen kunnen afgeven onder de intracellulaire reducerende omstandigheden en een synergetisch tumorceldodend effect vertonen voor gecombineerde chemo-fotothermische therapie, wat hun grote potentieel voor kankerbehandeling aantoonde.

Levensvatbaarheid van de cellen van HEK-293-cellen die gedurende 24 uur zijn blootgesteld aan blanco PDA@PMAA-1-nanodeeltjes

Cellevensvatbaarheid van A549-cellen behandeld met vrije DOX, PDA@PMAA-1 nanodeeltjes en DOX-geladen PDA@PMAA-1 nanodeeltjes in verschillende concentraties zonder of met NIR-laserbestraling (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) gedurende 300 s

Confocale fluorescentiebeelden van levende A549-cellen behandeld met PBS, PDA@PMAA-1 nanodeeltjes, DOX-geladen PDA@PMAA-1 nanodeeltjes en vrije DOX met of zonder NIR-laserbestraling (λ =808 nm, 5 W cm ⁻² ) gedurende 300 s. Levende cellen werden gekleurd met Calcein-AM (groen). De schaalbalk is 50 m