Smartphone-gebaseerde plasmonische ELISA voor ultrasensitieve myoglobinedetectie op het punt van zorg

Samenvatting

Serum-myoglobine stijgt binnen 1–2 uur na een acute myocardinfarct (AMI), wat het een kritieke vroege biomarker maakt. We presenteren een plasmonische immunoassay die enzyme-gemediëerde gelokaliseerde oppervlakte-plasmon-resonantie (LSPR) veranderingen van goud-nanostaven (AuNRs) benut om myoglobine te kwantificeren met een lineair bereik van 0,1–1000 ng mL⁻¹ en een detectielimiet (LOD) van 0,057 ng mL⁻¹. Een nieuwe lezer, gebouwd van een smartphone's omgevingslichtsensor (ALS) en een 3D-geprint accessoire, vertaalt LSPR-verschuivingen in een eenvoudige, lage-kosten uitlezing (~$2) geschikt voor resource-beperkte omgevingen. Myoglobine-concentraties gemeten met deze methode correleerden sterk met conventionele ELISA-resultaten, wat de klinische relevantie onderstreept voor snelle AMI-triage.

Inleiding

AMI blijft een leidende doodsoorzaak wereldwijd, met 1,5 miljoen VS- en 500.000 Chinese gevallen per jaar. Vroege detectie hangt af van biomarkers die snel stijgen; serum-myoglobine piekt 6–9 uur post-infarct en is detecteerbaar vanaf 1–2 uur. Conventionele ELISA, hoewel betrouwbaar, vereist laboratorium-infrastructuur en geschoold personeel, wat de bruikbaarheid in point-of-care (POC) scenario's beperkt.

Plasmonische immunoassays combineren ELISA's specificiteit met de optische versterking van metaalnanostructuren, wat blote-oog uitlezing en hoge gevoeligheid mogelijk maakt. Goud-nanostaven, met hun instelbare LSPR, zijn bijzonder aantrekkelijk voor signaaltransductie in biosensing. Echter, kwantitatieve interpretatie vereist traditioneel spectrometers of microplaat-lezers, wat veldimplementatie beperkt. Hier ontwikkelen we een AuNR-gebaseerde plasmonische ELISA voor myoglobine, gekoppeld aan een smartphone-gedreven lezer die de telefoon's ALS benut om doorgelichte lichtintensiteit vast te leggen, wat een draagbaar, goedkoop diagnostisch instrument biedt.

Materialen en methoden

Materialen

Humaan myoglobine (Abcam, UK), anti-myoglobine monoclonale antilichamen (mAb1, mAb2, eigen productie), goud-nanostaven (AuNRs), glucose-oxidase (GOx), paardenradijsperoxidase (HRP), en andere reagenten werden verkregen van standaard leveranciers. Serummonsters werden verzameld van Guangzhou Overseas Chinese Hospital.

Apparatuur

LSPR-spectra werden opgenomen met een Synergy H1 microplaat-lezer; ELISA-absorptie werd gemeten bij 450 nm op een MK3-lezer. AuNRs werden gekarakteriseerd door een PHILIPS TECNAI-10 TEM. De smartphone-lezer werd gemonteerd op een 3D-geprint chassis (deel 1: 100 × 40 × 40 mm, deel 2: 76 × 13 × 12 mm) en gevoed door twee 1,5 V batterijen. Een 850 nm LED uitgelijnd met de ALS maakte doorgelichte-lichtmeting mogelijk via de Light Meter app (Android; compatibel met iOS).

Synthese van AuNRs

Zaad-gemediëerde groei produceerde AuNRs met een aspectratio afgesteld door AgNO₃- en CTAB-concentraties. Finale staven werden 12 uur onder roeren geïnculeerd voor gebruik.

Plasmonische immunoassay-protocol

96-putplaten werden overnachten gecoat met mAb1, geblokkeerd met BSA, en opgeslagen bij –20 °C. GOx-gelabelde mAb2 (GOx-Ab2) werd toegevoegd aan putten met variërende myoglobine-concentraties, gevolgd door glucose en AuNRs in de aanwezigheid van HRP en CTAB. Etching van AuNRs door H₂O₂ genereerde een blauwe verschuiving in de LSPR-piek en verminderde absorptie bij 850 nm, evenredig met myoglobine-hoeveelheid. De doorgelichte-lichtintensiteit werd vastgelegd door de smartphone-lezer, wat een kalibratiekromme genereerde. Serummonsters werden tienvoudig gedilueerd en identiek verwerkt.

Data-analyse

Lineaire regressie werd uitgevoerd met Origin 9.0; alle assays werden getripliceerd om reproduceerbaarheid te waarborgen.

Resultaten en discussie

Assay-principe

GOx op mAb2 converteert glucose tot gluconzuur en H₂O₂. H₂O₂, in de aanwezigheid van HRP en Br⁻, etst AuNRs, wat de LSPR-piek naar kortere golflengtes verschuift en de 850 nm absorptie verlaagt. De mate van verschuiving of intensiteitsverlies reflecteert direct de myoglobine-concentratie.

Optimalisatie

Optimale HRP (1,5 µM) en CTAB (6,25 µM) concentraties maximaliseerden de LSPR-verschuiving. Een 30-min etching-tijd met 100 µM H₂O₂ produceerde stabiele signalen. Hogere H₂O₂-niveaus induceerden een duidelijke blauwe verschuiving en morfologische verandering van rechthoekige naar elliptische staven, wat het etching-mechanisme bevestigt.

Smartphone-lezer prestaties

De ALS-gebaseerde lezer meet doorgelichte-lichtintensiteit bij 850 nm met <1% variantie ten opzichte van een commerciële microplaat-lezer, met een correlatie van 99,1% (R² = 0,991). Het gehele accessoire kost ongeveer $2.

Analytische gevoeligheid

Met behulp van LSPR-verschuiving, kwantificeerde de assay myoglobine van 0,1 tot 1000 ng mL⁻¹ met een LOD van 57,8 pg mL⁻¹. Bij uitlezing met de smartphone, bleef het lineaire bereik identiek, met een LOD van 64,1 pg mL⁻¹. Klinische serummetingen toonden sterke overeenstemming met ELISA (R² = 0,98), wat het diagnostische potentieel van de methode valideert.

Vergelijking met ELISA

Traditionele ELISA leverde een lineair bereik van 25–1000 ng mL⁻¹ en een LOD van 22,7 ng mL⁻¹. De plasmonische assay biedt daarom een ~400-voudig lagere LOD en een breder dynamisch bereik, wat het superieur maakt voor vroege AMI-detectie.

Conclusies

We hebben een goud-nanostaaf plasmonische ELISA gedemonstreerd die serum-myoglobine detecteert met ongekende gevoeligheid (LOD = 0,057 ng mL⁻¹) en een eenvoudige smartphone-lezer. Het platform omzeilt complexe instrumentatie, en biedt een levensvatbare, lage-kosten oplossing voor POC AMI-diagnose in resource-beperkte omgevingen.

Afkortingen

• Ab1: Anti-myoglobine antilichaam
• Ab2: Anti-myoglobine antilichaam 2
• ALS: Omgevingslichtsensor
• AMI: Acute myocardinfarct
• AuNRs: Goud-nanostaven
• ELISA: Enzyme-gekoppelde immuunadsorptie-assay
• GOx: Glucose-oxidase
• HRP: Paardenradijsperoxidase
• H₂O₂: Waterstofperoxide
• LSPR: Gelokaliseerde oppervlakte-plasmon-resonantie
• Myo: Serum-myoglobine
• POCT: Point-of-care testen