Ultrgevoelige electrochemische DNA-biosensor met acryl-goud nancomposiet voor snelle Arowana vis geslachtsbepaling

Samenvatting

Achtergrond

De Aziatische arowana (Scleropages formosus) is een zoetwatervis die gewaardeerd wordt om zijn ornamentale waarde en culturele betekenis in Zuidoost-Azië en delen van Oceanië. Vanwege de hoge marktvraag zijn wilde populaties zwaar uitgebuit, wat leidde tot de classificatie als bedreigd door CITES en de IUCN Rode Lijst. Accuraat geslachtsbepaling op het jeugdige stadium is cruciaal voor fokprogramma's en marktregulering, maar traditionele visuele methoden zijn onbetrouwbaar en tijdrovend, en conventionele PCR-benaderingen zijn arbeidsintensief en vereisen gesofisticeerde laboratoriuminfrastructuur.

Recente vooruitgang in nanometeriaal-gebaseerde biosensors bieden een veelbelovende alternatief. Door acryl polymere microsferen te integreren met goudnanodeeltjes, kunnen we een hoog-oppervlakte, conductief platform creëren dat proef lading en elektronenoverdracht verbetert, waardoor gevoeligheid verbetert en assay-tijd vermindert.

Methoden

Apparaat en elektroden

DPV-metingen werden uitgevoerd op een Autolab PGSTAT 12 potentiostaat met een koolstof screen-geprinte elektrode (SPE) gemodificeerd met AcMP's en AuNP's. Een platina hulp-elektrode en een Ag/AgCl referentie-elektrode (3,0 M KCl) werden gebruikt. Oplossen werden gesonicatieerd in een Elma S30H bad om homogeniteit te waarborgen.

Chemicaliën

Belangrijke reagentia omvatten 2,2-Dimethoxy-2-fenylacetofoenon (DMPP), 1,6-Hexaandiol diacrylaat (HDDA), n-butyl acrylaat (nBA), Au(III)chloride trihydraat en NAS. Kolloïdale goudnanodeeltjes werden gesynthetiseerd volgens Grabar et al. (1995). DNA-proeven werden bereid in 0,05 M K-fosfaatbuffer (pH 7,0) en gehybrideerd in 0,05 M Na-fosfaatbuffer (pH 7,0) bevattend 1,0 mM AQMS en 2,0 M NaCl.

Synthese van acryl microsfeer

AcMP's werden geproduceerd via een een-staps UV-geïnitieerde fotopolymerisatie van een mengsel bevattende HDDA, nBA, DMPP en NAS in een waterige emulsie. Na 10 min sonicatie en 600 s UV-verharding onder N₂, werden de microsferen verzameld door centrifugatie, dried gewassen met K-fosfaatbuffer en aan de lucht gedroogd.

Fabricatie van DNA-biosensor met acryl microsferen

Het SPE-oppervlak werd eerst drop-gecoat met een 3 mg/mL AcMP-dispersie, daarna met 5 mg/mL kolloïdale AuNP's. De gemodificeerde elektrode werd geïncubeerd in een 5 µM geamineerde arowana DNA-proefoplossing gedurende 6 uur, gevolgd door grondig spoelen. Hybridisatie met target cDNA (5 µM) in aanwezigheid van 1 mM AQMS en 2 M NaCl liep gedurende 1 uur voordat DPV-analyse in 0,05 M K-fosfaatbuffer bij kamertemperatuur.

Optimalisatie van electrochemische arowana DNA-biosensor

Proef immobilisatie werd geoptimaliseerd door incubatietijden (1–18 uur) en hybridisatietijden (10–100 min) te variëren. Temperatuur, pH, ionische sterkte en kationvalentie werden systematisch onderzocht om de DPV-respons te maximaliseren. De optimale condities waren: 6 uur proef incubatie, 30 min hybridisatie bij 25 °C, pH 7,0, 0,05 M Na-fosfaatbuffer, 2 M NaCl en 1 mM AQMS.

DNA-extractie en arowana DNA-analyse

Vijftien arowana weefselmonsters werden geëxtraheerd met de QIAquick PCR-zuiveringskit. Genomisch DNA werd geampliceerd door PCR en geverifieerd op 1,5% agarosesgel. Dezelfde extracten werden getest met de biosensor; DPV-stroom boven de basislijn duidde op mannelijk DNA, terwijl stroom op de basislijn overeenkwam met vrouwelijk DNA. Statistische significantie werd beoordeeld met een t-toets (95% betrouwbaarheid).

Resultaten en discussie

SEM-afbeeldingen bevestigden uniforme, spherische AcMP's (Fig. 2) met een smalle grootteverdeling (Fig. 3). Electrochemische karakterisering van de gemodificeerde SPE demonstreerde een diffusie-gecontroleerd, reversibel redoxproces met een lineaire relatie tussen piekstroom en de wortel van de scansnelheid (R² = 0,996; Fig. 4). De DPV-respons (Fig. 6) toonde een duidelijke stroomtoename alleen na hybridisatie met complementair DNA, wat proef specificiteit bevestigt.

Optimalisatiestudies onthulden dat proef immobilisatie na 6 uur een plateau bereikte, terwijl hybridisatie evenwicht bereikte binnen 30 min bij kamertemperatuur (Fig. 7). Temperatuur boven 25 °C versnelde hybridisatie maar riskeerde denaturering, dus 25 °C werd gekozen als optimaal. pH-afhankelijkheid toonde maximaal DPV-signaal op neutraal pH 7,0; lagere of hogere pH verminderde hybridisatie-efficiëntie (Fig. 9). Onder geteste kationen leverde Na⁺ de beste verbetering op, waarschijnlijk door minimale neerslag en gunstige electrostatische afscherming (Fig. 10). Ionische sterkte analyse identificeerde 2 M NaCl en 0,05 M Na-fosfaatbuffer als de optimale hybridisatiebuffer (Fig. 11).

Bepaling van arowana visgeslacht met DNA-biosensor

Toegepast op veldmonsters, de biosensor geslachtsbepalingen matched PCR-resultaten (Tabel 2), wat de betrouwbaarheid bevestigt voor snelle, on-site gebruik.

Conclusies

De ontwikkelde electrochemische DNA-biosensor biedt uitzonderlijke gevoeligheid, een breed dynamisch bereik en een lage detectielimiet voor arowana DNA. De snelle, atto-M niveau detectiemogelijkheid, gecombineerd met een lichtgewicht, eenmalig formaat, maakt het ideaal voor integratie in point-of-use apparaten die viskweekoperaties kunnen ondersteunen door vroege geslachts- en kleuridentificatie mogelijk te maken.