Dual Stimuli-Triggered Nanogels in reactie op temperatuur- en pH-veranderingen voor gecontroleerde medicijnafgifte

Resultaten en discussie

Bereiding van PNIPAM-co-AAc Nanogels

PNIPAM-co-AAc nanogels met drie verschillende gehalten aan AAc (5, 10 en 20%) werden gefabriceerd door middel van een radicale polymerisatiemethode. TEM en SEM werden gebruikt om de deeltjesgrootte, morfologie en monodispersiteit van de nanogels te bevestigen. Zoals getoond in Fig. 1a en b, vertoonde PNIPAM-co-AAc5 nanogel een relatief uniforme grootteverdeling met een gemiddelde deeltjesdiameter van ongeveer 250 nm. Bovendien werd de sol-gel-overgang van de op PNIPAM gebaseerde nanogels waargenomen naarmate de temperatuur toenam. Hoewel waterige oplossingen van PNIPAM-co-AAc5 als een sol-fase bij kamertemperatuur aanhielden, ging de nanogel bij verwarming over in de gelfase, waardoor de oplossing troebel werd boven de LCST (figuur 1c). De zeta-potentialen van de PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10 en PNIPAM-co-AAc20 daalden tot -13,56 mV, -16,61 mV, -21,87 mV en -23,62 mV vanwege de toegenomen hoeveelheid oppervlak carboxylgroepen geleverd door de AAc-inhoud (figuur 1d). Het gaf ook aan dat de hydrodynamische diameter van PNIPAM-co-AAc het bereik van 217-442 nm vertoonde toen de inhoud van AAc toenam tot 30 ° C vanwege toenemende waterstofbinding met water en interelektronische afstoting. De diameters van de nanogel namen echter af bij 50 ° C vanwege hydrofobe interacties (figuur 1e). Deze resultaten suggereerden dat PNIPAM-co-AAc in grootte kan variëren, afhankelijk van de hoeveelheid AAc die is gekoppeld aan PNIPAM en temperatuur. De samenstelling van de nanogel werd verder gekarakteriseerd met FT-IR-spectroscopie, zoals weergegeven in Fig. 2. De 1100 cm ⁻¹ ~1200 cm ⁻¹ piek aangegeven C-N buigen. De spectra vertoonden ook de -CH₂ uitrekkende trillingspiek bij 1300 cm ⁻¹ ~1400 cm ⁻¹ . De extra piek bij 1600 cm ⁻¹ ~1700 cm ⁻¹ werd toegeschreven aan C=O, dat toebehoort aan NIPAM. In het bijzonder trad uitrekking van carbonzuur (−COOH) op bij 1700 cm ⁻¹ ~1800 cm ⁻¹ behalve de PNIPAM-nanogel. Een brede piek van 3200 cm ⁻¹ ~3300 cm ⁻¹ toonde de absorptie van N-H strekken. Daarom hebben PNIPAM-nanogelderivaten die zijn samengesteld uit verschillende mengverhoudingen van PNIPAM en AAc, verschillende kenmerken vanwege de verschillende AAc-gehalten.

een TEM en b SEM-afbeelding van PNIPAM-co-AAc5 nanogels. c Fysiek uiterlijk van PNIPAM-co-AAc5 nanogels. Schaalbalken zijn 500 nm. d Zeta-potentialen en e gemiddelde diameters gemeten bij 30 °C en 50 °C door DLS voor PNIPAM met 0%, 5%, 10% en 20% AAc-gehalten bij pH 7,4

FT-IR-spectra van PNIPAM met 0%, 5%, 10% en 20% AAc-gehaltes

Temperatuurgevoelige kenmerken

Om het temperatuurgedrag te onderzoeken, werd de grootteverdeling van PNIPAM-co-AAc-nanogels beoordeeld door DLS. De verandering in de hydrodynamische diameter werd gemeten in het temperatuurbereik van 30 tot 50 ° C om de LCST te bepalen. PNIPAM met 5%, 10% en 20% AAc-inhoud had twee verschillende overgangsstappen (Fig. 3). PNIPAM-co-AAc-derivaten begonnen de eerste overgangsstap bij 30 °C en gingen vervolgens de tweede overgangsstap in rond 40 °C. Bovendien had de tweede overgangstemperatuur de neiging toe te nemen met toenemende AAc-gehalten van de PNIPAM. Daarom was de LCST van PNIPAM-co-AAc20 op een relatief hoge temperatuur van 45 ° C, terwijl die van PNIPAM 32 ° C was. Dit verschil in LCST-waarden zou kunnen worden veroorzaakt door de verhoogde negatieve lading van PNIPAM-co-AAc-derivaten. De LCST-temperaturen van PNIPAM-co-AAc5 en PNIPAM-co-AAc10 waren echter bijna identiek bij respectievelijk 37 ° C en 39 ° C. Daarom werd PNIPAM-co-AAc10 niet verder gebruikt om de prestatie van geneesmiddelafgifte te evalueren. De LCST-waarden die werden verkregen in PNIPAM-co-AAc-derivaten waren vergelijkbaar met eerdere studie [37]. Deze resultaten toonden aan dat PNIPAM-co-AAc-nanogels twee fase-overgangen hebben en dat de LCST van PNIPAM die AAc bevat verschoven naar de hogere temperatuur als gevolg van hydrofobe interacties van de grensvlak PNIPAM-ketens en interelektronische afstoting via de carboxylgroepen van AAc.

Temperatuurafhankelijkheid van de hydrodynamische diameters van a PNIPAM, b PNIPAM-co-AAc5, c PNIPAM-co-AAc10, en d PNIPAM-co-AAc20 nanogels bij pH 7,4

Dubbel gecontroleerde geneesmiddelafgifteprestaties

Om de geneesmiddelafgifteprofielen van PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 en PNIPAM-co-AAc20 te vergelijken, werd β-LP dat vrijkwam uit de PNIPAM-co-AAc-derivaten gemeten gedurende een periode van 6 uur bij kamertemperatuur (24 °C) en lichaamstemperatuur (37 ° C). Aanvankelijk hebben we de UV-Vis-absorptiespectra van de PNIPAM-co-AAc20 en de PNIPAM-co-AAc20 inclusief β-LP gemeten en een sterke absorptie waargenomen bij 257 nm, overeenkomend met β-LP (aanvullend bestand 1:figuur S1). De medicijnlaadcapaciteit van met PNIPAM-co-AAc20 geladen β-LP bleek ongeveer 60% te zijn met behulp van een standaard concentratie-absorptiekalibratiecurve van β-LP (aanvullend bestand 2:figuur S2) [38, 39]. Zoals getoond in Fig. 4, toonde het cumulatieve percentage geneesmiddel dat vrijkwam uit PNIPAM-co-AAc-derivaten aan dat de hoeveelheid β-LP die vrijkwam uit PNIPAM-co-AAc20 relatief lager was en dat de afgifte-efficiëntie significant verminderd was in vergelijking met PNIPAM en PNIPAM -co-AAc5 bij beide temperaturen. De verzadigde geneesmiddelafgiftepunten van de meeste PNIPAM-co-AAc-derivaten werden echter binnen 2 uur na de behandeling waargenomen. In het bijzonder werd de efficiëntie van de geneesmiddelafgifte van PNIPAM-nanogels sterk beïnvloed door de reactietemperatuur. PNIPAM-co-AAc-derivaten vertoonden een verbeterde efficiëntie van geneesmiddelafgifte bij lichaamstemperatuur in vergelijking met die bij kamertemperatuur. Dit resultaat werd ook ondersteund door de significant hogere cumulatieve geneesmiddelafgifte van alle PNIPAM-derivaten wanneer de reactietemperatuur hoger was dan 40 °C (aanvullend bestand 3:figuur S3).

Cumulatieve afgifte van β-LP uit PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 en PNIPAM-co-AAc20 nanogels bij temperaturen van a kamertemperatuur (24 °C) en b lichaamstemperatuur (37 °C) en pH 7,4

Zoals weergegeven in figuur 4 en tabel 1, kunnen PNIPAM-co-AAc-nanogels bij hoge temperatuur het medicijn gemakkelijk afgeven vanwege hun opmerkelijke krimp. Bovendien werd de hoogste efficiëntie van geneesmiddelafgifte bij lichaamstemperatuur waargenomen in PNIPAM en de op één na hoogste efficiëntie was PNIPAM-co-AAc5. Beide hebben een relatief laag AAc-gehalte, wat leidt tot een lagere LCST-temperatuur. We hebben vooral waargenomen dat β-LP in PNIPAM-co-AAc20 met een relatief lagere efficiëntie (61%) bij lichaamstemperatuur werd afgegeven, terwijl in de andere nanogels ongeveer 80% van de β-LP bij dezelfde temperatuur werd afgegeven. Deze resultaten gaven aan dat PNIPAM-co-AAc20 een minimale afgifte van het medicijn bij lichaamstemperatuur vertoonde terwijl het zoveel mogelijk inkapselde, vergeleken met PNIPAM en ander PNIPAM-co-AAc5. Bovendien waren deze resultaten ook consistent met temperatuurafhankelijke veranderingen in de groottemeting van PNIPAM-derivaten om LCST-waarden te bepalen.

Vervolgens evalueerden we of PNIPAM-co-AAc20 de afgifte van geneesmiddelen kon regelen via een andere factor waarop PNIPAM reageert, pH, met maximale insluiting van het geneesmiddel bij lichaamstemperatuur. PNIPAM-co-AAc20 vertoonde een cumulatieve maximale afgifte-efficiëntie van ongeveer 70%, die met ongeveer 10% toenam bij pH 8 in vergelijking met een zure of neutrale pH. Ondertussen werd er geen significant verschil waargenomen tussen pH 7,4 en zure pH (Fig. 5 en Tabel 2). Samengevat geven deze bevindingen aan dat het geneesmiddelafgifteprofiel van PNIPAM-co-AAc20 kan worden beïnvloed door het gehalte aan AAc te regelen, en deze nanogel met dubbele gecontroleerde geneesmiddelafgifte zou de geneesmiddelafgiftesnelheid effectief kunnen moduleren bij basale pH-waarden waarvan bekend is dat ze aanwezig in delen van de dunne darm [40].

Cumulatieve afgifte van β-LP uit PNIPAM-co-AAc20 nanogels bij verschillende pH-waarden

Evaluatie van eigenschappen die geneesmiddelen vrijgeven

In vitro anti-proliferatie werd geëvalueerd om een ​​belangrijk criterium uit te voeren van nanomaterialen die zijn ontworpen voor gecontroleerde afgifte en afgifte van geneesmiddelen. Zoals aangegeven in Fig. 6 vertoonde vrije β-LP een lagere levensvatbaarheid van de cellen dan PNIPAM-co-AAc nanogels geladen met β-LP voor equivalente concentraties van β-LP. Bovendien vertoonde PNIPAM-co-AAc20-nanogel een relatief hoge levensvatbaarheid van de cellen bij een concentratie van 20 μg/ml, omdat de β-LP-afgifte van PNIPAM-co-AAc20-nanogel relatief laag was in vergelijking met die van de PNIPAM-co-AAc5-nanogel bij 37 °C. Bovendien viel dit resultaat ook samen met de cumulatieve profielen van geneesmiddelafgifte. Vervolgens hebben we de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld met behulp van fluorescerend gekleurde levende en dode cellen (Fig. 7). De kleuringstest met levende/dode cellen toonde aan dat β-LP en PNIPAM-co-AAc5 nanogel inclusief β-LP vergelijkbaar waren in cellevensvatbaarheid, terwijl PNIPAM-co-AAc20 een significante toename in cellevensvatbaarheid liet zien met een dosis van 20 μg/ml na behandeling gedurende 3 uur. Er werd echter een verhoogde geneesmiddelafgifte van PNIPAM-co-AAc20 waargenomen na incubatie bij pH 8,0 gedurende 3 uur en een significante, synergetische antitumoractiviteit werd waargenomen bij dezelfde pH tijdens de 6 uur na de behandeling. Deze bevindingen impliceerden dat de temperatuur en pH dual responsive PNIPAM-co-AAc20 nanogel een potentiële toepassing heeft voor gecontroleerde medicijnbelading en afgifte in de terminale dunne darm.

Antiproliferatieve activiteit van PNIPAM-co-AAc-nanogels geladen met β-LP in verschillende concentraties in NIH3T3-fibroblastcellen gedurende 3 uur bij 37 °C

Fluorescerende beelden van cytotoxiciteit in NIH3T3-cellen met a onbehandeld, b alleen β-LP, c β-LP/PNIPAM-co-AAc5, en d Behandeling met β-LP/PNIPAM-co-AAc20 gedurende 3 uur bij pH 7,4 en behandeling met β-LP/PNIPAM-co-AAc20 gedurende 3 uur (e ) en 6 u (f ) bij pH 8,0. De levende en dode cellen worden gekleurd met calceïne AM (groen) en ethidiumhomodimeer (rood). Schaalbalken zijn 100 μm