Voorbereiding van met ICA geladen mPEG-ICA nanodeeltjes en hun toepassing bij de behandeling van door LPS geïnduceerde H9c2-celbeschadiging

Materialen en methoden

Experimentele instrumenten

De volgende werden gebruikt:elektronische balans JA302 (Shanghai Suzhan Metrology instrument Co., Ltd.); roterende verdamper RE52CS-1 (Shanghai Yarong biochemische instrument Factory); digitale display magnetische roerder met constante temperatuur 78HW-1 (Hangzhou instrument Motor Co., Ltd.); elektrische straaldroger 101-OA (Tianjin Telester Instrument Co., Ltd.); Fourier transformatie infrarood spectrometer NEXUS670 (Neliko Co., Ltd.); UV-Vis-spectrofotometer (Beijing Leiboteke instrument Co., Ltd.); transmissie-elektronenmicroscopie (TEM Glacios); ultrasone dispersieve extractie-instrument waterbadoscillator JP-010S (China Jiemeng Co., Ltd.); real-time fluorescentie kwantitatieve PCR-instrument; multifunctioneel enzym labeling instrument; omgekeerde microscoop (Olympus bedrijf) fluorescentiemicroscoop (Leica, Heidelberg, Duitsland); incubator voor koolstofdioxidecellen (bedrijf Thermo).

Experimentele reagentia

Het volgende werd gebruikt:reagensnaam zuiverheid/specificatie/productie batchnummer (fabrikant):Icariin (95%/1 g/DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); lipopolysacharide (model 055-100 g/Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co., Ltd.); polyethyleenglycolmonomethylether (Analytical Pure/250 g/MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); dichloormethaan (Analytical Pure/500 ml/20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-dimethylaminopyridine (Analytical Pure/100 g/L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-hydroxysuccinimide (biologisch reagens/100 g/RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); FastKing eenstapsmethode om de eerste streng van genomische cDNA-synthese voorgemengde kit te verwijderen (Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); apoptose-detectiekit (Biyuntian); SYBR Green fluorescentie kwantitatieve kit (QIAGENGmbH company).

Synthese van mPEG-COOH

mPEG (5,00 g), barnsteenzuuranhydride (SA, 0,40 g) en 4-dimethylaminopyridine (molverhouding 1:1,5/1,5, 0,50 g) werden gewogen en in een rondbodemkolf van 250 ml gedaan. Vijftig milliliter dichloormethaan werd toegevoegd, onder terugvloeikoeling gekookt en gedurende 2 uur bij 60°C geroerd. Het dichloormethaan werd een halve dag verwijderd door een roterende verdamper bij 35°C en er werd een witte vaste stof verkregen, die een halve dag op kamertemperatuur en atmosferische druk werd gehouden totdat er geen etherresidu verscheen. Het poeder werd opgelost in 50 ml secundair gedestilleerd water en 48 uur gedialyseerd in een dialysezak van 2 kDa, waarbij het water constant werd vervangen. Opgelost SA werd verwijderd en onopgeloste stof werd eruit gefiltreerd. Gecarboxyleerd mPEG (mPEG-COOH) werd verkregen door het filtraat te vriesdrogen en te wegen.

Synthese van mPEG-icariin-polymeer

mPEG-COOH(0,37 g), N -hydroxysuccinimide (0,024 g) en 4-dimethylaminopyridine (0,026 g) werden afgewogen in een rondbodemkolf van 250 ml en vervolgens werd 10 ml gedehydrateerd dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd als het oplosmiddel en de helft bij kamertemperatuur geroerd een dag om de carboxylgroep te activeren. Vervolgens werd 100 mg Icariin-standaard in een buisje gedaan en 5 ml DMSO waaruit het water was verwijderd, werd toegevoegd om de standaard volledig op te lossen. Vervolgens werd het standaardmonster toegevoegd aan de rondbodemkolf en 48 uur geroerd onder bescherming van stikstofgas bij kamertemperatuur. Na continue dialyse met secundair gedestilleerd water bevatte het standaardmonster geen DMSO en we bevestigden de verwijdering van DMSO met behulp van UV. Vervolgens werd het gedialyseerde materiaal 48 uur gevriesdroogd in een vacuümvriesdroger om een ​​lichtgeel product te verkrijgen, namelijk mPEG-ICA-polymeer.

Voorbereiding van met ICA geladen mPEG-ICA nanodeeltjes (NP's)

mPEG-ICA (5 mg) werd gewogen in een buisje, opgelost in 2 ml DMSO en vervolgens 5 minuten geschud in water bij 37 ° C. Vijf milligram ICA werd opgelost in een juiste hoeveelheid DMSO en in een kleine beker gedaan, en mPEG-ICA werd langzaam toegevoegd en opgelost in de DMSO, en 5 ml gedestilleerd water werd toegevoegd. De oplossing werd vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur op een magnetische roerder geroerd. Vervolgens werd de reactant gedialyseerd in een 3500 dialysezak en 24 uur in water gedialyseerd, waarbij het water constant werd ververst, het DMSO-oplosmiddel schoon werd gedialyseerd en de met ICA beladen mPEG-ICA-nanodeeltjes werden verkregen na filtratie.

Fourier transformatie infrarood spectroscopie

Geschikte hoeveelheden standaard ICA-, mPEG-COOH- en mPEG-ICA-polymeren werden tot poeder vermalen in een agaatmortier, gemengd met geschikte hoeveelheden droog KBr-poeder en vermalen tot fijne poeders. Na het persen van de tabletten werd het mengsel gescand in een Fourier-infraroodspectrometer met een scanbereik van 4000-4400 cm/mol ⁻¹ , en de infraroodspectra werden opgenomen. ICA en mPEG-COOH werden gebruikt voor materiaalkarakterisering en mPEG-ICA-polymeer werd gebruikt voor productkarakterisering.

Kernmagnetische resonantie waterstofspectrum

ICA-, mPEG-COOH- en mPEG-ICA-polymeren werden opgelost in gedeutereerd dimethylsulfoxide (DMSO-d6) en geladen in de monsterbuis, die in de rotor werd ingebracht. Vervolgens werd het monster op een nucleaire magnetische resonantiespectrometer van 500 MHz geplaatst en werden de parameters voor het monster ingesteld.

UV–Vis-spectrum

Icariin-standaard (4,0 mg) werd toegevoegd aan een maatkolf van 25 ml, met methanol op schaal toegevoegd en werd vervolgens geschud en opgelost totdat het helder was. Vervolgens werden aliquots van 0,3 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml en 2,5 ml icariin-standaardoplossing nauwkeurig gemeten in maatkolven van 25 ml en werd methanol toegevoegd om het volume aan te passen. De absorptiewaarden van de oplossingen werden vervolgens gemeten op een ultraviolette spectrofotometer bij een golflengte van 270 nm (maximale absorptiegolflengte), met methanol als blanco controle. De gegevens zijn opgenomen om een ​​lineaire regressie te genereren.

mPEG-ICA-polymeer (4,3 mg) werd nauwkeurig gewogen in een maatkolf van 25 ml, met methanol op schaal. De oplossing werd geschud totdat deze was opgelost en geklaard. Vervolgens werd een monsteroplossing van 2,0 ml driemaal nauwkeurig gemeten en opgelost in een maatkolf van 25 ml, waarbij het volume werd aangepast met methanol. De absorptiewaarden van de oplossingen werden vervolgens gemeten op een ultraviolette spectrofotometer bij een golflengte van 270 nm (maximale absorptiegolflengte), met methanol als blanco controle, en de gegevens werden driemaal geregistreerd, waarbij het gemiddelde werd genomen. Vervolgens werd het gehalte aan icariin berekend.

De met ICA beladen mPEG-ICA-nanodeeltjes bereid volgens de bovenstaande methode werden in een kolf met een capaciteit van 25 ml geplaatst, methanol werd op schaal toegevoegd en de kolf werd geschud totdat de oplossing was opgelost en geklaard. Vervolgens werd een monsteroplossing van 2,0 ml driemaal nauwkeurig gemeten en opgelost in een maatkolf van 25 ml, waarbij het volume werd aangepast met methanol. De absorptiewaarden van de oplossingen werden vervolgens gemeten op een ultraviolette spectrofotometer bij een golflengte van 270 nm (maximale absorptiegolflengte), met methanol als blanco controle, en de gegevens werden driemaal geregistreerd, waarbij het gemiddelde werd genomen. De gegevens zijn verzameld om het gemiddelde ICA-gehalte van met ICA geladen mPEG-ICA-nanodeeltjes te berekenen.

Karakterisering van met ICA geladen mPEG-ICA NP's

Dynamische detectie van lichtverstrooiing

Een dynamische lichtverstrooiende deeltjesgroottemeter (DLS; The zetasizer 3000hs, Malvern instruments, Malvern, VK) werd gebruikt om de deeltjesgrootteverdeling en het potentieel van met ICA geladen mPEG-ICA NP's te meten. De nieuw bereide mPEG-ICA en ICA-geladen mPEG-ICA NP's werden gevriesdroogd en opnieuw gedispergeerd in gedestilleerd water, in een colorimetrische beker gegoten en vervolgens in een dynamische lichtverstrooiende deeltjesgrootte-analysermonsterpool geplaatst voor detectie. Elk monster werd drie keer geanalyseerd.

Observatie van de morfologie door TEM

De met ICA geladen mPEG-ICA NPs (1,0 mg/ml) oplossing werd op kopergaas gedruppeld met koolstoffilm en filtreerpapier om te drogen. Het rooster werd in de droger geplaatst en 2% (w/w) fosfowolfraamzuur werd toegevoegd en men liet het gedurende 10 minuten op natuurlijke wijze drogen. Vervolgens werden de morfologische kenmerken van met ICA geladen mPEG-ICA NP's waargenomen bij een versnelde spanning van 80 kV met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Meting van de stabiliteit

De bereide ICA-geladen mPEG-ICA NP's werden 48 uur gevriesdroogd met 5% mannitol in een vacuümvriesdroger en vervolgens werden de gevriesdroogde nanodeeltjes opnieuw opgelost in dubbel gedestilleerd water om de veranderingen in hun deeltjesgrootte en PDI-waarde te detecteren .

Bepaling van de efficiëntie van medicijnbelading en beknelling

Een 1,8 ml ICA-geladen mPEG-ICA NP-oplossing werd nauwkeurig gemeten in een maatkolf van 10 ml, 0,2 ml DMSO werd toegevoegd en echografie werd gedurende 2 minuten uitgevoerd. De absorptie van de oplossing werd bepaald bij 270 nm en het mPEG-ICA-polymeer met hetzelfde oplosmiddel werd als blanco gebruikt. De absorptie van het bepaalde monster werd gesubstitueerd in de standaardcurvevergelijking en het Icariin-gehalte werd berekend. In de DMSO/H₂ O = 1/9 oplosmiddelsysteem, de quasi-curve-vergelijking van Icariin werd gemeten bij 270 nm, en de medicijnbelading (EE%) en invangefficiëntie (LC%) van de nanodeeltjes werden berekend.

• Geneesmiddellading (EE%) = drugsmassa van nanodeeltjes/totale massa van geneesmiddelladende nanodeeltjes × 100%

• Inkapselingspercentage (LC%) = drugsmassa in nanodeeltjes/dosering × 100%.

Drugsafgifte in vitro

Vijf milliliter vrij ICA, mPEG-ICA-polymeer en met ICA geladen mPEG-ICA NP's werden in dialysezakken (3500 kDa) gedaan, die aan beide uiteinden werden vastgemaakt en gedialyseerd in 25 ml PBS (afgiftemedium) onder 37 °C en 100 tpm ultrasone trillingen (pH = 7.4). Twee milliliter werd verwijderd binnen vooraf bepaalde tijdsperioden (Tn, n = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 en 72 uur) en vervangen door een verse oplossing van hetzelfde volume. UV-Vis-spectrofotometrie werd uitgevoerd om de absorptie van het dialysaat bij 270 nm op de verschillende tijdstippen te bepalen. De procentuele verhouding van ICA-afgifte werd berekend zoals beschreven, en drie monsters werden gemeten om de gemiddelde geneesmiddelafgifte te berekenen. Het gehalte aan dialysaat werd bepaald met de standaardcurvemethode en de afgiftetest werd in vitro 3 keer herhaald.

De formule voor medicijnafgifte is Q % = (C _n × V + V _n Σ ⁿ _{t =0} C _ik )/(W_NP × LC%), waarbij W het gewicht van NP is, LC% de geneesmiddellading van nanodeeltjes is, C _n is de monsterconcentratie bij Tn, V is het totale product van het afgiftemedium (25 ml), Vn is het monstergewicht (2 ml) en C _ik is T _ik (ik = 0, 0,5, 1, …., n h ,V ₀ = C ₀ = 0).

Uitgave van mPEG-ICA-ICA NP's in verschillende releasemedia

Twee milliliter ICA-geladen mPEG-ICA NP-oplossing werd in een dialysezak gedaan (4-88 kDa, grenswaarde voor molecuulgewicht) en in fosfaatgebufferde zoutoplossing met pH 7,4 en pH 6,8 (PBS-afgiftemedium, 37 °C, 25 ml). Vervolgens werd 2 ml afgiftemedium verzameld voor bemonstering en vervangen door een verse oplossing van hetzelfde volume met vooraf bepaalde tussenpozen (Tn, n = 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 en 48 uur). De absorptie van dialysaat bij 270 nm op de verschillende tijdstippen werd bepaald met UV-Vis-spectrofotometrie. De procentuele verhouding van ICA-afgifte werd berekend en er werden drie monsters gemeten om de gemiddelde geneesmiddelafgifte te berekenen.

Celtestexperiment

H9c2 (rat H9c2), een ventriculaire myoblastlijn van ratten, werd gekocht bij het Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, China. De cellen werden gekweekt in DMEM met 10% foetaal runderserum (Gibco, VS) bij 37 ° C in een CO₂ -houdende atmosfeer. H9c2-cellen werden gewoonlijk geënt in een kweekschaaltje van 10 cm [25]. Toen de cellen groeiden tot ongeveer 80%, werden ze verder gekweekt met 0,25% trypsine (Gibco). Vervolgens werden de cellen gezaaid in de overeenkomstige kweekschalen of platen met 96 putjes voor de volgende onderzoeken.

Celbehandeling met LPS of ICA-nanodeeltjes

H9c2-cellen werden als volgt in vijf groepen verdeeld:(1) controlegroep:met normaal kweekmedium, (2) LPS-groep:de cellen werden 24 uur behandeld met 10 mg/L LPS; (3) ICA-groep:de cellen werden behandeld met 20 μmol/L ICA (1:1000, DMSO) en 10 mg/L LPS voor dezelfde duur, (4) mPEG-ICA polymeergroep:de cellen werden behandeld met 20 μmol /L mPEG-ICA-polymeer en dezelfde eindconcentratie van LPS voor dezelfde duur; (5) ICA-geladen mPEG-ICA NPS-groep:de cellen werden behandeld met 20 μmol/L ICA-geladen mPEG-ICA NP's en 10 mg/L LPS, waarbij de andere omstandigheden hetzelfde waren als de bovenstaande groep.

MTT

De levensvatbaarheid van de cellen van ICA-nanodeeltjes tegen LPS-geïnduceerde cardiomyocytbeschadiging werd bepaald door MTT. In het kort werden H9c2-cellen gedurende 24 uur behandeld met LPS en verschillende ICA-nanodeeltjes. Daarna werden de cellen gekleurd met MTT in een eindconcentratie van 0,5 mg/ml gedurende 4 uur bij 37 °C en vervolgens werd 150 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd om schildklierkristallen op te lossen. De optische dichtheid werd gemeten bij 570 nm in een microplaatlezer (*/SpectraMax i3 Molecular Devices, Afghanistan).

Lactaatdehydrogenase (LDH)-afgifte

Om het effect van nano-ICA op door LPS geïnduceerde H9c2-schade te onderzoeken, hebben we de LDH-afgifte in het kweekmedium beoordeeld. In het kort, volgens de overeenkomstige behandelingen gedurende 24 uur, werd het kweekmedium verzameld en werd LDH gedetecteerd in overeenstemming met het protocol van de LDH-detectiekit (Beyotime Biotechnology). Ten slotte werd de OD-waarde gemeten bij 490 nm met een spectrometer.

Hoechst 33.258 kleuring

Hoechst 33.258 kleuring werd gebruikt om de nucleaire morfologie te observeren door middel van fluorescentiemicroscopie. Na behandeling werden H9c2-cellen tweemaal gewassen met PBS, gefixeerd in 4% paraformaldehydebuffer (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa), gespoeld met PBS en gekleurd met Hoechst 33.258 bij 37 ° C gedurende 15 minuten [26]. Na kleuring werden de nucleaire morfologische aspecten onmiddellijk waargenomen met een fluorescentiemicroscoop (Leica, Heidelberg, Duitsland). Apoptose-index = aantal apoptotische kernen/totaal kernen × 100%.

TUNEL-test (terminal dUTP nick-end labeling)

Voor de detectie van H9c2-cel-DNA-integriteit hebben we de TUNEL-techniek toegepast. H9c2-cellen werden gekweekt in een kweekplaat met 24 putjes. Na behandeling werden ze 3 keer gewassen met PBS en 30 minuten gefixeerd met 4% polyformaldehyde [27]. Vervolgens werd gedurende 5 minuten 1% Triton X-100 toegevoegd om de doorlaatbaarheid van het celmembraan te vergroten. Vervolgens werden de cellen gekleurd met een TUNEL eenstapsdetectiekit (Beyotime Biotechnology) volgens de instructies, en celapoptose werd waargenomen met een fluorescentiemicroscoop. De apoptosesnelheid van elke groep wordt uitgedrukt als het percentage groen fluorescerende kernen (TUNEL-positief) tot totale kernen (blauw) (de kernen zijn gekleurd met DAPI) [28].

Flowcytometrie om apoptose te detecteren

Om de effecten van verschillende ICA-nanodeeltjes op LPS-geïnduceerde celapoptose verder te onderzoeken, hebben we de Annexin V-FITC/PI dubbele kleuringsmethode gebruikt om de apoptotische snelheid te analyseren. Na H9c2-behandeling zoals hierboven beschreven, werden cellen geoogst en opnieuw gesuspendeerd in 195 μL bindingsbuffer die 10 µL Annexin V-FITC en 5 µL PI bevat en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Na 10 minuten centrifugeren bij 1500 rpm bij 4 ° C, werd de kleurbuffer afgezogen en werden de cellen tweemaal gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd in 100 µL PBS. Ten slotte werden de monsters gemeten met een flowcytometer.

Reverse transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT–qPCR)

RT–qPCR werd gebruikt om de mRNA-expressieniveaus van ontstekingsmarkers, waaronder TNF-α, IL-1β en IL-6, te detecteren. Nadat H9c2-cellen 24 uur waren behandeld, werd totaal RNA geëxtraheerd met TRIzol zoals eerder beschreven en gemeten met een NanoDrop ™ One / OneC micro-ultraviolet-zichtbare spectrofotometer (Thermo, ND-ONEC-W, VS). cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van een ExScript RT-kit en amplificatie werd uitgevoerd op een fluorescerende kwantitatieve PCR-machine (BIO-RAD CFX96 Touch*) met SYBR Green-reagens onder de volgende omstandigheden:95 ° C gedurende 5 minuten, 95 ° C gedurende 30 s, 58 °C gedurende 30 s en in totaal 28 cycli. De in dit onderzoek gebruikte primers zijn als volgt:

Actin::

Vooruit 5′ GCTGTCCCTGTATGCCCTCT-3′;

Omgekeerd 5′-TTGATGTCACGCACGATTT-3′;

TNF-α::

Doorsturen 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3′;

Omgekeerde 5′-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3′;

IL-1β::

Doorsturen 5′GGATGATGACCTGCTA 3′;

Omgekeerde 5′-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3′

IL-6::

Vooruit 5′TGCCTTCTTGGGACTGAT-3′;

Reverse 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3′.

De hoeveelheid van elk doelwitgen werd genormaliseerd naar die van het actinegen. De experimenten werden in drievoud herhaald.

Resultaten en discussie

FTIR en H ¹ NMR-spectra

Uit de mPEG-ICA-spectra waren de absorptiepieken van rektrillingen van twee esterbindingen (–C=O–) 1700 ⁻¹ en 1740 ⁻¹ cm. Vergeleken met de mPEG-COOH-spectra was er een overmatige C=C-rektrillingspiek bij 1650 cm ⁻¹ , wat aangeeft dat de veresteringssynthese van ICA en mPEG-COOH succesvol was in het vormen van mPEG-ICA (Fig. 1).

FTIR-spectra van mPEG-ICA (A ), ICA (B ), en mPEG-COOH (C ). H ¹ NMR-waterstofspectra voor mPEG-COOH en mPEG-ICA

Uit het mPEG-ICA waterstofspectrum geeft 12,6 ppm de ICA fenolische hydroxylgroepen aan vanwege de aanwezigheid van -C=O sterke absorptie-elektronengroepen die naar het lage veld gaan. De waterstofpiek van de benzeenring bij ongeveer 7,5 ppm en het piekoppervlak van 3,5 ppm zijn erg groot, beoordeeld als de –CH₂ –O– waterstofpiek in het mPEG-polymeer. Uit een groot aantal analyses blijkt dat het alkylwaterstofsignaal 0-2 ppm is. Daarom kan worden geconcludeerd dat 1,7 ppm de waterstofpiek met dubbele binding in ICA is. De karakteristieke pieken van mPEG-COOH en ICA verschijnen in mPEG-ICA-polymeren, wat de succesvolle synthese van mPEG-COOH met ICA aantoont (Fig. 1).

Deeltjesgrootte, zetapotentiaal en TEM

De gemiddelde deeltjesgrootte van de mPEG-ICA nanodeeltjes is ongeveer (145,0 ±  15,2) nm, en de dispersie-index (PDI) waarde van het polymeer is (0,277   ±  0,00). De deeltjesgrootte van met ICA geladen mPEG-ICA-nanodeeltjes nam licht toe, tot ongeveer (220,0 ± -13,7) nm, en de PDI was (0,119   ± -0,00). Hoe kleiner de PDI, hoe uniformer de verdeling van met ICA geladen mPEG-ICA NP's. Het zeta-potentieel van de mPEG-ICA-nanodeeltjes was (0,439 ± 0,258) mV, en het zeta-potentiaal van met ICA geladen mPEG-ICA NP's was (2,30 ± 1.33) mV. Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde dat de met ICA geladen mPEG-ICA-nanodeeltjes bolvormig, regelmatig van morfologie en relatief uniform van grootte waren (Fig. 2).

Deeltjesgrootte, zeta-potentiaal en TEM van met ICA geladen mPEG-ICA NP's

Efficiëntie bij het laden en inkapselen van geneesmiddelen

Het ICA-gehalte in de met ICA geladen mPEG-ICA NP's kan worden berekend met ultraviolette spectrofotometrie. De standaardcurve van de ICA-concentratie werd vastgesteld en het ICA-gehalte in het polymeer werd verkregen door de geneesmiddelconcentratie te berekenen op basis van de standaardcurve. Volgens de berekeningen, gebaseerd op de mPEG-ICA-polymeerabsorptie (1,2397 ± 0,1024), was de inhoud van ICA (0,4132 ± 0,0359) mg/ml, met met ICA geladen mPEG-ICA nanodeeltjesabsorptie (1,6289 ± 0,0923), en de het gehalte aan ICA was (0,5496 ± 0,3234) mg/ml. Berekend volgens de formule in de methode, was de geneesmiddelbelading van mPEG-ICA-polymeer (16,5 ± -0,014) % en de inkapselingssnelheid was (41,3 ± -0,036) %; het gehalte aan geneesmiddellading van de met ICA geladen mPEG-ICA NP's was (21,9 ± -0,013)% en de inkapselingssnelheid was (54,9 ± -0,032)% (tabel 1).

Stabiliteitsbepaling

De deeltjesgrootte van met ICA geladen mPEG-ICA-nanodeeltjes bereid door de dialysemethode was (220,0 ± -13,7) nm en de PDI was (0,119   ± 0,00). Na 48 uur vriesdrogen in 5% mannitol kunnen de nanodeeltjes opnieuw worden opgelost in water om stabiele nanodeeltjes te vormen. De deeltjesgrootte was 255 nm en de PDI was (0,326 ± 0,00), wat iets groter was dan die van dialyse-nanodeeltjes (Fig. 3).

Stabiliteit van met ICA geladen mPEG-ICA NP's

mPEG-ICA-ICA geneesmiddelafgifte in vitro

In figuur 4 hangt ICA-afgifte grotendeels af van de pH van het afgiftemedium. Binnen fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) afgiftemedium bij pH 7,4, werd vrij icariïne binnen 12 uur vrijgemaakt (77,21  ± -0,15)% en volledig vrijgegeven. Omdat de mPEG-ICA NP's geladen met icariin-geneesmiddelen de afgifte van nanodeeltjes kunnen verhogen, wordt de geneesmiddelafgifte van mPE-ICA-nanodeeltjes binnen 72 uur tot (44,08 ± 0,12)% en ICA-geladen mPEG-ICA-nanodeeltjes bereikt (52,80 ±-1,70) %. Met ICA geladen mPEG-ICA-nanodeeltjes werden in een bufferoplossing van pH 6,8 geplaatst en we ontdekten dat de door nanodeeltjes gemedieerde afgifte van geneesmiddelen binnen 48 uur (75,66 ± 0,17)% bereikte. Dit komt waarschijnlijk omdat sommige met ICA geladen mPEG-ICA NP's gedepolymeriseerde NP's hadden of mPEG-ICA-moleculen breken in NP's. Deze waarnemingen gaven aan dat de afgifte van ICA gunstiger was onder zure omstandigheden van pH 6,8. Het gaf ook aan dat de afgiftekenmerken van met ICA geladen mPEG-ICA-nanodeeltjes gunstig waren voor de lokale behandeling van myocardiaal inflammatoir letsel, omdat lokale laesies leiden tot een focus met een zwak zure omgeving.

A ICA-afgifte van met ICA geladen mPEG-ICA NP's in PBS bij pH 7,4. B ICA-afgifte uit met ICA geladen mPEG-ICA NP's in PBS bij pH 7,4 en pH 6,8 bij 37 °C in vitro

H9C2-levensvatbaarheid en afgifte van lactaatdehydrogenase

First, to observe the cytotoxicity of ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles, we added free drug (20 µM ICA), mPEG-ICA NPs and ICA-loaded mPEG-ICA NPs to H9c2 cells, and the MTT results showed no marked cytotoxicity of the nanoparticles (Fig. 5). Then, we further explored whether they could protect H9c2 cells against LPS-induced injury (Fig. 6). After LPS treatment for 24 h, cell viability was reduced to (50.0 ± 3.22)% (control group 100%), where treatment with ICA, mPEG-ICA NPs and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly increased the viability of H9c2 cells by (55.94 ± 1.06)%, (60.97 ± 2.615)%, and (65.36 ± 1.214)%, respectively (P  < 0.05).

Evaluation of the cytotoxicity of ICA nanoparticles on H9c2 cells. Data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments

Evaluation of the effects of ICA nanoparticles on LPS-induced H9c2 cell injury. Cell viability in different groups was measured by MTT assay. Data are the mean ± SME. (**P  < 0.01 vs. con; # P  < 0.05 and, ## P  < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

The effect of ICA nanoparticles on the LDH level induced by LPS in H9c2 cells. Data are the mean ± SD. ***P  < 0.01 versus con; ##P  < 0.01 versus LPS treatment group; *&P  < 0.05 versus LPS + mPEG-ICA group

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P  ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Detection of apoptosis by Hoechst 33,258 staining. A Nuclear morphology in cells stained with Hoechst 33,258. B Quantitative analysis of the apoptosis rate by Hoechst 33,258 staining. Data are the mean ± SEM (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Detection of apoptosis by TUNEL. A Cells with TUNEL and DAPI staining; B apoptosis rate. Data are the mean ± SEM (****P  < 0.0001 vs. con; ###P  < 0.005 vs. LPS; &&P  < 0.01 vs. LPS + mPEG-ICA)

A . Apoptotic rate detected by flow cytometry. H9c2 cells were stained by Annexin V/PI double staining. Q1-LL cells were Annexin V/PI double-negative stained, indicating viable cells; Q1-LR cells were Annexin V-positive and PI-negative stained, indicating early apoptosis; Q1-UR cells were Annexin V/PI double-positive stained, indicating late apoptosis. B . Apoptotic rate (%). Data are the mean ± SME. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 and ##P < 0.01 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA IL-1β in the LPS induced H9c2 cells. (**P  < 0.01 compared with con; #P  < 0.05 compared with LPS; &P  < 0.05 compared with LPS + mPEG-ICA.) (2) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA TNF-α. (***P  < 0.005 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS group; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA) (3) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on mRNA IL-6. Data are the mean ± SEM (* P  < 0.05 vs. con; #P  < 0.05 vs. LPS; &P  < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang et al. used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.

Availability of data and materials

Not applicable.

Abbreviations

mPEG:

Polyethylene glycol monomethyl ether

ICA:

Icariin

FT-IR:

Fourier transform infrared spectroscopy

NMR:

Nuclear magnetic resonance spectroscopy

DLS:

Dynamic light scattering

TEM:

Transmission electron microscope

TNF:

Tumor necrosis factor

EPRs:

Permeability and retention functions

SA:

Succinic anhydride

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide