Rode spectrale verschuiving in gevoelige colorimetrische detectie van tuberculose door ESAT-6 antigeen-antilichaamcomplex:een nieuwe strategie met gouden nanodeeltjes

Resultaten en discussie

De op antilichamen gebaseerde colorimetrische test die de spectrale veranderingen als een roodverschuiving liet zien, werd hier gevolgd om ESAT-6 te detecteren. Figuur 1a toont de schematische weergave van een op antilichamen gebaseerde colorimetrische test in één stap; in aanwezigheid van ESAT-6 wordt verwacht dat de kleurverandering in BNP-oplossing blauw is met een rode spectrale verschuiving bij verlies van de stabiliteit van BNP onder een hoge concentratie van een tweewaardig ion, NaCl, terwijl, in afwezigheid van ESAT-6, Het BNP is stabiel door de aanhechting van het anti-ESAT-6-antilichaam op het BNP-oppervlak en leidt tot het behoud van de oorspronkelijke rode kleur, zelfs bij een hoge concentratie NaCl. Deze strategie werd bevestigd door het gebruik van de niet-specifieke CFP-10 tegen anti-ESAT-6-antilichaam en het zou een rode kleur BNP-oplossing vertonen (figuur 1b). Omdat CFB-10 ook het belangrijkste eiwit is bij het veroorzaken van tuberculose, hebben we het hier gebruikt als het controle-eiwit [26]. Over het algemeen is voor dit soort BNP-gebaseerde analyse een BNP van 13 tot 15 nm goed geschikt om de hogere gevoeligheid te bereiken [27], en het vergroten van het BNP is niet geschikt om de goede detectielimiet te bereiken. Het is vanwege de reden dat de toenemende omvang van het BNP een grotere hoeveelheid antilichamen nodig heeft om aan het BNP-oppervlak te binden. Als een grotere hoeveelheid antilichaam aan het oppervlak bindt, leidt dit tot het fout-negatieve resultaat. Hier wilden we 15 nm BNP gebruiken en bereikten we de maximale gevoeligheid voor subpicomolair niveau.

Divalente ionenoptimalisatie voor gecontroleerde BNP-aggregatie

Voor deze detectie-optimalisatie hebben we NaCl gebruikt voor de aggregatie van het BNP. Toen we screenden op de noodzakelijke NaCl-concentratie zoals weergegeven in figuur 2, werden verschillende concentraties NaCl aan het BNP toegevoegd, de kleur van de oplossing begon blauw te worden, wat wijst op de aggregatie met 100 mM NaCl. En ook uit het spectrum was duidelijk te zien dat alleen bij het geaggregeerde BNP (NaCl-concentraties van 100 tot 800 mM) er een roodverschuiving is bij de golflengte ~ 600 nm, terwijl het gedispergeerde BNP (NaCl-concentraties van 0 tot 50 mM) handhaaft het spectrum nog steeds op ~  500 nm. Er is echter een onbeduidende piek spectrale verandering met 50 mM NaCl. Uit deze resultaten werd geconcludeerd dat we ten minste 100 mM NaCl nodig hebben voor de aggregatie van het BNP, maar om de verhoogde gevoeligheid te krijgen, gebruikten we een hogere concentratie (800 mM) NaCl voor verdere experimenten. Eerder werd het vergelijkbare bereik van NaCl voor de aggregatie van het BNP aangetoond door Gopinath et al. [10].

Optimalisatie van tweewaardige ionen. Van 0 tot 800 mM NaCl werd gemengd met constant BNP (1 O.D.). Na 15 min, gescand op de golflengte van 400 tot 800 nm. De foto's zijn gemaakt met de digitale camera zoals in de afbeelding. Het spectrum en de kleurveranderingen worden aangegeven door de aggregatie van het BNP met 100 mM NaCl. Pieken werden aangegeven met de respectievelijke gekleurde bollen

ESAT-6-antilichaamoptimalisatie voor verspreiding van het BNP

Na NaCl-optimalisatie bepaalden we vervolgens de geschikte concentratie van anti-ESAT-6-antilichaam om de experimenten uit te voeren. Aangezien de gevoeligheid sterk afhangt van de antilichaamconcentratie, is het noodzakelijk om de geschikte concentratie van anti-ESAT-6-antilichaam te verlangen om BNP-dispersie te induceren. Het idee erachter is dat, als de minimale antilichaamconcentratie gewenst is, deze gemakkelijk kan worden gecomplexeerd na toevoeging van het doelwit en er geen vrije moleculen aan het BNP kunnen worden gehecht, terwijl, als er meerdere antilichamen beschikbaar zijn, wanneer we proberen de lage concentratie van ESAT-6, wordt slechts een kleine hoeveelheid antilichamen gecomplexeerd. Vervolgens bindt het resterende antilichaam zich aan het BNP-oppervlak en induceert de stabiliteit van het BNP, wat minder gevoeligheid veroorzaakt. Het IgG van het antilichaam heeft een hoger molecuulgewicht (~ 150 kDa), waardoor de vrije antilichamen gemakkelijk aan het BNP-oppervlak binden door elektrostatische interactie of ionische/waterstofbinding tussen de aan het oppervlak eindigende anionische groepen op het BNP-oppervlak [28]. Vanwege het hogere molecuulgewicht is het aantal antilichamen kleiner, en hier werd het in evenwicht gehouden met ESAT-6 met een molecuulgewicht van 6 kDa, dat meer moleculen heeft, zelfs bij een lagere concentratie. Zoals weergegeven in figuur 3a, hebben we eerst vanaf de laagste concentratie anti-ESAT-6-antilichaam (30 nM) toegevoegd en verhoogd tot de maximale concentratie (500 nM) aan het BNP. Er werd aangetoond dat 30 nM anti-ESAT-6-antilichaam met BNP in aggregatie-overgang is, zelfs met 800 mM NaCl, omdat er niet genoeg antilichamen beschikbaar zijn op het BNP-oppervlak, maar van 60 nM anti-ESAT-6-antilichaam, de oplossing heeft zijn rode kleur behouden dankzij het voldoende aantal anti-ESAT-6-antilichamen die aan het BNP-oppervlak binden. Totdat de maximale concentratie werd getest (500 nM), werd de BNP-kleur in rode kleur gehouden met een hoge stabiliteit. Nadat we hadden besloten dat de geschikte concentratie 60 nM antilichaam was, om de stabiliteit van anti-ESAT-6-antilichaam en BNP-conjugaten te controleren, probeerden we de NaCl-concentraties te verhogen. Zoals weergegeven in figuur 3b, is het bereide antilichaam-GNP-conjugaat (60 nM antilichaam met BNP) zeer stabiel, zelfs met de toevoeging van 1 M NaCl. Het spectrum in Fig. 3c toont ook hetzelfde resultaat als visuele detectie; de bereide anti-ESAT-6 antilichaam BNP-conjugaten behouden hun piek bij ~ 520, zelfs met een hoge concentratie NaCl, en tegelijkertijd leidt alleen het BNP tot aggregatie met 800 mM NaCl met het piekmaximum bij ~ 500 nm.

ESAT-6 antilichaam optimalisatie en stabiliteit. Verschillende concentraties anti-ESAT-6-antilichaam werden getest met 800 mM NaCl. een Aggregatie of dispersie van het BNP met het anti-ESAT-6-antilichaam (0 tot 500 nM); Pijl geeft het overgangsgebied aan voor de optimale antilichaamconcentratie. b Stabiliteit van 60 nM antilichaam-gecomplexeerd BNP met verschillende NaCl-concentraties (0,012 tot 1000 mM). c Spectra voor verschillende complexen. Pieken werden aangegeven met de respectievelijke gekleurde bollen

ESAT-6-detectie met behulp van pre-gecomplexeerd antilichaam door colorimetrische rode spectrale verschuiving en validatie van ESAT-6 biofouling

Omdat het antilichaam van 60 nM een uitstekende stabiliteit vertoont, hebben we aanvankelijk geprobeerd ESAT-6 te detecteren dat is gecomplexeerd met 60 nM anti-ESAT-6-antilichaam. ESAT-6 is het eiwit met een kleiner molecuulgewicht met een grootte van 6 kDa en goed gekozen voor de op colorimetrische gebaseerde test. Voorafgaand aan het uitvoeren van het detectie-experiment, hebben we de biofouling van ESAT-6 op het BNP-oppervlak gecontroleerd; omdat er een mogelijkheid is dat ESAT-6 zich aan het BNP bindt, kan dit leiden tot vals-positief of vals-negatief. Zoals getoond in Fig. 4, was in ESAT-6 met de concentratie tot 100 nM het BNP niet stabiel bij 800 mM NaCl, wat aangeeft dat ESAT-6 niet elektrostatisch aan het BNP-oppervlak bindt. Deze non-fouling duidde er ook op dat de aminozuursamenstelling van ESAT-6 een belangrijke rol speelt in deze test. Na deze bevestiging hebben we ESAT-6 gedetecteerd dat vooraf was gecomplexeerd met 60 nM anti-ESAT-6-antilichaam. Verschillende concentraties van ESAT-6 werden gecomplexeerd met de constante concentratie (60 nM) antilichaam en vervolgens toegevoegd aan het BNP. Ten slotte werd 800 mM NaCl toegevoegd om de aggregatie met de rode spectrale verschuiving te evalueren. Zoals weergegeven in figuur 5a (inzet), heeft de detectie van ESAT-6 van 0,5 nM tot 500 nM een duidelijke kleurverandering bevestigd met overgangen in vergelijking met de controle (met slechts 60 nM antilichaam). De kleur van de oplossingen is zelfs bij 0,5 nM van rood in blauw veranderd en bij 15 nM meer geïntensiveerd, en dit kan te wijten zijn aan de volledige verzadiging met ESAT-6. Het lijkt erop dat er geen antilichaam overblijft om te binden met het BNP, zelfs niet bij 0,5 nM. Verwijzend naar de grafische weergave van Fig. 5a, toont 15 tot 500 nM van ESAT-6 de volledige verzadiging. Uit figuur 5b wordt duidelijk bewezen dat het spectrum van het controle-experiment (geen ESAT-6-eiwit) een mooi profiel vertoont bij ~ -500 nm, terwijl met ESAT-6 met 0, 5 en 500 nM de spectra roodverschoven waren. Uit deze resultaten werd geconcludeerd dat we ESAT-6-eiwit kunnen detecteren vanaf 0,5 nM en toch naar lagere concentraties kunnen dalen vanwege de duidelijke blauwe kleur.

Test op ESAT-6-vervuiling op het BNP-oppervlak. Verschillende concentraties ESAT-6 werden gemengd met het BNP en na 30 min werd 800 mM NaCl toegevoegd. Schematische weergave wordt ook getoond. Het uiterlijk van een blauwe kleur geeft de aggregatie aan

ESAT-6-detectie bij hogere concentraties. een Grafische weergave voor de detectie van ESAT-6. Verschillende concentraties ESAT-6 werden gemengd met 60 nM antilichaam en na 30 minuten incubatie werd het BNP toegevoegd. Vervolgens werd 800 mM NaCl toegevoegd om de kleurverandering te induceren. ESAT-6 van 0,5 nM werd gedetecteerd met de duidelijke kleurverandering (rood naar blauw). De foto's zijn gemaakt met de digitale camera zoals in de afbeelding. b Spectrale veranderingen bij de golflengte van 400 tot 800 nm. Pieken werden aangegeven met de respectievelijke gekleurde bollen

Detectielimiet van ESAT-6 door de colorimetrische rode spectrale verschuiving

Aangezien 60 nM anti-ESAT-6-antilichaam een ​​duidelijke verbetering vertoonde voor de detectie van ESAT-6, hebben we, om de detectielimiet te achterhalen, de ESAT-6 verder verfijnd tot de laagste picomolaire (1,25 pM tot 5000 pM). ). Zoals getoond in figuur 6a, is er vanaf 1,25 pM ESAT-6 een initiatie van blauwe kleur vanwege de complexvorming tussen ESAT-6 en het antilichaam. Vanaf 2,5 pM is de kleur van de oplossing die in blauw is veranderd, geïntensiveerd en de kleurveranderingen behouden met verdere concentraties. In het controle-experiment (zonder ESAT-6) bleek de kleur van de oplossing rood te zijn, wat de specificiteit van het huidige experiment ondersteunt (figuur 6a). Dit resultaat werd ook bevestigd door het spectrum zoals weergegeven in figuur 6b. Met de controleoplossing is er geen verandering in het spectrum, maar van 1,25 tot 5 nM ESAT-6-eiwit waren de spectra rood verschoven naar 600 nm. Bij 5 nM ESAT-6 werd een volledige spectrale verschuiving waargenomen met piekmaxima. Op basis van deze experimentele resultaten konden we concluderen dat de detectielimiet van ESAT-6 rond de laagste picomolair (1,25 pM) ligt met behulp van antilichaam ESAT-6 pre-complex.

Detectielimiet van ESAT-6 door de op antilichamen gebaseerde colorimetrische test. een Grafische weergave voor de detectie van ESAT-6. Verschillende concentraties ESAT-6 werden gemengd met 60 nM antilichaam en na 30 minuten incubatie werd het BNP toegevoegd. Vervolgens werd 800 mM NaCl toegevoegd om de kleurverandering te induceren. ESAT-6-eiwit werd getitreerd van 1,25 pM tot 5000 pM. De foto's zijn gemaakt met de digitale camera zoals in de afbeelding. b Spectrale veranderingen bij de golflengte van 400 tot 800 nm. Pieken werden aangegeven met de respectievelijke gekleurde bollen

Verfijning met specificiteit

Omdat we ESAT-6 konden detecteren met 60 nM anti-ESAT-6-antilichaam, probeerden we vervolgens dezelfde detectie met een beetje hoge concentratie anti-ESAT-6-antilichaam tot 75 nM. De verkregen resultaten staan ​​in Fig. 7a. Er is gevonden dat een lichte kleurverandering optrad bij gebruik van 75 nM vooraf gecomplexeerd antilichaam bij 850 pM ESAT-6. We verhoogden de ESAT-6-concentratie tot 100 nM en we konden de voortgang in de kleurveranderingen naar blauw observeren. Met deze experimenten werd opgemerkt dat de detectielimiet in het nanomolaire bereik lag met behulp van 75 nM pre-gecomplexeerd antilichaam. Ten slotte hebben we, om de specificiteit van ESAT-6-binding te bevestigen, ook de vergelijkbare test getest met behulp van pre-complex van anti-ESAT-6 en CFP-10-eiwit van M. tuberculose . De resultaten zijn duidelijk te zien dat alleen ESAT-6 de specificiteit heeft en dat CFP-10 de juiste controle kan zijn (Fig. 7b). Over het algemeen werd uit de bovenstaande resultaten gerealiseerd dat de optimalisatie van de antilichaamconcentratie verplicht is om de gevoeligheid van de colorimetrische test te verbeteren.

ESAT-6-detectie met 75 nM anti-ESAT-6-antilichaam. een Vertegenwoordiging voor kleurveranderingen. Verschillende concentraties ESAT-6 werden gemengd met 75 nM antilichaam en na 30 minuten incubatie werd het BNP toegevoegd. Vervolgens werd 800 mM NaCl toegevoegd om de kleurverandering te induceren. ESAT-6 van 0,85 nM werd gedetecteerd met de duidelijke kleurverandering (rood naar blauw). De foto's zijn gemaakt met een digitale camera. b Spectrale veranderingen bij de golflengte van 400 tot 800 nm. Pieken werden aangegeven met de respectievelijke gekleurde bollen. Specificiteitstest werd uitgevoerd met CFP-10 en bleek een negatieve controle te zijn