Industriële fabricage
Industrieel internet der dingen | Industriële materialen | Onderhoud en reparatie van apparatuur | Industriële programmering |
home  MfgRobots >> Industriële fabricage >  >> Industrial materials >> Nanomaterialen

Demonstratie van een flexibele op grafeen gebaseerde biosensor voor gevoelige en snelle detectie van eierstokkankercellen

Abstract

Het is belangrijk om een ​​efficiënte methode voor vroege detectie en voorspelling van eierstokkanker te ontwikkelen via een gemakkelijke en goedkope aanpak. Om dergelijke problemen aan te pakken, ontwikkelen we hierin een nieuwe detectiemethode voor circulerende tumorcellen (CTC) om eierstokkanker gevoelig te detecteren met behulp van een flexibele op grafeen gebaseerde biosensor op polyethyleentereftalaat (PET) substraat. De resultaten laten zien dat de op grafeen gebaseerde flexibele biosensor gevoelige en snelle detectie voor eierstokkankercellen laat zien:het levert duidelijk verschillende reacties op voor celkweekmedium en kankeroplossing, verschillende kankercellen en kankerceloplossing met verschillende concentraties; het vertoont een hoge gevoeligheid voor het detecteren van enkele tientallen eierstokkankercellen per ml; bovendien is de flexibele grafeen biosensor zeer geschikt voor snelle en gevoelige detectie van eierstokkankercellen binnen 5 s. Dit werk biedt een goedkope en gemakkelijke fabricagestrategie voor grafeenbiosensoren om CTC-ovariumkankercellen gevoelig en snel te detecteren / identificeren.

Grafische samenvatting

Inleiding

Eierstokkanker is de tweede meest voorkomende gynaecologische kanker en heeft de hoogste mortaliteit onder de gynaecologische kankers [1, 2]. Tot nu toe worden eierstokkankerpatiënten over het algemeen erg laat gediagnosticeerd vanwege de niet-specifieke symptomen van eierstokkanker en het ontbreken van effectieve vroege screeningmethoden. Beeldvorming in combinatie met koolhydraatantigeen CA125 kan worden gebruikt bij de detectie en diagnose van recidieven na een operatie of chemotherapie. CA125 is geen enkele nauwkeurige marker voor eierstokkanker omdat het wordt beïnvloed door tal van factoren en een hoge fout-positieve voorspellende waarde heeft. De gevoeligheid van verhoogde CA125 (> 35 E/mL) die we gebruikten bij de diagnose van het terugkeren van eierstokkanker is minder dan 70% [3]. Echografisch onderzoek en radiologisch onderzoek hebben ook geen adequate gevoeligheid of specificiteit in vroege detectie en herhalingsdiagnose. De 5-jaarsoverleving van eierstokkanker in stadium I en II is 90% en 70% afzonderlijk [4]. Ondanks de vooruitgang in de chirurgische behandeling en adjuvante therapie, is de 5-jaarsoverleving van de eierstokkanker in een gevorderd stadium minder dan 30% [4]. Vroege detectie van eierstokkanker hangt samen met de duidelijk hogere 5-jaarsoverleving, en vroege diagnose van recidief is ook belangrijk. Er is gemeld dat verschillende nieuwe benaderingen, zoals het TP53-auto-antilichaam, DNA-methylatietesten, microRNA-algoritmen en Pap-achtige cytologische analyse, de gevoeligheid van de vroege detectie van eierstokkanker verbeteren [5]. Het is echter dringend maar nog steeds uitdagend om een ​​nieuwe detectiemethode te ontwikkelen met een hogere gevoeligheid voor alle stadia van eierstokkanker.

Onlangs ontdekten onderzoekers dat de tumoren in een vroeg stadium in kankercellen in de bloedbaan kunnen terechtkomen en metastasen kunnen veroorzaken [6]. Cellen komen de perifere bloedbaan binnen via intravasatie van primaire tumoren, recidieven of metastasen die circulerende tumorcellen worden genoemd en die kunnen worden gebruikt als diagnostische of prognostische biomarkers voor solide tumoren [7]. De CTC's zijn zeldzaam in perifeer bloed en de detectiemethoden vereisen een hoge gevoeligheid en specificiteit. In de afgelopen jaren werden immunomagnetische scheiding, microfluïdische scheiding, op filter gebaseerde methoden en ligand-gerichte PCR gerapporteerd bij de detectie van CTC [8,9,10,11]. Tot op heden is het celzoeksysteem van Janssen Diagnostics de enige door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde CTC-detectiemethode, die kan worden gebruikt om patiënten met uitgezaaide borst-, colorectale en prostaatkanker te monitoren [12,13,14]. De detectie van CTC bij eierstokkanker biedt een niet-invasieve diagnostische methode en heeft een voordeel wanneer biopsie moeilijk is. Het detectiepercentage van CTC in een vroeg stadium van eierstokkanker is echter nog steeds laag. De nieuwe methoden om CTC met hogere gevoeligheid te detecteren, zijn nog steeds nodig. Als we CTC gemakkelijk kunnen detecteren bij patiënten met eierstokkanker, kan het nuttig zijn voor zowel de vroege detectie van tumoren, het controleren van recidief als het behandeleffect.

Grafeen, een tweedimensionale halfgeleider, werd in 2004 geïsoleerd door Andre Geim en Kostia Novoselov [15]. Onlangs zijn grafeenachtige 2D-materialen op grote schaal toegepast in sensing en bio-sensing, energieconversie en -opslag, katalyse, composieten en coatings, elektronica en biomedische gebieden [15]. Grafeensensor is een veelbelovende kandidaat om kankerbiomarkers te detecteren vanwege zijn unieke structuur en uitstekende elektrische prestaties, die waren ontwikkeld om carcino-embryonaal antigeen, prostaatspecifiek antigeen, koolhydraatantigeen 19-9 en 15-3 te detecteren [16,17,18,19 ]. Vergeleken met conventionele op grafeen gebaseerde biosensoren vervaardigd op stijve SiO2 /Si-substraten door conventionele fotolithografie, elektrodeverdamping, lift-off en sensorpakketproces met behulp van kostbare faciliteiten, is het belangrijk om een ​​goedkope en gemakkelijke benadering te ontwikkelen om flexibele op grafeen gebaseerde biosensoren te fabriceren met een hoge gevoeligheid en snelle detectiesnelheid.

Om dergelijke problemen aan te pakken, ontwikkelen we hierin een nieuwe en gemakkelijke benadering om op grafeen gebaseerde flexibele biosensor op PET-substraat te fabriceren. Twee elektroden werden direct gefabriceerd op grafeen/PET met behulp van zilverpasta, en de celpool werd direct geconstrueerd met behulp van siliconengel; deze flexibele biosensor kan in elk laboratorium met de hand worden gemaakt zonder dat er een fotolithografieproces en kostbare faciliteiten nodig zijn. Verrassend genoeg zijn onze op grafeen gebaseerde flexibele biosensoren zeer gevoelig en kunnen ze snel detecteren voor eierstokkankercellen. Voor zover we weten, zijn er nog geen rapporten over flexibele op grafeen gebaseerde biosensoren voor de detectie van eierstokkankercellen.

Materialen en methoden

Groei en overdracht van grafeenfilm

In dit werk werd de grafeenfilm gekweekt op het oppervlak van Cu-folie (Alfa Aesar, nr. 13382) door chemische dampafzetting (CVD) [20]. Ten eerste werd het oppervlakteoxide van Cu-folie gedurende 5 minuten verwijderd door 20% zoutzuuroplossing; vervolgens werd de Cu-folie meerdere keren schoongemaakt met gedeïoniseerd water en vervolgens gedroogd met een stikstofstroom. De gereinigde Cu-folie werd op een kwartsboot gedaan en in de kwartsbuis van de CVD-oven gedaan. De ovenkamer werd gepompt tot 1 × 10 –2 Pa. De oventemperatuur werd gedurende 20 min verhoogd tot 1000 °C met 50 sccm van 99,999% H2 en vervolgens werd 50 sccm van 99,999% methaan in de buis gebracht voor de groei van grafeenfilm met groot oppervlak gedurende 20 minuten. Ten slotte werd de CVD-oven op kamertemperatuur afgekoeld met CH4 /H2 gasstroom.

De grafeen/Cu-folie met groot oppervlak werd in veel gewenste stukken gesneden. Vervolgens werd de PMMA spin-coated op het oppervlak van grafeen/Cu-folie, waardoor de PMMA/grafeen/Cu-sandwichachtige structuur werd gevormd. Vervolgens werd de onderliggende Cu-folie geëtst met 1 M FeCl3 oplossing. Het PMMA / grafeen werd gedurende 30 minuten in DI-water gereinigd en vervolgens op het PET-substraat overgebracht. Ten slotte werd het PMMA verwijderd met aceton en werd een grafeen/PET-monster verkregen.

Vervaardiging van op grafeen gebaseerde biosensoren

De fabricageprocedure van op grafeen gebaseerde biosensoren wordt als volgt beschreven. Ten eerste werd ongeveer 1 cm  ×  2 cm grafeenfilm op Cu-folie overgebracht op 1 cm  ×  2 cm PET-substraat door middel van PMMA-ondersteunde natte overdrachtsmethode. Vervolgens werden twee elektroden gefabriceerd nabij het midden van grafeen / PET-film met behulp van zilverpasta. Ten slotte werd, om de elektrische respons van de kankerceloplossing te testen, een celpool met een lengte en breedte van enkele millimeters en ongeveer 1 mm hoogte geconstrueerd door siliconengel aan de rand van de elektrode. Nadat de siliconengel van de celpool volledig is gestold, kan men Agilent 4155B halfgeleideranalysator gebruiken om te controleren of de grafeenbiosensor normaal kan werken.

Cultuur van SKOV3-ovariumkankercellen

SKOV3-reeksen van eierstokkankercellen (geleverd door het openbare laboratorium van het tweede aangesloten ziekenhuis van West-China) werden gekweekt in RPMI-1640 (Transgene, Frankrijk) compleet medium met 10% kalfsserum (MRC, VS) onder de voorwaarde van 5% CO 2 en 37 °C.

Voorbereiding van celoplossing en elektrische metingen

De kankercellen werden verdund tot een specifieke concentratie met celkweekmedium. Breng 50μL celoplossing met pipet naar de groef voor meting. Het elektrische signaal werd geregistreerd door Agilent 4155B halfgeleideranalysator.

Resultaten en discussie

De foto van 10 × 10 cm 2 een groot oppervlak CVD-gegroeide grafeenfilm op Cu-folie wordt getoond in Fig. 1a. Uit Fig. 1a kan men zien dat in vergelijking met kale Cu-folie met heldere metaalkleur, de kleur van grafeen / Cu een beetje donkerder is. Het overeenkomstige Raman-spectrum van grafeen / Cu wordt getoond in figuur 1b. Zoals weergegeven in figuur 1b, piekt de Raman op 1580 cm −1 en 2680 cm −1 komen overeen met G- en 2D-pieken van grafeenfilm. Om de kwaliteit van grafeenfilm verder te controleren, hebben we het Raman-spectrum gemeten van monolaag grafeenfilm overgebracht op SiO2 /Si-substraat, zoals weergegeven in Fig. 1c. Men kan zien dat de verhouding tussen I G en ik 2D lager is dan 0,5, wat bevestigt dat de dikte van het grafeen monolaag is; men kan ook zien dat de D-piek erg laag is en bijna niet kan worden waargenomen, wat suggereert dat de kwaliteit van de grafeenfilm erg hoog is en dat de defecten erg klein zijn.

een Foto van kale Cu-folie (linkerpaneel) en grafeen gegroeid op Cu-folie (rechterpaneel), b Raman-spectrum van grafeen/Cu, en c Raman-spectrum van grafeen/SiO2 /Si

De foto's van flexibele grafeenbiosensoren op PET-substraten worden getoond in Fig. 2. De kankerceloplossing kan aan de celpool worden toegevoegd en het elektrische signaal van grafeenbiosensor kan worden verkregen van twee zilverpasta-elektroden. De elektrische respons voor celkweekmedium en CTC-oplossing werden gemeten.

Foto van grafeen/PET-biosensor

De tijdsafhankelijkheid van de stroomrespons voor dergelijke vloeistoffen wordt geregistreerd bij een vaste spanning van 0,01 V voor en nadat ze in de celpool zijn geplaatst. Zoals te zien is in figuur 3, kan men zien dat voordat een dergelijke vloeistof wordt gedompeld, de stroom constant blijft; wanneer dergelijke vloeistoffen in de celpool worden gedaan, neemt de stroom snel af en houdt dan langzaam een ​​nieuw evenwicht aan. Het antwoord is gedefinieerd als η = (Ik 0Ik )/Ik 0 *100%, waar ik 0 is de stroom net voordat de vloeistof wordt gedompeld, en I is de maximale (of minimale) waarde na het op een bepaald moment onderdompelen van de vloeistof. Men kan zien dat na het plaatsen van dergelijke vloeistoffen de weerstand van grafeem toeneemt. De elektrische respons voor kale celkweekmedium en CTC-oplossing voor en na dompeloplossing 200 s zijn respectievelijk 2,96% en 37,04%. Het is duidelijk dat, vergeleken met kale celcultuurmedium, de elektrische respons voor CTC-oplossing zelfs met 30 cellen/ml zeer significant is, wat suggereert dat de flexibele op grafeen gebaseerde biosensor erg gevoelig is voor detectie van kankercellen.

een Elektrische respons voor kweekmedium met kale cellen, en b kankeroplossing met 30 cellen

De tijdsafhankelijkheid van elektrisch signaal voor kale-celkweekmedium en CTC-oplossing met 30 kankercellen/ml wordt verder geanalyseerd in figuur 3. Zoals getoond in figuur 4, kan men zien dat in vergelijking met dat van kale-celkweekmedium, de elektrische respons voor CTC-oplossing (zelfs als 30 cellen/ml) is zeer gevoelig en snel. Na het onderdompelen van de celoplossing heeft deze slechts 2,1, 2,0, 4,5, 7,5, 10,5, 28,5 s nodig om een ​​respons van 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% te bereiken, terwijl de respons van de overeenkomstige celcultuur medium neemt slechts toe van 0,15 naar 1,3%. Dat betekent dat de flexibele grafeen biosensor zeer geschikt is voor snelle en gevoelige detectie binnen 5 s.

Tijdsafhankelijkheid van elektrische respons voor celkweekmedium en CTC-oplossing

We onderzochten verder de elektrische respons voor twee soorten CTC-kankercellen (SUDHL8-cellen en OCILYS-cellen) met dezelfde concentraties van 10.000 (10 K)/ml. Zoals weergegeven in figuur 5, de tijdsafhankelijkheid van stroom voor twee verschillende kankercellen met een iets andere trend en een groot verschil in elektrische respons. Dat betekent dat de grafeenbiosensor veelbelovend is om te worden gebruikt om verschillende kankercellen te identificeren.

Tijdsafhankelijkheid van elektrische respons voor verschillende kankercellen:a SUDHL8 en b OCILYS

De tijdsafhankelijkheid van elektrische stroom en respons voor SUDHL 8-kankerceloplossing met verschillende celconcentraties van 10.000 (10 K)/ml en 100 K/ml is ook onderzocht. Zoals te zien is in figuur 6, kan men zien dat een oplossing met een oplossing met een lagere kankercelconcentratie een hogere stroomsterkte vertoont, wat suggereert dat de kankercel de neiging heeft om te isoleren en dat veel meer cellen niet gunstig zijn voor de geleiding. De tijdsafhankelijkheid van de respons voor oplossingen met twee concentraties vertoont vergelijkbare veranderingstrends en de respons voor een oplossing met een lagere concentratie is iets hoger dan die van een oplossing met een hogere concentratie. Deze resultaten laten zien dat biosensoren kunnen worden gebruikt om kankeroplossingen met verschillende concentraties te identificeren.

Tijdsafhankelijkheid van elektrische stroom (a ) en reactie (b ) voor SUDHL8-kankercellen met verschillende concentraties van 10 K- en 100 K-cellen/ml

Zoals hierboven vermeld, laten de resultaten zien dat een goedkope en flexibele op grafeen gebaseerde biosensor een verschillende respons vertoont voor celkweekmedium en kankeroplossing, verschillende kankercellen en kankerceloplossing met verschillende concentraties, wat suggereert dat een dergelijke flexibele op grafeen gebaseerde biosensor veelbelovend is. gebruikt om CTC-ovariumkankercellen te detecteren en te identificeren.

Conclusie

Om een ​​efficiënte vroege detectiemethode te ontwikkelen, met name voor eierstokkanker, ontwikkelen we een zeer eenvoudige, op grafeen gebaseerde flexibele biosensor op PET-substraat. Deze flexibele biosensor bestaat uit een celpool en twee elektroden en vergelijkt het elektrische signaal voor en na het toevoegen van celoplossing, wat een hoge gevoeligheid en hoge detectiesnelheid vertoont. Het toont duidelijk verschillende reacties voor celkweekmedium en kankeroplossing, verschillende kankercellen en kankerceloplossing met verschillende concentraties. Ons werk geeft aan dat flexibele op grafeen gebaseerde biosensor veelbelovend is om te worden gebruikt om CTC-ovariumkankercellen gevoelig en snel te detecteren/identificeren.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Auteurs kunnen bevestigen dat alle relevante gegevens in het artikel en de aanvullende informatiebestanden zijn opgenomen.

Afkortingen

CA:

Koolhydraat antigeen

CTC:

Circulerende tumorcel

HUISDIER:

Polyethyleentereftalaat

FDA:

Voedsel- en geneesmiddelenadministratie

CVD:

Chemische dampafzetting


Nanomaterialen

  1. Nano-heterojuncties voor zonnecellen
  2. Nanodeeltjes voor kankertherapie:huidige vooruitgang en uitdagingen
  3. Op cellen gebaseerde medicijnafgifte voor kankertoepassingen
  4. Nanotechnieken inactiveren kankerstamcellen
  5. Een zeer gevoelige elektrochemische DNA-biosensor van acryl-goud nanocomposiet voor de bepaling van het geslacht van Arowana-vissen
  6. Ultragevoelige biosensor voor de detectie van Vibrio cholerae DNA met polystyreen-co-acrylzuur composiet nanosferen
  7. Een op grafeenoxide gebaseerde fluorescerende aptasensor voor de inschakeldetectie van CCRF-CEM
  8. Verbetering van de efficiëntie van de foto-elektrische conversie voor de flexibele vezelachtige kleurstofgevoelige zonnecellen
  9. Een nieuwe magneto-elastische nanobiosensor voor zeer gevoelige detectie van atrazine
  10. Plasmonische ELISA voor gevoelige detectie van ziektebiomarkers met een smartphonelezer
  11. Ultrastabiele elektrochemische sensor voor detectie van cafeïnezuur op basis van platina en nikkel gekartelde nanodraden