Maghemiet-nanodeeltjes werken als nanozymen en verbeteren de groei en abiotische stresstolerantie in Brassica napus

Resultaten

Effect van deeltjes op planteigenschappen

Door ION's toe te voegen, verhoogden we de groei van koolzaad in vergelijking met het toevoegen van een voldoende hoeveelheid gechelateerd ijzer. De bladlengte vertoonde een statistisch significante toename in vergelijking met de controle, wat duidt op een toename in celdeling of celverlenging (figuur 1a). Voordat de planten aan droogte werden blootgesteld, was er een statistisch significante toename van het chlorofylgehalte, zoals gemeten met de SPAD-meter, wat wijst op een verhoogde fitheid van deze planten in vergelijking met controle (Fig. 1b).

Verschillende fysiologische parameters van planten gekweekt in potten met grond geïrrigeerd met voedingsstoffen of voedingsstoffen die ION's bevatten. een Individuele bladlengtetoename van voor tot na 5 dagen ION-behandeling (n = 16, p waarde = 0.053). b Chlorofylgehalte in de bladeren, gemeten met SPAD-meting (n = 16, p waarde = 0.000). Verschillende letters betekenen een statistisch significant verschil

Waterverlies vertoonde geen statistisch significant verschil, maar er was een tendens naar meer waterretentie bij behandelingen met ION's (figuur 2a). Versgewichten, die ook rekening houden met de groei van de planten, vertoonden altijd hogere waarden voor ION-behandelingen (Fig. 2b) en waren in sommige gevallen statistisch significant. Een experiment met langdurige droogte is bijvoorbeeld te zien in figuur 3.

Plantparameters na droogtestress. een Percentage van het plantgewicht dat water vormt. b Plantaardige biomassa na 5 dagen droogte (n = 8, p waarde = 0.127). Verschillende letters betekenen een statistisch significant verschil

Versgewicht van planten, gemeten na 5 dagen droogte. Statistisch significant verschil met 15 biologische replica's en p waarde 0,01

Aangezien de controle ook voldoende ijzer bevat, zouden grote verschillen in versgewicht uitzonderlijk zijn. Er werd waargenomen dat de met ION's behandelde planten tijdens droogte beter omgingen dan de controleplanten en beter herstelden na opnieuw water geven (Fig 4).

Foto's van planten na opnieuw water geven na 5 dagen droogtestress. een Controleplanten geïrrigeerd met voedingsoplossing. b Planten geïrrigeerd met voedingsoplossing die 0,8 mg/ml ION's bevat. c Planten geïrrigeerd met voedingsoplossing die 2 mg/ml ION's bevat

Effecten van ION's op de bladwaterstofperoxideconcentratie

De hoeveelheid waterstofperoxide in het blad na droogte werd aanzienlijk verminderd toen ION's werden toegevoegd aan de voedingsoplossing die werd gebruikt voor het water geven. De variatie was hoog in de 0,8 mg ml ⁻¹ behandeling; daarom is het verschil met de andere behandelingen niet statistisch significant. Het verschil tussen controle en de hoogste concentratie van 2 mg ml ⁻¹ is statistisch significant met een p waarde van 0,004 en gemiddeld 84% hoger bij de controlebehandeling (Fig. 5).

Hoeveelheid oplosbaar waterstofperoxide per gram bladweefsel van koolzaad, behandeld met een voedingsoplossing die ION's bevat en gedurende 5 dagen blootgesteld aan droogte (n = 16, p waarde = 0,004)

Effecten van ION's op lipideperoxidatie

Lipideperoxidatie met MDA-niveaus als proxy werd verminderd door toevoeging van ION's, met een 36% lagere gemiddelde concentratie van MDA in de bladeren van planten met 200 mg ION's toegevoegd. We voegden een positieve controle toe met dezelfde molaire concentratie van ijzer (III) ionen; de variatie was echter te groot om conclusies te trekken. Het gemiddelde van de lagere ION-concentratie was ook lager dan bij de controle, wat een trend laat zien naar verminderde lipideperoxidatie in de bladeren van koolzaad (Fig. 6).

Concentratie van het lipideperoxidatieproduct MDA in de bladeren van koolzaad behandeld met voedingsoplossing die ION's bevat en droogte gedurende 5 dagen (n = 8, p waarde = 0.052)

Opname van plantendeeltjes

Om de opname van deeltjes in bladweefsel te onderzoeken, hebben we het ijzergehalte van de bladeren gemeten met inductief gekoppelde plasma-atoomemissiespectroscopie (ICP-AES). Er werd inderdaad een statistisch significante toename van ijzer waargenomen bij behandelingen met maghemiet-nanodeeltjes. Interessant genoeg was de ijzerconcentratie verlaagd in bladeren die waren geïrrigeerd met overtollige ijzer(III)-ionen (Fig. 7).

IJzerconcentratie in bladeren van brassica-planten na behandeling met maghemiet-nanodeeltjes, in vergelijking met controle met dezelfde voedingsoplossing of dezelfde voedingsoplossing met een verhouding van 1:1 M ijzer (III) ionen. Verschillende letters duiden statistisch significant verschil aan (n = 15)

Om het verhoogde ijzergehalte als bewijs van de opname van deeltjes verder te bevestigen, hebben we de magnetisatie bij lage temperatuur in dezelfde bladeren gemeten. Een grotere magnetisatie werd waargenomen bij controle onder een sterk magnetisch veld, maar zonder magnetisch veld was de remanente magnetisatie groter in bladeren die waren behandeld met maghemiet-nanodeeltjes (figuren 8 en 9). Vanwege de kleine steekproefomvang en de grote variatie zijn de verschillen niet statistisch significant, maar de trend toont duidelijk de aanwezigheid van superparamagnetische ION's, aangezien de magnetisatie hoger is bij controle onder hoge magnetische velden, maar lager wanneer er geen magnetisch veld is. Het is vertroebeld door variatie, maar in bepaalde monsters was de aanwezigheid van ION's duidelijk zichtbaar (aanvullend bestand 1:figuur S2). Enerzijds zal bij voldoende lage temperatuur en voldoende hoog magnetisch veld de magnetisatie voor ijzerionen groter zijn dan die van ferrimagnetische IONen. Aan de andere kant, bij dezelfde lage temperatuur maar bij nul magnetisch veld, zal de remanente magnetisatie groter zijn voor ION's vanwege geblokkeerde magnetische momenten van nanodeeltjes.

Magnetisatie bij lage temperatuur (2 K) van verkoolde bladeren van planten die zijn behandeld met maghemiet-nanodeeltjes in vergelijking met controleplanten. Foutbalken tonen standaardfout van gemiddelde (n = 6)

Magnetisatie bij lage temperatuur (2 K) van verkoolde bladeren onder verschillende magnetische velden. De bovenstaande grafiek bij 10000 Oe heeft een p waarde van 0,8, en de onderstaande grafiek bij nulveld heeft een p waarde van 0,08 (n = 6)

Materiaalkarakteriseringen

De ION's geproduceerd door de methode van Cui et al. (2013) vormden een gel, wat wijst op een succesvolle productie van nanodeeltjes in de orde van ~-1-10 s nm. De gedroogde gel werd vermalen tot een poeder. De SEM met lage resolutie kan geen afzonderlijke deeltjes weergeven, maar de hiërarchische structuur van het poeder is duidelijk; de EDS van het monster detecteerde geen Y, alleen ijzer (Fig. 7).

Wanneer gedispergeerd in water, vormen de deeltjes aggregaten met een hydrodynamische grootte tot 500 nm, maar 84% van de geaggregeerde deeltjes is kleiner dan 300 nm en ten minste 11% is kleiner dan 50 nm. In absolute waarden zijn er volgens de Nanosight-metingen 4,28 × 10 ⁶ deeltjes kleiner dan 20 nm ml ⁻¹ , in de 50 keer verdunde dispersie die nodig is voor de meting (Fig. 8). Terugrekenen betekent dat er ongeveer 2 × 10 ⁸ . zijn deeltjes kleiner dan 20 nm ml ⁻¹ in de behandelingen.

De afbeeldingen gemaakt door AFM laten een vergelijkbaar patroon zien als de NTA gecombineerd met XRD vide infra, met deeltjesgroottes van enkele nanometers tot aggregaten van enkele honderden nanometers (Fig. 9).

De XRD van de deeltjes werd 1 jaar na productie verkregen en vertoont nog steeds een duidelijk patroon van maghemietstructuur, bewijs voor succesvolle maghemietstabilisatie (Fig. 10). De kristallietgrootte werd berekend op 3,8 nm met behulp van de Scherrer-vergelijking. Hoewel de structuur behouden is gebleven, heeft de introductie van 13% Y in gewicht natuurlijk invloed op de trillingstoestanden van de atomen (Aanvullend bestand 1:Figuur S3).

Scanning-elektronenbeeld van γ-Fe₂ O₃ gesynthetiseerd door middel van yttrium-gerichte sol-gel-synthese en een EDS-spectrum van hetzelfde materiaal

Discussie

Het voorgestelde gebruik van ION's als ijzermeststof is eerder onderzocht in andere systemen [17,18,19]. In dit onderzoek is voor het eerst getest of er een enzymatisch effect is van een vergelijkbare meststof, naast het effect van het verstrekken van de micronutriënt, ijzer, aan een belangrijke gewassoort. De controle kreeg een voldoende hoeveelheid gechelateerd ijzer. We testten ook een positieve controle, waarbij een molaire equivalente hoeveelheid ijzer (III) ionen werd aangevuld met de negatieve controle met een voldoende hoeveelheid plantaardig beschikbaar ijzer. Vandaar dat de positieve effecten van ION's die in onze experimenten worden gezien, voortkomen uit de eigenschappen van de ION's. We willen suggereren dat het de bekende enzymatische effecten van ION's zijn die een rol spelen [23, 25, 26]. Andere mechanismen kunnen nog steeds niet worden uitgesloten - ION's kunnen ook interageren met eiwitten, lipiden en andere biomoleculen [27], of het kan zijn dat de nanodeeltjes natuurlijke ijzerionen op het oppervlak absorberen en zo schadelijke Fenton-reacties verminderen. Het feit dat de waterstofperoxidegehaltes van bladeren bij de ION-behandelingen werden verlaagd, is op zich al een indirect bewijs van de opname van nanodeeltjes. Samen met een verhoogde ijzerconcentratie en veranderde magnetisatie in maghemiet wordt het beeld completer. De positieve controle met ijzer(III)-ionen had een verlaagd ijzergehalte in de bladeren, wat aangeeft dat de planten het vermogen hebben om de opname van ijzerionen te verminderen als verdedigingsmechanisme. Dit suggereert verder dat de verhoogde ijzerconcentratie in de bladeren bij maghemietbehandelingen inderdaad nanodeeltjes zijn, die niet zo giftig zijn voor de plant als verhoogde niveaus van ijzerionen kunnen zijn. De magnetische metingen vertonen een superparamagnetisch gedrag en geblokkeerde magnetische momenten van nanodeeltjes bij lage temperaturen, typisch voor zeer kleine γ-Fe₂ O₃ in de met maghemiet behandelde bladeren [28], wat duidelijk de opname van nanodeeltjes aantoont. De minuscule hoeveelheid toegediende Y mag geen effect hebben op de planten; er is weinig bekend over de effecten van Y op planten, maar Fu et al. (2014) hebben vastgesteld dat 2 mg L ⁻¹ Y was de mediane letale dosis (LD50) in een hydrocultuursysteem, en Maksimovic et al. (2014) begonnen toxische effecten te zien op 10 ⁻⁵ mol L ⁻¹ J [29, 30]. In de hoogste concentratie die in onze experimenten is gebruikt, is een hoeveelheid van ongeveer 50 mg (5,6 10 ⁻⁴ mol) Y werd per pot door irrigatie aan de grond toegevoegd, waarvan naar verwachting slechts een fractie zal worden opgenomen. Wat wordt opgenomen, moet niet direct beschikbaar zijn als ionen, maar moet worden gebonden in de maghemietdeeltjes. Het doel van de introductie van Y in de synthese is om de oplosbaarheid van maghemiet-nanodeeltjes te verminderen en ook om transformatie in hematiet, een minder enzymatische vorm van ijzeroxide, te voorkomen. Het is ongetwijfeld gunstig om verhoogde katalase-activiteit te hebben tijdens stresscondities [31], aangezien bekend is dat een hele reeks stresscondities toxische ophopingen van H₂ veroorzaken. O₂ [32]_. Verder is het steeds duidelijker geworden dat H₂ O₂ dienen ook als een signaalmolecuul voor stress [32, 33]. Verhoogde biomassaproductie moet nog worden bevestigd, bij voorkeur ook kijkend naar de opbrengsten en kwaliteit van oliezaden. Andere kenmerken, zoals een hogere snelheid van bladgroei, een zeer goede eigenschap in een agrarische omgeving waar concurrentie tegen onkruid cruciaal is, kunnen gemakkelijk in overweging worden genomen. Het is aangetoond in Arabidopsis dat nano nulwaardige ijzerdeeltjes extrusie van protonen in de apoplast van bladeren kunnen induceren en daardoor turgor-gedreven celwandexpansie mogelijk maken [34]. Hetzelfde effect werd ook waargenomen bij wortels, wat ook gunstig zou kunnen zijn tijdens droogtestress [35]. Ze zagen ook een toename van de huidmondjes van de bladeren, wat tot waterverlies zou kunnen leiden, maar bij het meten was er slechts een marginaal verschil met de controle. Het is een bekende paradox dat de relatie tussen stomatale opening en watertranspiratie niet lineair is [36]. Deze relatie wordt ook sterk beïnvloed door de omgeving door bijvoorbeeld relatieve vochtigheid of wind [37]. Hoewel nulwaardige nanodeeltjes natuurlijk niet als hetzelfde moeten worden beschouwd als maghemiet, moet het mechanisme voor bladverlenging dat in onze experimenten wordt gezien, worden onderzocht. Ghafariyan et al. (2013) observeerden, net als wij, een toename van de chlorofylconcentratie in de bladeren na toevoeging van ION's in vergelijking met een negatieve controle zonder helemaal geen ijzer. In vergelijking met gechelateerd ijzer was er geen verschil. Het toevoegen van gelijke hoeveelheden gechelateerd ijzer als ION's zal echter resulteren in meer plantaardig beschikbaar ijzer, aangezien in het geval van deeltjes grote delen van het ijzer worden opgeslagen in de kristalstructuren. Daarom is er een mogelijkheid dat de planten die alleen met ION's zijn bemest, daadwerkelijk last hebben van ijzertekort. We vonden grotere hoeveelheden chlorofyl in de bladeren (volgens SPAD-metingen, zie Fig. 1) wanneer ION's als hulpstof aan het gecheleerde ijzer werden toegevoegd. We hebben ook een verminderde hoeveelheid waterstofperoxide en MDA in de bladeren gemeten, na droogte, toen we ION's toevoegden. Rui et al. (2016) hebben geen waterstofperoxide gemeten, maar MDA en enzymen gerelateerd aan oxidatieve stress. Ze suggereerden dat oxidatieve stress niet optreedt door toevoeging van ION's, en inderdaad, ze vonden net zo goed een verminderde hoeveelheid MDA in de bladeren, vergeleken met gechelateerd ijzer, op 10 mg kg ⁻¹ concentratie. In de wortels zagen ze een vermindering van MDA naarmate ze de concentratie van ION's verhoogden. Ze maten ook een verminderde hoeveelheid superoxide-dismutase- en peroxidase-activiteit in vergelijking met gechelateerd ijzer, wat suggereert dat onze hypothese dat ION's in vivo kunnen werken als reactieve zuurstofvangers, misschien juist is. Reactieve zuurstofverwijdering werd verder aangetoond door onze gemeten reductie van waterstofperoxide in de bladeren van Brassica napus . Dit verklaart de verhoogde weerstand tegen droogte die wordt waargenomen bij toevoeging van ION's.

Conclusies

Onze experimenten hebben bewijs geleverd voor het mechanisme van ION's die werken als nanozymen in planta , onthullende koppeling tussen een afname van het waterstofperoxidegehalte in de bladeren van Brassica napus en introductie van ION's. De verhoogde weerstand tegen droogte die wordt waargenomen bij toevoeging van ION's kan dus worden gerelateerd aan het verlichten van oxidatieve stress.

Methoden

Experimentele voorwaarden en ontwerp

Brassica napus zaden, van de lentekoolzaadvariëteit Larissa (Scandinavian Seed AB, Lidköping, Zweden), werden 3 dagen gesteriliseerd en ontkiemd op agarplaten voordat zaailingen van vergelijkbare grootte werden overgebracht naar potten met gesteriliseerde S-Soil (Hasselfors-tuin, Örebro, Zweden) . Het is een bodem voor professionele groei van zaailingen met een lage hoeveelheid van alle macro- en micronutriënten, perliet voor beluchting, groeistimulerende humuszuren en een pH van 6. De planten mochten 7 dagen in de potten staan, geïrrigeerd met gedeïoniseerd water. Voordat de behandelingen werden gestart, werden de planten verdeeld over trays, zodat de plantgrootte zo constant mogelijk was. Vanaf dag zeven, na het overzetten in potten, werden de planten geïrrigeerd met voedingsoplossing, voedingsoplossing met extra FeCl₃ of voedingsoplossing met verschillende concentraties γ-Fe₂ O₃ ION's. Elke pot werd elke dag met 40 ml geïrrigeerd. De planten werden gekweekt in een groeikamer met 16 uur licht (180 E m ⁻² s ⁻¹ ) en 8 uur duisternis. De temperatuur werd ingesteld op 25°C tijdens bestraling en 22° tijdens het donker en de relatieve vochtigheid op 65%. De planten werden gekweekt in potten van 8 × 8 cm in trays met elk acht potten. Elke behandeling had twee trays en 16 biologische replica's. De trays werden elke dag in een roterende volgorde verplaatst om eventuele variatie in de kamer te compenseren. De behandeling duurde 5 dagen en voegde in totaal 200 ml toe van 0,5, 0,8, 1 of 2 mg ml ⁻¹ , totaal respectievelijk 100, 160, 200 of 400 mg per plant. Na de 5 dagen van het toevoegen van ION's werden alle behandelingen gedurende nog eens 5 dagen bewaterd met voedingsoplossing (aanvullend bestand 1:tabel S1) voordat 4 dagen droogte begon. Na 4 dagen droogte werden waterstofperoxide- en lipideperoxidatiemetingen uitgevoerd en werden de planten opnieuw 3 dagen bewaterd met dezelfde voedingsoplossing om het herstel te bestuderen. Het experiment werd vier keer herhaald.

Synthese en karakterisering van nanodeeltjes

De maghemietdeeltjes werden geproduceerd volgens de methode van [38] met ongeveer 13 gew.% yttrium (Y) en gekarakteriseerd door röntgendiffractie (XRD), scanning-elektronenmicroscopie (SEM), nanodeeltjes-trackinganalyse (NTA), infraroodspectroscopie (FTIR), thermogravimetrische analyse (TGA) en atoomkrachtmicroscopie (AFM). De SEM-beelden werden verkregen met een Hitachi TM1000, met Oxford μDeX elektronendispersieve röntgenspectrometer (EDS). De hydrodynamische grootte werd gemeten door middel van nano-tracking-analyse (NTA) op de Nanosight 300 (Fig. 11). Een Perkin-Elmer Spectrum 100 werd gebruikt om Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) in kaliumbromide (KBr)-pellets uit te voeren. Voor thermogravimetrische analyse (TGA) werd een Perkin-Elmer Pyris 1 gebruikt en voor atomaire krachtmicroscopie (AFM), een Bruker FastScan (Fig. 12). De XRD werd uitgevoerd op een Bruker Smart ApexII multifunctionele diffractometer met molybdeenbron; de kristallietgrootte werd berekend met sherrer-vergelijking met behulp van de grootste piek bij een hoek van 2 ° 16.197 met een half maximum van de volledige breedte (FWHM) van 1,01358489355378 berekend door de Origin-softwarepiekzoekerfunctie (Fig. 13). De gedroogde ION's werden gesuspendeerd in een voedingsoplossing, met 3,4 mg L ⁻¹ gechelateerd ijzer, hetzelfde gebruikt als controle. Voor een volledige lijst van alle voedingsstoffen, zie Aanvullend bestand 1:Tabel S1.

Hydrodynamische deeltjesgrootteverdeling in water, gemeten met NTA, van γ-Fe₂ O₃ gesynthetiseerd door middel van yttrium-gerichte sol-gel-synthese. Waarden worden gemiddeld van vier herhaalde metingen, en het gebied binnen de dunne lijnen geeft de gemiddelde fout weer

Maghemite nanodeeltjes gesynthetiseerd door middel van yttrium-gerichte sol-gel, gedispergeerd op siliciumwafel en afgebeeld met AFM. Hetzelfde beeld wordt weergegeven in 3D en 2D

Een poederdiffractogram van de geproduceerde maghemiet-nanodeeltjes. De pieken komen overeen met de posities van standaardmaghemiet uit de database, gezien als een punt met een druppellijn aan de basis van de figuur. De kristallietgrootte werd berekend op basis van de grootste piek bij 16.197 2θ graden hoek

Metingen van planteigenschappen

Voordat met de behandeling werd begonnen, werd de lengte van het langste blad, het eerste echte blad, van elke plant gemeten. Later, na 5 dagen opeenvolgende irrigatie met ION's in voedingsoplossing of alleen voedingsoplossing, werd hetzelfde blad opnieuw gemeten. De resultaten worden gerapporteerd als procentuele stijging. Bladchlorofyl werd bepaald door SPAD-metingen met de Minolta SPAD-meter, voor tijdens en na de behandeling en vervolgens na droogte. Drie metingen, op twee bladeren per plant, werden gemiddeld voor elk van de 16 biologische replica's. Ten slotte werd de bovengrondse biomassa van alle planten gewogen en in aluminiumfolie geplaatst om 72 uur bij 110 ° C te worden gedroogd.

IJzergehalte en magnetische metingen

Na vijf dagen droogte werd het experiment beëindigd en werd al het bovengrondse plantenweefsel 24 uur bij 450 ° C verast. Nadat de as was gehomogeniseerd, werd per monster 10 mg afgewogen en een nacht op een shaker opgelost in 3 ml zoutzuur 36%. Vervolgens werden de monsters verdund met 44,74 ml 10% ethanol in Milli-Q-water en vervolgens gemeten op ijzer met ICP-AES bij 238,204 nm. Voor magnetische metingen werd dezelfde as in de monsterhouder geplaatst en het exacte gewicht voor elk monster werd gewogen met een precisiebalans. Vervolgens werd het monster afgekoeld tot 2 K en werd een magnetische veldzwaai van 10.000 tot 0 Oersted uitgevoerd op een supergeleidende kwantuminterferentie-apparaat (SQUID) magnetometer. Het magnetische moment als gevolg van de monsterhouder werd afgetrokken van het gemeten magnetische moment voordat het werd genormaliseerd met het gewicht van ijzer in het monster.

Waterstofperoxide-metingen

Waterstofperoxide in de bladeren werd gemeten met de eFOX-methode gerapporteerd door [39]. De 16 planten werden samengevoegd tot vier biologische replica's met elk vier planten. Van het jongste en nog verse blad van elke plant werd vijftig milligram genomen. Vervolgens werd 200 mg bladmateriaal verpoederd in een voorgekoelde vijzel in vloeibare stikstof. Aan het poeder voegden we 4 ml 100 mM fosfaatbuffer (pH 6,9) toe en mortelden het ijs tot een homogene vloeistof. Van deze homogene vloeistof brachten we 1900 μl over in een Eppendorf-buisje van 2 ml en voegden 20 μl 25 mM ferroammoniumsulfaat (Mohrs-zout), 20 μl 10 mM sorbitol, 20 μl 10 mM xylenoloranje, 20 μl 99 % ethanol en 20 μl 250 mM zwavelzuur. Voor elk monster werd een volledig zichtbaar absorptiespectrum genomen, maar het verschil tussen 550 en 800 nm werd gebruikt voor de kwantificering van waterstofperoxide. Er is een kalibratiecurve gemaakt van 2 tot 40 μM waterstofperoxide met R ² waarde van 0,9946.

Lipideperoxidatie

Lipideperoxidatie werd gemeten volgens de methode van [40]. Monsters werden op dezelfde manier geoogst als voor waterstofperoxidemetingen, behalve dat ze werden gehomogeniseerd in 4 ml 0,1% w /v trichloorazijnzuur (TCA). De absorptie werd gemeten bij 532 nm en gecorrigeerd voor niet-specifieke troebelheid door de absorptie bij 600 nm af te trekken. De extinctiecoëfficiënt van 155 mM cm ⁻¹ werd gebruikt om de malondialdehydeconcentratie (MDA) te berekenen.

Statistische analyse

Alle statistieken werden uitgevoerd in Minitab 17-software. Alle gegevens werden door een one-way ANOVA met Fisher-test voor groepering geleid. Studenten t test werd uitgevoerd om specifieke p . te vinden waarden tussen groepen die statistisch significante verschillen blijken te hebben.