Bevordering van SH-SY5Y-celgroei door gouden nanodeeltjes gemodificeerd met 6-mercaptopurine en een neuron-penetrerend peptide

Abstract

Er is veel energie gestoken in de ontdekking van effectieve biomaterialen voor zenuwregeneratie. Hier rapporteerden we een nieuwe toepassing van gouden nanodeeltjes (AuNP's) gemodificeerd met 6-mercaptopurine (6MP) en een neuron-penetrerend peptide (RDP) als een neurofisch middel om de proliferatie en neurietgroei van menselijke neuroblastoom (SH-SY5Y) cellen te bevorderen. Wanneer de cellen werden behandeld met 6MP-AuNPs-RDP-conjugaten, vertoonden ze een hogere metabole activiteit dan de controle. Bovendien werden SH-SY5Y-cellen getransplanteerd op het oppervlak dat was gecoat met 6MP-AuNPs-RDP om het effect van de ontwikkeling van neurieten te onderzoeken. Er kan worden geconcludeerd dat 6MP-AuNPs-RDP zich aan het celoppervlak hechtte en vervolgens in cellen werd geïnternaliseerd, wat leidde tot een significante toename van de groei van neuriet. Hoewel met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen werden teruggewonnen uit bevroren opslag, behielden de cellen nog steeds een constante groei, wat aangeeft dat de cellen een uitstekende tolerantie hebben voor 6MP-AuNPs-RDP. De resultaten suggereerden dat de 6MP-AuNPs-RDP veelbelovend potentieel had om te worden ontwikkeld als een neurofisch nanomateriaal voor neuronale groei.

Achtergrond

Bevordering van neuronale celproliferatie en neurietgroei is belangrijk bij zenuwregeneratie [1, 2], waarvoor veel inspanningen zijn geleverd om neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD) en beroertes te behandelen [3 , 4]. In een aantal onderzoeken is aangetoond dat oppervlakte-eigenschappen van materialen de celmorfologie kunnen beïnvloeden, en zelfs celreplicatie en -differentiatie kunnen verstoren/bevorderen, wat grote beloften inhoudt in de regeneratieve geneeskunde en de ontwikkeling van een nieuwe strategie van nanomaterialen met actieve biologische functionaliteit als neurofische middelen [5 , 6].

Onder de bestaande biomaterialen worden gouden nanomaterialen gebruikt in een breed scala aan biologische toepassingen, waaronder detectie, labeling, medicijnafgifte en beeldvorming, vanwege hun gemakkelijke synthese, gemak voor oppervlaktefunctionalisatie, lage toxiciteit, goede stabilisatie en biocompatibiliteit [7, 8]. Een eerdere studie meldde bijvoorbeeld dat gouden nanostaafjes geassocieerd met laserblootstelling met laag vermogen de toename van de neurietlengte tot 25 μm van NG108-15 neuronale cellen stimuleerde in vergelijking met de controle [9].

6-Mercaptopurine (6MP; Fig. 1a), een ontstekingsremmend medicijn, is gebruikt om het oppervlak van gouden nanodeeltjes (AuNP's) te functionaliseren om 6MP-gemodificeerde AuNP's (6MP-AuNP's) te vormen via een Au-zwavelbinding [10] . Er werd gemeld dat 6MP-AuNP's werden gebruikt om de 6MP-concentratie in oplosmiddel kwantitatief te analyseren via een aan- en uitschakelmechanisme [11]. Er zijn echter geen gegevens die het effect van 6MP-AuNP's op cellen aantonen.

Schema van experimentele procedure. een 6-Mercaptopurine-structuur. b Experimentele procedure. De deeltjes werden gesynthetiseerd bij pH 9,0 en leken geaggregeerd bij pH 7,4. Toen de deeltjes werden toegevoegd aan de SH-SY5Y-celmedia, werden ze geïnternaliseerd in de cellen en gestimuleerde celgroei

Hier hebben we neuronale cellijn gebruikt om de interactie van 6MP-AuNP's en cellen te onderzoeken, omdat het algemeen bekend is dat neuronale cellen sterk worden beïnvloed door de eigenschap van kweeksubstraten. Onder neuronale cellijnen wordt menselijke neuroblastoom (SH-SY5Y) cel beschouwd als een veelgebruikt modelsysteem vanwege de hoge gevoeligheid voor omgevingsstimulatie en het belang voor functionele biomaterialen in neuraal onderzoek. Om de opname-efficiëntie van 6MP-AuNP's door neurale cellen te verhogen, werd bovendien een neuron-targeting peptide (RDP) aan het deeltjesoppervlak gekoppeld om een 6MP-AuNPs-RDP-conjugaat te vormen. De resultaten suggereerden dat het conjugaat een duidelijke neurofische activiteit vertoonde, maar geen antiproliferatief effect van 6MP, wat leidde tot een significante toename van celproliferatie en neurietgroei.

Methoden/experimenteel

Synthese van 6MP-AuNPs-RDP-conjugaat

Met citraat gecoate AuNP's met een grootte van 20 nm werden gesynthetiseerd door de reductiemethode. Kortom, een waterige oplossing van HAuCl₄ ·3H₂ O (100 ml, 0,01%) werd 30 minuten onder krachtig roeren verwarmd, waarna citraatnatriumoplossing (10 ml, 38,8 mM) snel werd toegevoegd aan de HAuCl₄ oplossing. Het mengsel werd nog 30 min onder terugvloeikoeling gekookt totdat een dieprode oplossing was verkregen, en op natuurlijke wijze afgekoeld tot kamertemperatuur.

6MP-AuNP's werden bereid door AuNP's (0,33 mM) en 6MP-oplossing (eindconcentratie 0,046 nM) gedurende 5 uur bij kamertemperatuur te mengen volgens een eerder rapport [12]. Vervolgens werd het mengsel gecentrifugeerd bij 17.000g gedurende 30 min. Vervolgens werd het supernatant weggegooid en werd de pellet (6MP-AuNP's) opnieuw gesuspendeerd en driemaal gewassen met gedeïoniseerd water.

Om RDP-gemodificeerde 6MP-AuNP's te verkrijgen, werden RDP (FAM w/ CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRRRC; gesynthetiseerd door Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) en 6MP, met een respectievelijke eindconcentratie van 0,023 nM, gelijktijdig toegevoegd aan de AuNP-oplossing (0,33 mM) gedurende 5 uur en vervolgens gecentrifugeerd bij 17.000g gedurende 30 min. Als controle werd een FAM-gelabeld scramble-peptide (FAM-SP; GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC) gesynthetiseerd (Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) en parallel werd 6MP-AuNPs-SP-FAM bereid. Daarna werd het supernatant van de deeltjes weggegooid en werden de deeltjes respectievelijk gewassen met gedeïoniseerd water. De deeltjesoplossingen werden respectievelijk met 0,1 M NaOH op pH 9,0 gebracht en vervolgens door spuitfilters van 0,22 μm gevoerd en voor gebruik bij 4 °C bewaard.

Kenmerken van de deeltjes

Absorptiespectra werden gemeten bij kamertemperatuur met een UV/vis-spectrofotometer (UV-2450, Shimadzu Corp, Kyoto, Japan) om optische absorptie van de deeltjes te detecteren. De deeltjesgrootte en de zeta-potentiaal van de deeltjes werden respectievelijk gemeten met behulp van een dynamisch lichtverstrooiingsapparaat (DLS) (Zetasizer Nano ZS; Malvern) na verdunning met gedeïoniseerd water. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM; Shimadzu) werd gebruikt om de deeltjesstructuur te observeren.

Celcultuur

SH-SY5Y-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en F-12 medium met een verhouding van 1:1. De media werden respectievelijk aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 100 eenheden/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine. De cellen werden op 37 °C gehouden met 5% CO₂ in een bevochtigde incubator (Thermo Fisher Scientific, VS). Alle reagentia voor celcultuur werden gekocht bij HyClone (VS).

Celopname

SH-SY5Y-cellen werden uitgezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/put. Toen de celconfluentie 60% bereikte, werden FAM-gelabelde 6MP-AuNPs-RDP en 6MP-AuNPs-SP met een eindconcentratie van 0, 25 μg / ml respectievelijk toegevoegd aan de celmedia voor een incubatie van 2 uur. Vervolgens werden de celmedia weggegooid en vervangen door verse media. De cellen werden waargenomen en gefotografeerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Olympus, Japan).

Impact van 6MP-AuNPs-RDP op neuronale groei

SH-SY5Y-cellen werden uitgezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen/putje 's nachts. Vervolgens werden RDP-6MP-AuNP's met verschillende concentraties (0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 g / ml) respectievelijk gedurende een incubatie van 24 uur aan de media toegevoegd. Celaantallen werden geteld met behulp van een geautomatiseerde celteller (Bio-Rad, VS).

Ook werd celmetabolische activiteit gemeten door 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) test volgens het vorige rapport [13]. In het kort werden SH-SY5Y-cellen uitgezaaid in platen met 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/putje en gedurende een nacht geïncubeerd in media die 10% FBS bevatten. Vervolgens werden de deeltjes respectievelijk gedurende 24 uur aan de media toegevoegd. De cellen werden driemaal gewassen met PBS, vervolgens werden 100 L verse media en 10 μL MTT (5 mg/ml in PBS-buffer) aan elk putje toegevoegd. Na een incubatie van 4 uur werden de media verwijderd en werd 200 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd om het geproduceerde formazan op te lossen. De absorptie van supernatant werd gemeten bij 490 nm met behulp van een microplaatlezer (Bio-Rad, VS). Cellen zonder toevoegingen worden als blanco gebruikt en de cellen met alleen oplosmiddel (0,1 M NaOH (pH 9,0) werden ingesteld op pH 7,4 met 0,1 M HCl) als controle. De relatieve celmetabolische activiteit werd berekend als metabolische activiteit (%) =OD₄₉₀ (sample-blank)/OD₄₉₀ (controle-blanco). Elke waarde is het gemiddelde van vier onafhankelijke experimenten.

Om het effect van 6MP-AuNPs-RDP op de groei van neurieten te bepalen, werden SH-SY5Y-cellen getransplanteerd in platen met 6 putjes en gekweekt tot 30% confluentie. Vervolgens werden de cellen eenmaal per dag gedurende 3 dagen behandeld met 6MP-AuNPs-RDP (0,25 μg/ml). De neurietlengtes werden waargenomen onder een optische microscopie (Olympus, Japan) en berekend met behulp van een ImageJ-software [14].

Celproliferatie op het oppervlak gecoat met 6MP-AuNPs-RDP

6MP-AuNPs-RDP werden homogeen uitgeplaat op de bodems van kweekschalen met een diameter van 3,5 cm, waarna de cellen werden getransplanteerd op de met deeltjes beklede schalen. Na incubatie werden de cellen waargenomen onder de optische microscopie en werd de lengte van de neurieten geteld. De cellen met alleen oplosmiddel werden als controle gebruikt. Elk experiment werd vier onafhankelijke keren herhaald en 200 neurieten werden gemiddeld voor de berekening van de lengte van de neurieten.

Statistische analyse

Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. De gegevens werden geanalyseerd met een computerprogramma door middel van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door Dunnett's meervoudige bereiktest, met SPSS 13.0-software. Verschillen met p < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Uiterlijk en kenmerken van de nanodeeltjes

De waterige oplossing van AuNP's vertoonde een scharlakenrode kleur onder zichtbaar licht (Fig. 2a, 0 s). Na de toevoeging van 6 MP werd de kleur geleidelijk donker wanneer 6 MP werd geconjugeerd aan AuNP's, en ten slotte verscheen na 5 uur reactie een blauwzwarte neerslag van 6 MP-AuNP's. De precipitatie kon worden opgelost door de pH in te stellen op 9,0, en op dat moment vertoonde de waterige oplossing van 6MP-AuNP's een roze kleur. Neerslag zou opnieuw worden gevormd wanneer de pH werd ingesteld op pH 7,4.

Reactieproces en kenmerken van de nanodeeltjes. een Reactieproces voor het bereiden van 6MP-AuNP's. Nadat 6 MP aan de AuNP-oplossing was toegevoegd, veranderde de kleur van de oplossing en werd in 5 uur geleidelijk neerslag gevormd. b 6MP-AuNPs-RDP-precipitatie werd opgelost toen de pH werd ingesteld op 9,0 met 0,1 M NaOH. c DLS-meting van de grootteverdeling van de deeltjes. d Zeta-potentieel van AuNP's, 6MP-AuNP's en 6MP-AuNPs-RDP. e Deeltjesstructuren onder TEM

6MP-AuNPs-RDP werd bereid door de AuNP's te conjugeren met thiolgroepen van 6MP of RDP bij pH 9,0. De waterige oplossing van 6MP-AuNPs-RDP vertoonde dezelfde roze kleur als die van de 6MP-AuNP-oplossing (figuur 2b). Toen de pH van de 6MP-AuNPs-RDP-oplossing werd ingesteld op 7,4, sloegen de deeltjes neer op de bodem van de oplossing.

Grootte en zeta-potentiaal van 6MP-AuNP's en 6MP-AuNPs-RDP-oplossing (pH 9, 0) werden respectievelijk onderzocht door DLS (figuur 2c). De gegevens toonden aan dat de gemiddelde grootte van 6MP-AuNPs-RDP iets groter was dan die van 6MP-AuNPs (24,6 versus 20,5 nm), terwijl het zeta-potentieel van de eerste significant hoger was dan de laatste (-25,8 versus -37,2 mV), wat suggereert dat de kationische RDP de oppervlaktepotentiaal van het deeltje verhoogde. De TEM-afbeeldingen lieten zien dat beide nanodeeltjes bolvormig waren (Fig. 2d).

Celopname van de nanodeeltjes

Toen de deeltjesoplossingen op pH 7,4 werden ingesteld en aan het celmedium werden toegevoegd, begonnen de deeltjes te aggregeren en zonken geleidelijk naar de bodem van putjes. 30 minuten later verscheen echter een duidelijke blanco plaque rond de cellen en de opening van met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen had minder deeltjesaggregatie dan die van 6MP-AuNP's (figuur 3a). Er werden ook meer nanodeeltjes waargenomen in de cellen die waren behandeld met 6MP-AuNPs-RDP in vergelijking met de cellen die waren behandeld met 6MP-AuNPs.

Celopname van de nanodeeltjes. een 6MP-AuNP's en 6MP-AuNPs-RDP-oplossingen van 0, 25 μg / ml werden respectievelijk bijgesteld tot pH 7,4 en toegevoegd aan de celmedia voor een incubatie van 30 minuten. De deeltjes werden geïnternaliseerd in SH-SY5Y-cellen of geprecipiteerd op putbodems. b Schematisch diagram van 6MP- en fluorescentie-gelabelde peptide-gemodificeerde AuNP. Nadat de SH-SY5Y-cellen 2 uur met de deeltjes waren geïncubeerd, werden foto's gemaakt (c ) en fluorescentie-intensiteit (d ) was gemeten. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De waarden werden gemiddeld voor vier onafhankelijke experimenten. ^** p < 0,01 vergeleken met de met 6MP-AuNPs-SP behandelde cellen

Om verder te identificeren dat de deeltjes de neuronale cellen zouden kunnen binnendringen, werden met fluorescentie gemerkte peptiden geconjugeerd met de deeltjes (figuur 3b). Na 2 uur incuberen van de cellen met deze nanodeeltjes, werd een sterke fluorescentie waargenomen in de met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen, terwijl een relatief zwakke groene fluorescentie zichtbaar was in de met 6MP-AuNPs-SP behandelde cellen. (Fig. 3c). Het resultaat van fluorescentie-intensiteitsmeting met fluorescentiespectrometer (Hitachi Ltd. Co. Tokyo, Japan) toonde aan dat met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen een significant hogere fluorescentie-intensiteit hadden dan die van de met 6MP-AuNPs-SP behandelde cellen (Fig. 3d ), wat suggereert dat RDP, een type celpenetrerende peptiden (CPP's), de cellulaire opname-efficiëntie van het deeltje zou kunnen verhogen.

Effecten van de nanodeeltjes op neuronale groei

Om te onderzoeken of de deeltjes effecten hadden op de neuronale groei, werden zowel de MTT-assay als het tellen van cellen gebruikt om de celmetabolische activiteit en aantallen te meten na incubatie van cellen met de deeltjes gedurende 24 uur. De resultaten gaven aan dat RDP alleen de celgroei niet beïnvloedde, terwijl 6MP-AuNP's-RDP en 6MP-AuNP's bij de respectieve concentraties boven 0,125 en 0,5 μg / ml, de celmetabolische activiteit en celaantallen op een dosisafhankelijke manier verhoogden (Fig. 4a,b). Ook vertoonden met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen een hogere metabolische activiteit dan met 6MP-AuNPs behandelde cellen, wat waarschijnlijk verband hield met de hogere celpenetratie-efficiëntie van 6MP-AuNPs-RDP dan 6MP-AuNPs.

De deeltjes verhoogden de metabolische activiteit van de cel (a ) en cijfers (b ), en de concentratie van 6MP-AuNP's en 6MP-AuNPs-RDP varieerde van 0 tot 1,0 μg/ml. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De cellen met alleen oplosmiddel {0,1 M NaOH (pH 9,0) is ingesteld op pH 7,4 met 0,1 M HCl} werden als controle gebruikt. De waarden werden gemiddeld voor vier onafhankelijke experimenten. ^* p < 0.05, ^** p < 0,01 vergeleken met met RDP behandelde cellen, ^# p < 0.05, en ^## p < 0,01 vergeleken met de met 6MP-AuNPs behandelde cellen

Effecten van de nanodeeltjes op de lengte van neurieten

Behalve dat de deeltjes de metabolische activiteit van de cel konden verhogen, werd ook de impact van de deeltjes op de lengte van de neurieten waargenomen bij hoge concentraties (1 μg/ml) van de deeltjes. De afbeeldingen (Fig. 5a) toonden aan dat de geaggregeerde nanodeeltjes zich op de bodem van de putjes vestigden en dat er een groter blanco plaque-gebied verscheen rond de met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen.

De nanodeeltjes bevorderden de groei van neurieten. Afbeeldingen (a ) en neurietlengte (b ) nadat de cellen respectievelijk 24 uur waren behandeld met RDP, 6MP-AuNP's en 6MP-AuNPs-RDP. De cellen met alleen oplosmiddel werden als controle gebruikt. De waarden werden gemiddeld voor 200 neurieten. ^* p < 0.05 en ^** p < 0,01 vergeleken met de controle

Na de 24-uurs incubatie toonden de resultaten aan dat de met de deeltjes behandelde cellen langer neuriet hadden dan de controlecellen, terwijl er geen significant verschil was tussen met RDP behandelde cellen en de controle. Bovendien was de neuritis van met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen opmerkelijk langer dan die van met 6MP-AuNPs behandelde cellen (Fig. 5b).

Uit het resultaat van Fig. 5 doodde 6MP alle SH-SY5Y-cellen vanwege de cytotoxiciteit ervan; dus hebben we geen 6MP gebruikt om de plaat te coaten. Ook, zoals weergegeven door Fig. 3, 4 en 5, een relatief kleine hoeveelheid 6MP-AuNP's die cellen binnenkwamen, en zowel de lengte van de neurieten als het aantal cellen waren duidelijk lager dan 6MP-AuNPs-RDP. Daarom werd 6MP-AuNPs-RDP gekozen voor de verdere studie om het effect op celgroei te onderzoeken.

Celproliferatie en neurietgroei na herhaalde toediening van 6MP-AuNPs-RDP

Om de resultaten van 6MP-AuNPs-RDP op celproliferatie en neurietgroei verder te identificeren, werd 6MP-AuNPs-RDP driemaal aan de celmedia toegevoegd op dag 1, 2 en 3 na het kweken van cellen in platen met 6 putjes (dag 0). De resultaten toonden aan dat de neurietlengte van de met deeltjes behandelde cellen duidelijk langer werd dan die van de controle (Fig. 6a, b), en de celmetabolische activiteit nam toe wanneer de cellen werden behandeld met de deeltjes (Fig. 6c).

De nanodeeltjes induceerden celproliferatie en neurietgroei. een celafbeeldingen op dag 1, 2, 3 en 4. b Neurietlengtes van met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen en de controle. De waarden werden gemiddeld voor 200 neurieten. ^** p < 0,01 vergeleken met de controle. c Metabolische activiteit van met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen. De cellen werden gedurende 3 dagen driemaal per dag driemaal per dag behandeld. De eerste keer werd 6MP-AuNPs-RDP aan de celmedia toegevoegd nadat de cellen 24 uur na celtransplantatie waren gekweekt. Elke concentratie van de deeltjes was 0,25 μg/ml. d Afbeeldingen van neurietgroei van de cellen op oppervlaktecoating met 6MP-AuNPs-RDP. 6MP-AuNPs-RDP werd uitgeplaat op de bodem van kweekschalen met een diameter van 3,5 cm en vervolgens werden de cellen op de schaaltjes getransplanteerd. e De lengte van de neurieten werd gemeten op 0 ~ 3 dagen. De cellen met alleen oplosmiddel werden als controle gebruikt. De waarden werden gemiddeld voor 200 neurieten. ^** p < 0,01 vergeleken met de controle, ^* p < 0.05, ^** p < 0.01 vergeleken met de cellen van dag 1. De blauwe pijl wijst naar de representatieve neurieten

Om het effect van 6MP-AuNPs-RDP op de groei van neurieten te onderzoeken wanneer het deeltje als oppervlaktecoatingmateriaal werd gebruikt, werd de bodem van kweekschalen bekleed met 6MP-AuNPs-RDP en vervolgens werden de cellen op de coatings getransplateerd. De afbeeldingen toonden aan dat de deeltjes snel aan het celmembraan hechtten (figuur 6d), waarna de deeltjes werden geïnternaliseerd en verdeeld in de hele cellen, inclusief cytoplasma, kernmembraan en celkern. De resultaten toonden ook aan dat de met deeltjes behandelde cellen significant langere neurieten hadden dan de controle (Fig. 6e).

Effecten van het nanodeeltje op celgroei na bevroren opslag

Om de celtolerantie voor de deeltjes te onderzoeken en te bepalen of de cellen proliferatief vermogen behielden na de vrijstaande groeitoestand, werden met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen bevroren en enkele dagen bewaard toen ze de exponentiële groeifase bereikten. Vervolgens werden de cellen teruggewonnen en gekweekt op platen met 24 putjes (figuur 7a). De resultaten toonden aan dat het aantal met deeltjes behandelde cellen significant toenam en dat de neurieten langer werden dan de controle (Fig. 7b, c), wat suggereert dat de groei van de met deeltjes behandelde cellen niet kon worden beïnvloed door een bevroren en herstelproces .

Het nanodeeltje verhoogde de neurietlengte en het aantal cellen na bevroren opslag. (een ) De cellen werden vóór opslag behandeld met 6MP-AuNPs-RDP (1,0 g/ml) en de cellen werden teruggewonnen en gedurende 3 dagen verder gekweekt. Neuriet lengte (b ) en celnummers (c ) van met 6MP-AuNPs-RDP behandelde cellen waren significant verhoogd na opslag. De cellen met alleen oplosmiddel werden als controle gebruikt. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. ^** p < 0,01 vergeleken met de controle. De blauwe pijl wijst naar de representatieve neurieten

Discussie

AuNP's hebben grote potentiële toepassingen laten zien op verschillende gebieden van scheikunde, natuurkunde, materialen, biologie, geneeskunde en aanverwante interdisciplinaire gebieden. Om de structuur van AuNP's te stabiliseren, werden meestal thiol-gemodificeerde liganden gebruikt als stabilisatoren die aan het oppervlak van AuNP's konden binden door de vorming van Au-S-bindingen. In het onderzoek werden thiolgroepen van 6MP en RDP geconjugeerd met het oppervlak van AuNP's en de deeltjesstructuur was stabiel en kon worden gebruikt voor verder onderzoek.

Zoals uit de resultaten blijkt, hadden de deeltjes een duidelijke zuur-base-eigenschap, die verband hield met de dissociatie van de N(9)-H-groep van 6MP-moleculen die plaatsvond in een pH-bereik van 10,4 ~ 11,2 in oplossing, en aggregatie vond plaats wanneer de pH-waarde van de 6MP-AuNP-oplossing lager was dan 6. De protonering van N9 van het 6MP-molecuul neutraliseerde 6MP-AuNP's met een pH-waarde lager dan 6, en vervolgens werden intermoleculaire interacties (basisstapelingsinteracties) erg sterk en gecompenseerd de elektrostatische afstoting. Na RDP-modificatie vertoonden de deeltjes een complexer zuur-base-gedrag omdat de pI van thiol-RDP ongeveer 11,5 was naast de zuur-base-eigenschap van 6MP-AuNP's. Na titratie was de pI-waarde van 6MP-AuNPs-RDP 7,8, dicht bij de fysiologische toestand (pH 7,4). Dus 6MP-AuNPs-RDP en 6MP-AuNPs kunnen neerslaan uit celmedia.

In deze studie hebben we vastgesteld dat RDP de celopname van 6MP-AuNP's verbeterde, wat consistent was met de eerdere onderzoeken. Het is algemeen bekend dat RDP een lang peptide is dat bestaat uit 39 aminozuren, dat is afgeleid van glycoproteïne van het rabiësvirus dat het vermogen heeft om vreemde macromoleculen naar neuronale cellen te transporteren [15, 16]. In onze vorige studie was de efficiëntie van de celopname van gouden nanoclusters significant verbeterd wanneer de nanoclusters werden geconjugeerd met RDP [17]. Het mechanisme van RDP-penetratie in cellen kan verband houden met neurale celmembraan-γ-aminoboterzuur (GABA) -receptor- of nicotine-acetylcholinereceptor-gemedieerde endocytose [18, 19].

De studie suggereerde ook een tegengesteld effect van 6MP-AuNPs-RDP ten opzichte van 6MP dat 6MP-AuNPs-RDP celproliferatie en neurietgroei bevorderde, wat een duidelijke neurofische activiteit vertoonde. Het mechanisme van dit onderscheidende verschil van 6MP-AuNPs-RDP en 6MP kan verband houden met de chemische structuur van 6MP (een purinederivaat van de C6-thiolgroep) [20]. Op het oppervlak van 6MP-AuNPs-RDP was de thiolgroep van 6MP bezig met binding met AuNP's en werd dus geblokkeerd. Daarom werd de purinegroep blootgesteld aan het deeltjesoppervlak. Het is algemeen aanvaard dat purine een vitale rol speelt bij het bevorderen van neuronale groei (zoals celdifferentiatie, vorming en extensie van neurieten, synaptogenese) via intracellulaire purinerge signaalroutes [21, 22], waaronder door mitogeen geactiveerd proteïnekinase/extracellulair signaalgereguleerd eiwit kinase (MAPK/ERK) en fosfatidylinositol 3-kinase/serine-threoninekinase Akt (PI3K/Akt) routes (dezelfde routes die door neurotrofinen en cytokinen kunnen worden geïnduceerd) [23]. Daarom kan de purine van 6MP-AuNPs-RDP bijdragen aan de effecten van celproliferatie en neurietgroei.

Opgemerkt moet worden dat SH-SY5Y-cellen een goede uitstekende tolerantie vertoonden voor de 6MP-AuNPs-RDP. Wanneer de met deeltjes behandelde cellen herhaalde toediening van de deeltjes ontvingen of werden teruggewonnen uit bevroren opslag, zelfs wanneer de cellen groeiden op het oppervlak dat bedekt was met de deeltjes, behouden ze nog steeds proliferatieve activiteit, wat suggereert dat de 6MP-AuNPs-RDP het potentieel zou moeten hebben voor applicatie.

Conclusies

Hier suggereerden we dat AuNP's gemodificeerd met 6MP en RDP celproliferatie en neurietgroei effectief zouden kunnen bevorderen. Vanwege de uitstekende biocompatibiliteit en bioveiligheid van de nanodeeltjes, zijn ze een veelbelovend biomateriaal dat kan worden gebruikt als neurofisch nanomateriaal voor neuronale groei.

Afkortingen

6MP:: 6-mercaptopurine
AD:: Ziekte van Alzheimer
AuNP's:: Gouden nanodeeltjes
DLS:: Dynamische lichtverstrooiing
DMEM:: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium
DMSO:: Dimethylsulfoxide
FCS:: Foetaal kalfsserum
MTT:: 3-(4,5-Dimethylthiazool-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide
PD:: Ziekte van Parkinson
RDP:: Van rabiësvirus afgeleid peptide
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie

Ontwerp en aanpassing van de grafeen-werkfunctie via grootte, modificatie, defecten en doping:een eerste-principe theorie-onderzoek De optimale titaniumvoorloper voor het vervaardigen van een TiO2-compacte laag voor perovskietzonnecellen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal