In vitro onderzoek naar de invloed van Au-nanodeeltjes op HT29- en SPEV-cellijnen

Discussie

We evalueerden de effecten van AuNP's op proliferatie, necrose / apoptose en vorming van meercellige sferoïden van de continue en oncogene cellijnoorsprong van de epitheelcellen. Er werd aangetoond dat de AuNP's bij 6-12 μg / ml het aantal SPEV- en HT29-cellen verminderden en het aantal cellen verhoogden in vroege en late stadia van apoptose en necrose. De kleine concentraties AuNP's stimuleren de vorming van meercellige sferoïden door HT29- en SPEV-cellen. Hogere AuNP-concentraties hadden echter zowel cytotoxische als anti-cohesieve effecten op cellen in suspensie. De grote gevoeligheid voor de werking van AuNP's werd aangetoond door de lijn van HT29 (6 g/ml) in vergelijking met de SPEV-cellen (12 μg/ml.)

De effecten van AuNP's op cellulaire morfologie en cytoskelet hebben pas recent meer aandacht gekregen, en het onderliggende mechanisme en de komende gevolgen zijn niet diepgaand onderzocht [28,29,30]. In dit opzicht is het belangrijk voor alle nieuwe AuNP-typen om hun endocytische opnameroute en intracellulaire lokalisatie te evalueren als een functie van de tijd. Voor verschillende soorten AuNP's is beschreven dat de effecten afhankelijk zijn van de intracellulaire AuNP-concentratie en van voorbijgaande aard zijn, waarbij na terugkerende celdelingen de intracellulaire AuNP-concentraties exponentieel afnemen en de effecten niet langer worden waargenomen. Ook moet mogelijke endosomale ontsnapping van de AuNP's worden beoordeeld. Aangezien is beschreven dat defecten in het cytoskelet duidelijk afhankelijk zijn van AuNP-concentraties, moet een breed concentratiebereik van deeltjes worden getest om te proberen de maximale cellulaire laadcapaciteit zonder enige effecten te beoordelen. Bovendien, aangezien het cytoskelet ook betrokken is bij veel intracellulaire signaalroutes, moet nog worden onderzocht of de door AuNP's geïnduceerde verstoring van het cytoskelet tot secundaire effecten leidt [31].

Omdat NP's bepaalde fysieke afmetingen hebben, kan het intracellulaire volume dat ze innemen, leiden tot veranderingen in de cellulaire morfologie of de structuur van het cellulaire cytoskeletnetwerk beïnvloeden [28, 29, 31]. De latere effecten kunnen ook te wijten zijn aan de hoge eisen die de NP stelt aan de cellulaire endocytische manier. Van AuNP's is beschreven dat ze een diepgaand effect hebben op de morfologie van verschillende celtypen, zoals A549 humane carcinoom-longcellen [32]. Van AuNP's is ook beschreven dat ze een concentratie-afhankelijk effect hebben op de actinefibrillen van menselijke dermale fibroblasten [33, 34]. Mironava et al. [35, 36] toonde verder aan dat de cytoskeletfilamenten werden verstoord als een functie van AuNP-blootstellingstijd, concentratie en grootte van de NP's, hoewel actine- of β-tubuline-eiwitexpressieniveaus niet werden beïnvloed.

Het gebruikte celtype is ook van groot belang omdat verschillende celtypes, zelfs als ze nauw verwant zijn, heel verschillend kunnen reageren op hetzelfde type nanomaterialen [37, 38]. Bij voorkeur moeten die celtypen die het meest betrokken zijn bij de (toekomstige) biomedische toepassingen van de NP's worden getest (bijvoorbeeld epitheel-, endotheelcellen), of meerdere cellen die zijn afgeleid van de verschillende kiemlagen. Bij het onderzoeken van cytotoxische effecten moet het gebruik van kankerceltypen worden geminimaliseerd, omdat deze tot afwijkende resultaten kunnen leiden [39]. Kankercellen hebben verschillende specifieke kenmerken en gewijzigde intracellulaire signaalroutes die bedoeld zijn om de proliferatie te verhogen en de levensvatbaarheid van de cellen te behouden, waardoor ze minder vatbaar worden voor sommige NP-gemedieerde cytotoxische effecten.

Naar onze mening kan binding van AuNP's aan functionele oppervlaktegroepen (bijv. Transmembraaneiwitten) van cellen omkeerbaar of onomkeerbaar zijn, wat resulteert in tijdelijke of permanente structurele verwondingen [40, 41]. Mogelijke implicaties van veranderingen in biomechanische eigenschappen (bijv. Hardheid en elasticiteit), hechting en elektrische oppervlakte-eigenschappen van cellen zijn waarneembaar. Veranderingen in hardheid of elasticiteit zullen dus waarschijnlijk de structurele flexibiliteit van het oppervlak, de productie van mechanische energie voor celdeling en celmotiliteit beïnvloeden. Wat hechting betreft, is de micro-omgeving van de cel normaal gesproken samengesteld uit een extracellulaire matrix met specifieke moleculen die ervoor zorgen dat cellen zich aan hun omgeving kunnen hechten [42]. Oppervlaktelading speelt ongetwijfeld een belangrijke rol in interacties tussen cellen en hun omgeving.

De andere auteurs meldden ook dat de NP's bij voorkeur gelokaliseerd zijn in mitochondriën en oxidatieve stress veroorzaken en structurele schade versterken [40]. Een recent artikel van Pan et al. beschrijft dat 1,4 nm AuNP's necrose induceren via oxidatieve stress en mitochondriale schade in Hela-cellen [43]. Accumulatie van nanodeeltjes in celmedium na biologische afbraak is onveilig omdat het organellen kan verstoren en zelfs genetische mutaties kan veroorzaken.

Veranderingen die optreden in cellen tijdens apoptose zijn vergelijkbaar voor de meeste celtypen. In apoptotische cellen zijn er veranderingen in de lipidesamenstelling van het plasmamembraan:fosfatidylserine wordt overgebracht van het cytoplasmatische deel van de dubbellaag naar de buitenzijde, waardoor caspase-cascade-activering, chromatinecondensatie en verstoring van de elektronentransportketen in mitochondriën wordt veroorzaakt en uiteindelijk de ATP-synthese wordt gestopt. Geprogrammeerde celdood kan worden veroorzaakt door receptor-gemedieerde fysiologische stimuli die het gevolg zijn van genetische aandoeningen, blootstelling aan chemische of fysieke factoren, evenals door andere veranderingen in cellen. We hebben vastgesteld dat dit effect optreedt bij 6-12 g/ml AuNP's.

Meercellige aggregaten (sferoïden, embryoïde lichaam) vertegenwoordigen een intermitterend niveau tussen monolaag groeiende cellen en weefselkweek. Sferoïden zijn een objectief model van de driedimensionale groei en organisatie van cellen, de cel-tot-cel interacties en de invloed van micro-omgevingsomstandigheden, bijvoorbeeld AuNP-concentratie, op de intensiteit van proliferatie evenals op celadhesie en vorming van microaggregaten. MS-vorming is een gevestigde kweekmethode zowel voor tumor als voor embryonale cellijnen [24, 44, 45]. In ons werk wordt de vorming en groei van sferoïden bereikt door CMC toe te voegen als onderdeel van kunstmatige extracellulaire matrix en oppervlaktecoating met 1% agar die celadhesie aan het oppervlak remde en celaggregatie stimuleerde. Onder deze omstandigheden kan MS-kweek worden gerealiseerd totdat de aggregaten centrale necrose vormen als gevolg van beperkte celmassagroei of spontane differentiatie van embryonale cellen.

In de literatuur is er informatie over interactie AuNP's met colonkankercellijnen en embryonale cellijnen [46, 47]. Volgens deze gegevens kan blootstelling aan zelfs zeer lage concentraties AuNP's een schadelijk effect hebben op de menselijke embryonale neurale precursorcellen en HT29 door celproliferatie, differentiatie en apoptotische celdood te benadrukken.

Er zijn gepubliceerde gegevens dat het effect van AuNP's gebaseerd is op accumulatie van de G0/G1-fase, uitputting van de S- en G2/M-fase, evenals op verlaagde ATP-niveaus in humane orale plaveiselcarcinoomcellen (HSC-3) [48]. Regeling van de celcyclus kan worden aangepakt door schending van focale contacten van cellen met substraat en celoverdracht naar gesuspendeerde fractie in 2D-cultuur en remming van cel-naar-cel contacten in gap junction in 3D-cultuur [48,49,50]. Vanwege de nanogrootte van AuNP's (bijna 15 nm), kunnen het geen cohesiecentra voor cellen zijn. Tegelijkertijd kunnen intercalatie van AuNP's in celmembraan [51], invloed op AuNP zeta-potentiaal van celmembraan [32] en invloed op vorming cel-cel/cel-naar-oppervlak contacten uiteraard een mechanisme voor necrose/apoptose activeren. , cytotoxisch effect en stopzetting van de celcyclus. Overtreding van focale contacten van cellen met substraat en celoverdracht naar gesuspendeerde fractie is een manier om de celcyclus te reguleren [48, 49]. Kleine concentraties AuNP's hadden geen statistisch significant cytotoxisch effect op cellen. Hogere AuNP-concentraties hadden echter zowel cytotoxische als anti-cohesieve effecten op cellen in suspensie. Dit proces droeg bij tot de vorming van een groter aantal lidstaten met een lager gemiddeld volume. We veronderstellen dat AuNP zich vastklampt aan samenhangende contacten van cellen en deze compromitteert. Onze experimenten met de effecten van AuNP's op SPEV- en HT29-cellijnen ondersteunen dus hun verdere toepassing bij de ontwikkeling van door AuNP gemedieerde kankertherapieën.

Hoewel toekomstige studies nodig zullen zijn om de antikankereffecten op de in vivo dierstudies te bevestigen. Desalniettemin is onze diepe overtuiging dat als we de aard van de stof en de mogelijke negatieve invloed ervan kennen, we de schadelijke effecten van AuNP kunnen vermijden en hun positieve biotechnologische potentieel kunnen gebruiken. Ons onderzoek zou vrij betrouwbaar kunnen worden toegepast in effectieve materialen voor de behandeling van kanker, met maximaal voordeel voor de geneeskunde.