Decoratie van nanoblaasjes met pH (laag) insertiepeptide (pHLIP) voor gerichte toediening

Resultaten en discussie

Tween20-, Span20- en DMPC-vesicles, bereid met en zonder DSPE-pHLIP, werden gekarakteriseerd op grootte en ζ-potentiaal (Tabel 2).

Volgens de resultaten in tabel 2 vertonen de geanalyseerde monsters geen significante variaties in grootte of ζ-potentiaal, ongeacht de aanwezigheid van pHLIP.

De hierboven gerapporteerde groottebereiken werden bevestigd door middel van een andere analysetechniek, zoals de cryo-TEM (Fig. 1).

Representatieve cryo-TEM-beelden van niosomen en liposomen gecoat met pHLIP. Afbeeldingen van NioSpan20-pHLIP niosomen (a ) en LipoDMPC-pHLIP-liposomen (b ) verkregen bij een vergroting van × 10.000 en LipoDMPC-pHLIP-liposomen (c ) verkregen met een vergroting van × 40.000

De interne structuur van niosomen/vesicles met en zonder DSPE-pHLIP werd bepaald door SAXS-experimenten. De SAXS-intensiteitsspectra, weergegeven in figuur 2, zijn verschillend, wat aangeeft dat elk systeem eigenaardige kenmerken heeft.

SAXS-spectra. Intensiteitsspectra van niosomen/blaasjes zonder (zwarte open symbolen) en met DSPE-pHLIP (kleursymbolen)

Op Tween20 gebaseerde niosomen zijn unilamellair, terwijl DMPC-vesicles een zekere mate van multilamelliteit vertonen (als liposomen), zoals blijkt uit de aanwezigheid van de karakteristieke piek bij q ≅ 1 nm ⁻¹ , overeenkomend met een interlamellaire afstand van 6 nm (ongeveer 5 nm lipide dubbellaag en 1 nm water). Op Span20 gebaseerde blaasjes zijn zeker multilamellair, met een karakteristieke piek bij q = 1.6 nm ⁻¹ overeenkomend met een interlamellaire afstand van 3,8 nm, overeenkomend met tweemaal de lengte van het Span20-molecuul. De resultaten geven aan dat de meerlagige schaal van Span20-blaasjes is samengesteld uit aangrenzende dubbellagen met bijna geen interlamellair water.

De aanwezigheid van DSPE-pHLIP (minder dan 1% molfractie) heeft geen dramatische invloed op de systemen. De verstrooide intensiteit in alle onderzochte q -bereik is vrij gelijkaardig, wat wijst op een vergelijkbare fractie gestructureerd materiaal en een vergelijkbare totale grootte van de vesiculaire deeltjes.

Op DMPC gebaseerde blaasjes vertonen een lichte toename van het aantal dubbellagen in het liposoom, zoals af te leiden uit de intensiteitstoename van de Bragg-piek bij q = 1 nm ⁻¹ . De insertie van een lage fractie DSPE C18-ketens, gekoppeld aan elk peptidemolecuul, verandert de dikte van de lipidedubbellaag niet, en wordt voornamelijk bepaald door de grote fractie cholesterol met betrekking tot DMPC (ongeveer 40-50%). Bij deze cholesterolconcentratie zijn lipideketens georganiseerd in de vloeibare geordende (Lo) fase, en worden ze gekenmerkt door de ontkoppeling van de zwakke laterale positionele volgorde van de ketens met betrekking tot de hoge oriëntatievolgorde langs de ketens en in staat om weinig C18- ketens zonder enige structurele verandering [36]. Ook op Span20 gebaseerde meerlagige blaasjes vertonen geen veranderingen in hun interne structuur.

In het Tween20 + pHLIP-systeem is een kleine hoeveelheid cholesterolkristallieten aanwezig, zoals blijkt uit de typische scherpe piek bij q = 1.84 nm ⁻¹ (karakteristieke afstand van 3,41 nm), en de vesikelstructuur is onaangetast. De aanwezigheid van enkele microkristallieten is vaak geassocieerd met op Tween gebaseerde niosomen [37] in hoeveelheid, afhankelijk van samenstelling, bereidingsprocedure en zuivering. In Fig. 2 worden de twee experimentele spectra van Tween20 en Tween20 + pHLIP-blaasjes getoond samen met de passende curven die zijn verkregen door de bolvormig gesloten dubbellaag te modelleren met drie concentrische schalen:de externe kopgroepen, de kettingen en de interne kopgroepen. De passende gemiddelde grootte van blaasjes is ongeveer 168 nm in beide systemen, in overeenstemming met de DLS-resultaten. Structurele parameters zijn hetzelfde voor de twee gesloten dubbellagen (zie Aanvullend bestand 1:Figuur S1 en Tabel S2) behalve voor de externe schil:in aanwezigheid van DSPE-pHLIP, een lichte afname (5%) van de elektronendichtheid van de kopgroepen wordt waargenomen (van 0,42 tot 0,40 e/Å ³ ), samen met een toename van de ruwheid van de laag. Dit resultaat geeft aan dat toevoeging van DSPE-pHLIP voornamelijk de externe schil van de blaasjes aantast. Dit komt overeen met een beeld waar de DSPE C18-ketens in de dubbellaag worden ingevoegd en het peptide aan het blaasjeoppervlak verankeren, tussen de verlengde en vertakte polyethyleenglycol-kopgroepen. We merken op dat het vermogen van pHLIP-peptide zelf (niet gekoppeld aan de lipidemoleculen) om bij hoge pH in wisselwerking te treden met het buitenoppervlak van blaasjes en bij lage pH in de dubbellaag in te voegen recentelijk door SAXS is waargenomen in het geval van onverzadigde dubbellagen van fosfolipiden [38] ]. In de huidige studie is de molfractie van peptide aanzienlijk lager en is peptide gekoppeld aan lipiden, omdat het doel is om pHLIP-gecoate pH-gevoelige medicijn-nanovectoren te ontwerpen. De pHLIP-associatie wordt aangedreven door de hydrofobe interactie van de geconjugeerde DSPE C18-ketens die in het hydrofobe gebied van de nanovector worden ingevoegd. Het pHLIP-peptide is verankerd en ligt in het externe kopgroepgebied, vatbaar voor interactie met doelmembranen bij zure pH en/of om het nanovectorgehalte vrij te geven na herschikking van twee lagen in een omgeving met een lage pH.

Om te onderzoeken of de pHLIP-aanwezigheid de microreologische eigenschappen van twee lagen (vloeibaarheid, microviscositeit en polariteit) zou kunnen beïnvloeden, werd een lipofiele schilkarakterisering uitgevoerd. De karakteriseringsstudies werden uitgevoerd met behulp van de fluorescerende sonde pyreen, die aan het begin van de voorbereidingsprocedure aan de monsters werd toegevoegd. Vanwege zijn lipofiele aard wordt het ingebracht in de dubbellaag van het blaasje en geeft het informatie over de polariteit en microviscositeit van de membraanomgeving.

Zoals weergegeven in tabel 3, nemen in alle drie de monstersets de polariteitswaarden slechts licht af in de aanwezigheid van pHLIP in vergelijking met de tegenhangervesikel zonder pHLIP, terwijl de microviscositeitswaarden een drievoudige toename laten zien, voor alle blaasjes.

De dubbellaag werd verder gekarakteriseerd door metingen van fluorescentie-anisotropie van een andere lipofiele fluorescente sonde, DPH, opgenomen in lipiden. Deze metingen weerspiegelen de beweging van de sonde en zijn oriëntatie binnen de dubbellaag, wat informatie geeft over de vloeibaarheid van de dubbellaag die het vermogen van de blaasjes om hun inhoud vrij te geven kan beïnvloeden [29]. Fluorescentie-anisotropiewaarden zijn omgekeerd evenredig met de vloeibaarheid van het membraan. Daarom komt een hoge fluorescentie-anisotropiewaarde overeen met een hoge structurele orde en/of lage membraanvloeibaarheid, zoals in de vloeistofgeordende fase [30].

De anisotropiewaarden voor elk monster worden weergegeven in Tabel 3. De gegevens geven aan dat de aanwezigheid van de DSPE-pHLIP in de blaasjes de vloeibaarheid van het membraan verhoogt, aangezien de fluorescentie-anisotropie afnam. Het is algemeen bekend dat de vloeibaarheid van de dubbellaag niet alleen wordt beïnvloed door de volgorde en laterale organisatie van de apolaire ketens, maar ook door de polaire kopgroepen [31]. SAXS-resultaten op de drie verschillende systemen laten zien dat DSPE-pHLIP-moleculen voornamelijk het kopgroepgebied aantasten, waardoor uiteindelijk een andere pakking van de polaire koppen ontstaat. Structurele resultaten lijken overeen te komen met microrheologische eigenschappen van de bilagen in aanwezigheid van geassocieerde DSPE-pHLIP, zoals onthuld door het inbrengen van twee verschillende probes. De resultaten tonen een verhoogde microviscositeit zoals onthuld door pyreen, een sonde die dicht bij het buitenste gebied zou kunnen inbrengen (pyreen log P is 4,88). Aan de andere kant wordt aangenomen dat DPH is ingebed in de kern van de dubbellagen, evenwijdig aan de as van de lipide-acylketen of beperkt in het midden van de dubbellaag, evenwijdig aan het oppervlak. Het is grotendeels gevoelig voor de hoekige heroriëntatie van amfifiele acylketens [39]. De verhoogde vloeibaarheid, zoals onthuld door DPH, kan verband houden met zowel het effect van de insertie van DSPE-ketens tussen de andere acylketens als met het effect van pHLIP-partitie in het polaire kopgroepgebied, waardoor de pakkingseigenschappen van de oppervlakteactieve stoffen veranderen. (Fig. 3).

Weergave van pHLIP-interacties met vesikelmembraan

Verdere karakteriseringsstudies werden uitgevoerd op de onderzochte preparaten. Alle monsters, bereid met en zonder pHLIP, werden 90 dagen bewaard bij een temperatuur van 4 °C om de stabiliteit van de blaasjes in de loop van de tijd te evalueren, door hun grootte en ζ-potentiële variaties te meten (aanvullend bestand 1:figuur S2). Tijdens het experiment werden geen significante variaties in grootte en ζ-potentiaal waargenomen; daarom waren alle onderzochte preparaten stabiel indien bewaard bij een temperatuur van 4 °C.

Daarnaast werd de stabiliteit van de monsters onderzocht in aanwezigheid van 90% (v /v ) humaan serum en 3 uur bewaard bij 37 °C (aanvullend bestand 1:figuur S3).

In contact met menselijk serum vertoonden Tween20-vesikels een toename in grootte, hoewel ze onder de 300 nm bleven. De grootte en de PDI-waarden werden gemeten als constant tijdens het experiment van 3 uur, wat suggereert dat de blaasjes in suspensie gedurende het hele experiment intact bleven.

Beide Span20-monsters die in contact kwamen met humaan serum vertoonden een toename in grootte, vooral bij de bereiding met pHLIP, terwijl PDI-waarden een homogene grootteverdeling suggereren (gegevens niet getoond). Deze gebeurtenis kan te wijten zijn aan de absorptie van plasma-eiwitten op het niosomale oppervlak, als gevolg van elektrostatische interacties, echter zonder verstoring van de blaasjes. Deze hypothese wordt ondersteund door de ζ-potentiële afname na contact van de blaasjes met humaan serum. Dit fenomeen doet zich voor wanneer de ζ-potentiaal licht negatieve waarden bereikt, rond het neutraliteitsgebied, waardoor het systeem onstabiel wordt en blaasjes beginnen te aggregeren.

Evenals Tween20 vertonen DMPC-vesicles een toename in grootte in vergelijking met het pre-contactmonster. Deze variatie bleek echter niet significant en de groottewaarden bleven onder 280 nm (DMPC) of onder 240 nm (DMPC + pHLIP).

Het afgiftevermogen werd geëvalueerd voor de monsters die met en zonder pHLIP waren bereid volgens de hoeveelheid calceïne (hydrofiele sonde) die in de loop van de tijd uit de blaasjes vrijkwam.

De onderzoeken werden uitgevoerd bij een temperatuur van 37 °C gedurende een periode van 24 uur, door de gezuiverde monsters bloot te stellen aan ofwel HEPES-buffer ofwel menselijk serum. Zoals getoond in figuur 4, blijken de calceïne-afgifteprofielen erg vergelijkbaar te zijn voor zowel Tween20 als Tween20-pHLIP in HEPES-buffer of humaan serum.

Calcein-releaseprofiel. NioTween20 en NioTween20-pHLIP in contact gebracht met HEPES-buffer (a ) of menselijk serum (b )

De vrijgekomen hoeveelheid calceïne lag tussen de 30 en 50%, wat aangeeft dat er geen verschillen zijn in de vrijgavemogelijkheden tussen de monsters bereid met en zonder pHLIP.

Dezelfde resultaten zijn verkregen voor Span- en DMPC-monsters (gegevens niet getoond).

Er zijn vergelijkbare afgifteprofielen gerapporteerd voor verschillende op stimuli reagerende nanodragers, zoals thermogevoelige cubosomen [40] of polymere zelf-geassembleerde nanodragers (SAN's) [41, 42].

Concluderend hebben de fysisch-chemische verschillen die zijn waargenomen in termen van microviscositeit en vloeibaarheid voor de monsters bereid met en zonder pHLIP (Tabel 3) geen invloed op hun afgiftevermogen (Fig. 4), volgens het bewijs dat de insertie van DSPE-pHLIP moleculen beïnvloeden voornamelijk het kopgroepgebied. Deze gegevens komen overeen met eerder gerapporteerde resultaten die aantonen dat pHLIP bij neutrale en hoge pH's is gebonden aan het oppervlak van liposomen die zijn gemaakt door 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-fosfocholine (POPC) en veroorzaakt geen fusie of membraanlekkage.