HDAC1 reguleert miR-124-5p en NPY om leren en geheugen in depressieve rattenmodellen te modelleren

Samenvatting

Onderzoek gericht op histondeacetylaas (HDAC's) in depressie is uitgebreid uitgevoerd, maar niet veel over HDAC1. Daarom is de huidige studie gelanceerd om het mechanisme van de HDAC1/microRNA (miR)-124-5p/neuropepti Y (NPY) as in depressie onthullen. Sprague Dawley ratten werden gestimuleerd door chronische onvoorspelbare milde stress om depressiemodellen te vestigen. Gedeprimeerde ratten werden geïnjecteerd met geïnhibeerde HDAC1 of onderdrukte miR-124-5p om hun rollen in lichaamsgewicht, leer- en geheugencapaciteiten, oxidatieve stress en inflammatie in serum en neurotransmitterexpressie in hippocampale weefsels te verkennen. De expressie van miR-124-5p, HDAC1 en NPY in de hippocampus werd getest. De interacties tussen miR-124-5p, HDAC1 en NPY expressie werden ook bevestigd. Hogere miR-124-5p en HDAC1 en lagere NPY expressieniveaus werden gevonden in de hippocampus van gedprimeerde ratten. Geïnhibeerde miR-124-5p of onderdrukte HDAC1 versterkten leer- en geheugencapaciteiten en verhoogden het lichaamsgewicht van gedprimeerde ratten. Knockdown van miR-124-5p of inhibitie van HDAC1 onderdrukte oxidatieve stress en inflammatie en bevorderde neurotransmitterexpressie van gedprimeerde ratten. HDAC1 medeerde miR-124-5p om NPY te reguleren. Knockdown van NPY onthield de beschermende effecten van geïnhibeerde miR-124-5p op gedprimeerde ratten. Onze studie illustreert dat onderdrukking van zowel miR-124-5p als HDAC1 NPY up-reguleert om geheugen en leer in gedprimeerde muizen te verbeteren, wat de bestaande kennis over depressie kan bijwerken en een nieuwe referentie voor de behandeling van depressie kan bieden.

Inleiding

Depressie verwijst naar een ernstige verlammende psychose die wereldwijd zware economische lasten en sociale gevolgen veroorzaakt [1]. Depressie wordt gekenmerkt door fysiologische, cognitieve en gedragsveranderingen die de algehele gezondheid van patiënten bedreigen [2]. De beschikbare behandelingen voor depressie hebben zich ontwikkeld met de toepassing van ketamine als snelwerkend antidepressivum en de verfijning van apparatuur die selectief de activiteit van neuronale subpopulaties kan aansturen [3]. Bovendien zijn veelzijdige nano-architecturen zoals koolstofdots toepasbaar voor neurologische aandoeningen [4]. Echter, onvoldoende behandeling van depressie kan leiden tot slechte prestaties, gedragsstoornissen, lichamelijke ziekten, middelenmisbruik en zelfs zelfmoord [5]. Er is dus een dringende behoefte aan innovatieve middelen in de behandeling van depressie.

Eerder is gedocumenteerd dat microRNA (miR)-124 niveaus stijgen in plasma bij depressie en antidepressiva [6]. Tijdens chronische onvoorspelbare milde stress (CUMS)-geïnduceerde depressie toont miR-124 expressie in de hippocampus dynamische variaties, wat verschillende pathologische veranderingen in verschillende stadia van depressie aangeeft [7]. Bovendien is miR-124 een kandidaat om depressieve gedragingen in majeure depressieve stoornis te verbeteren [8]. Ook dient miR-124 onderdrukking als antidepressivum in de prefrontale cortex, zoals weerspiegeld door verzwakte depressie-achtige gedragingen in muizen [9]. Histondeacetylaas 1 (HDAC1) is een mediator van miR-124 [10] die een multi-proteïne complex vormt voor transcriptionele regulatie en epigenetische modificatie [11]. Onze kennis naar is een handicap van HDAC1 activiteit bevordert veerkracht in majeure depressieve stoornis [12]. Bovendien kan onderdrukking van HDAC1 in de hersenen stemmingstoornissen en andere neuroplastisch veranderde hersenziekten verbeteren [13]. HDAC-remmers kunnen angst-achtige en alcohol-drinkgedrag verzwakken en NPY-expressie verhogen [14]. Ook kan een handicap van HDAC-activiteit leiden tot een toename van NPY-expressie in de centrale nucleus van de amygdala en mediale nucleus van de amygdala [15]. NPY is een hypothalamisch orexigene neuropepti dat voldoende is om angst, sociale stoornissen en depressieve symptomen te voorkomen [16]. Daarnaast zijn NPY en zijn receptoren bewijzen voor anti-inflammatoire en antidepressieve effecten op lipopolysacharide-geïnduceerde depressie rattenmodellen [17]. Samen genomen is de gecombineerde wisselwerking van de HDAC1/miR-124-5p/NPY as in depressie onduidelijk. Daarom beoogt deze studie het mechanisme van deze as te ontrafelen om een curatieve kandidaat voor depressietherapie te onderzoeken.

Materialen en Methodes

Ethische Verklaring

De dierproeven in deze studie voldeden aan de eisen van experimentele dierethiek van het Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van Harbin Medische Universiteit. De experimenten werden geoptimaliseerd om de voedingsomstandigheden van proefdieren te verbeteren, het aantal gebruikte dieren te reduceren en dierenlijden te verlichten.

Experimentele Dieren

Sprague-Dawley (SD) mannelijke ratten van specifieke pathogen-vrije (SPF) graad, wegen 200–220 g, werden verstrekt door het Dieronderzoekscentrum, Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van Harbin Medische Universiteit (Harbin, China). De ratten werden gehouden in een SPF-graad omgeving (22–24 °C, 60–64% vochtigheid, 12-uurs licht- en donkercycli). Behalve tijdens de modellering en andere specifieke tijdstippen, hadden de ratten vrije toegang tot water en voedsel.

Ratten Groepering en Model Vestiging

De gemodelleerde ratten werden willekeurig verdeeld in 8 groepen (n = 10): normale groep (ratten zonder enige behandeling), CUMS groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten), sh-negatieve controle (NC) groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met sh-HDAC1 lentivirus NC), sh-HDAC1 groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met sh-HDAC1 lentivirus), anti-miR-NC groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus NC), anti-miR-124-5p groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus), anti-miR-124-5p + sh-NC groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus en sh-NPY lentivirus NC), en anti-miR-124-5p + sh-NPY groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus en sh-NPY lentivirus).

CUMS-geïnduceerde depressie rattenmodellen werden vestigd volgens de methode van Willner [18]. De ratten in de normale groep werden gevoed met voedsel en water zonder enige stimuli, terwijl ratten in de andere 7 groepen 35 dagen CUMS ondergingen in onafhankelijke kooien. Deze ratten werden gestimuleerd door ijswater zwemmen bij 4 °C gedurende 5 min in een container (30 cm waterdiepte), dag-en nachtinversie (ratten die 12 uur in het donker blijven tijdens de dag en in een heldere ruimte verlicht door gloeilampen gedurende 12 uur tijdens de nacht), staartklemming door een sluipstaartklem gedurende 30 s, 1-min schudden, 24-uurs vasten en wateronttrekking, 30-min ultrasonische stimulatie (50 Hz), natte bedding, en airconditioning bij 17℃. Ratten werden willekeurig gestimuleerd door één van deze stimuli per dag, en dezelfde stimulus werd niet meer dan 5 keer in totaal toegepast.

Ratten werden geanesthetiseerd met 2% pentobarbitaal natrium (50 mg/kg) en bilateraal hippocampus (anteroposterieure diameter = 4,8 mm, mediolaterale afstand = ± 2,5 mm, afstand tussen achterholte en anterieure fonanelle = − 3,5 mm) werden geïnjecteerd met lentivirus met 1 μL/min door een Hamilton microspuit met een 26-G naald. De naald werd 5 min in de injectieplaats gehouden om reflux te voorkomen. De schedels werden afgedicht met botwas en de incities werden gehecht, en de ratten herstelden 7 dagen [19]. sh-HDAC1 lentivirus en zijn NC, anti-miR-124-5p lentivirus en zijn NC, alsook sh-NPY en zijn NC (titer: 10⁸ TU/mL) werden gekocht van GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Gedragsfunctietesten

Ratten werden gewogen op de dag vóór CUMS modellering (op dag 0), na CUMS modellering (op dag 36), en na lentivirus-interferentie (op dag 52).

Open veld test (OFT) kon de autonome en verkennende gedragingen van ratten in een nieuwe omgeving detecteren, wat vaak gebruikt werd om depressieve gedragingen te evalueren. Deze test werd uitgevoerd in een zwart houten open veld doos (100 cm × 100 cm × 50 cm) met een videosysteem boven het open veld geplaatst om rattenactiviteiten op te nemen. De bodem van de open doos was verdeeld in 25 roosters (20 cm × 20 cm) met witte lijnen. De ratten werden in het centrale rooster geplaatst in een vooraf gedefinieerde willekeurige volgorde en het aantal kruisingen van het rooster (ratten die een rooster betreden met ledematen of dubbele voorpoten met één achterpoot) en incidentie van oprechten (ratten die voorpoten tillen en rechtop staan met één achterpoot) werden opgeslagen door het videosysteem. Deze test werd uitgevoerd in een rustige en gedimde binnenomgeving. Na elke test werd het open veld doos gereinigd met 75% alcohol om geuren te verwijderen.

Anhedonie was een van de cruciale symptomen van depressie. De sucrose voorkeur test (SPT) kon de depressieve-achtige gedragingen van ratten evalueren. Vóór SPT werd elke rat voorzien van 2 flessen suikerwater (1% sucrose, w/w) gedurende 24 uur, en met 1 fles steriel water en 1 fles suikerwater voor nog eens 24 uur. Daarna werd de sucrose voorkeur percentage (SPP) van ratten gedetecteerd als volgt: na 23-uurs vasten en wateronttrekking, mochten ratten 1 fles steriel water en 1 fles suikerwater (1% sucrose) gedurende 30 min. Na 1 uur werd de locatie van de twee flessen omgekeerd en waren ratten vrij aan deze twee flessen voor nog eens 30 min. Tijdens dit 1 uur werd de consumptie (mL) van deze twee flessen steriel water en suikerwater (1% sucrose) gemeten en SPP berekend. SPP = suikerwaterconsumptie/(suikerwaterconsumptie + steriel waterconsumptie) × 100%.

Morris water labyrinth test (MWM) werd breed toegepast om de ruimtelijke leer- en geheugencapaciteiten van ratten te evalueren. MWM test werd uitgevoerd in een cirkelvormige watertank (150 cm in diameter en 60 cm in hoogte) met waterdiepte van 40 cm. De watertemperatuur werd gehandhaafd bij 22 ± 1 °C en het water werd zwart gekleurd met niet-giftige en makkelijk te reinigen verf. De tank en het wateroppervlak werden verdeeld in 4 kwadranten (ZO, ZW, NW en NO kwadranten) met elk kwadrant gedecoreerd met het bijbehorende icoon met heldere kleur en speciale vorm op de binnenwand. Het doelplatform was een cirkelvormig transparant platform (11 cm in diameter), gelegen in het midden van het NO kwadrant en 1,5 cm onder het wateroppervlak gedoken. Een videosysteem was boven het midden van de tank geïnstalleerd om de zwemsnelheid, route, en de tijd die ratten besteedden aan het bereiken van het doelplatform en zwemmen in kwadranten op te nemen. Ratten werden in willekeurige volgorde uit 4 kwadranten in het water geplaatst en mochten verkennen en het doelplatform binnen 60 s bereiken. De tijd die ratten nodig hadden om het platform te bereiken werd vastgelegd als de ontSnappingslatentie. Als ratten niet in staat waren het doelplatform binnen 60 s te bereiken, werden ze geleid en de ontSnappingslatentie werd vastgelegd als 60 s. Na elke test mochten ratten 15 s op het doelplatform blijven en werden ratten 4 keer per dag getraind gedurende 5 dagen. De finale ontSnappingslatentie was het gemiddelde van de ontSnappingslatentie op dag 3-5. Op de 6e dag van de MWM test werd een ruimtelijke verkennings test uitgevoerd. Het doelplatform werd uit de watertank verwijderd, en de ratten gingen het water binnen vanaf het ZW kwadrant. De tijd dat ratten in het NO kwadrant zwemden binnen 60 s werd vastgelegd als de ruimtelijke verkennings tijd.

Tijdlijn van dit experiment is weergegeven in Fig. 1.

Chronologie van de huidige studie

Monsterverzameling

Eén dag na de laatste MWM test, werden de ratten geëuthanaseerd en intraperitoneaal geïnjecteerd met 2% pentobarbitaal natrium (50 mg/kg). De borstkas werd geopend om hartbloed te verkrijgen met een spuit, dat 3 keer gecentrifugeerd werd bij 3500 t/min gedurende 15 min, en het supernatans werd opgeslagen bij −20 °C. Na bloedverzameling werd een catheter ingevoegd van de linkerventrikel naar de aorta, en 500 mL fysiologische zoutoplossing werd geperfuseerd om het hele bloed uit te spoelen. Hippocampale weefsels werden gescheiden en in 1,5-mL centrifugerbuisjes geplaatst, gewogen en opgeslagen bij −80 °C. Een deel van de hippocampus werd vastgezet met 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur, gedeshydrateerd met gradient sucrose en in paraffine ingebed.

Oxidatieve Stress-gerelateerde en Inflammatoire Index Detectie

Het serum werd opgewarmd voor detectie van superoxidedismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), interleukine(IL)-β, tumornecrosefactor-α (TNF-α), en stikstofmonoxide (NO) concentratie. Kits voor detectie van SOD, MDA en GSH werden verstrekt door Beyotime Instituut voor Biotechnologie (Shanghai, China), terwijl enzyme-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kits voor detectie van IL-β, TNF-α en NO door NanJing JianCheng Bioengineering Instituut (Nanjing, China).

Hematoxyline-Eosine (HE) Kleuring

De paraffinesneden werden gedewaxt, gehydrateerd met ethanol, gespoeld met gedemineraliseerd water en gekleurd met hematoxyline kleurstofoplossing gedurende 20 min. Daarna werden de sneden gespoeld met kraanwater tot de sneden blauw kleurden. Vervolgens werden de sneden in 1% ethanolische chloorwaterstofoplossing geplaatst gedurende 10 s, gespoeld met kraanwater en gedeshydrateerd met ethanol, gevolgd door kleuring in eosine gedurende 2 min, deshydratatie met hooggeconcentreerd alcohol en doorlatendheid in xyleen. Tot slot werden de sneden afgedicht en waargenomen onder een biologisch microscoop.

Neurotransmitter Expressie Detectie

De hippocampale weefsels werden gewogen en gehomogeniseerd door ultrasoon in fysiologische zoutoplossing (100 μL/10 mg). Het homogenaat werd bij 4 °C gedurende 30 min bewaard, gecentrifugeerd bij 12.000 t/min (4 °C) gedurende 3 min om het supernatans te verzamelen. De eiwitconcentratie van het supernatans werd gedetecteerd door bicinchoninzuur (BCA) eiwitdetectiekit (CWBIO, Beijing, China) en de expressieniveaus van norepinephrine (NE), serotonine (5-HT), en dopamine (DA) door ELISA kits. NE, 5-HT en DA ELISA kits werden verstrekt door Liweiping Biotechnologie Co., Ltd. (Beijing, China).

Reverse Transcriptie Kwantitatieve Polymerase Ketting Reactie (RT-qPCR)

RNA werd geëxtraheerd uit hippocampale weefsels door RNA extractiekit (Promega, Madison, WI, VS), en de concentratie en zuiverheid van de RNA werden gedetecteerd door een ultraviolet spectrofotometer. Volgend de instructies van de reverse transcriptiekit (DRR047S, Takara, Dalian, China), werd RNA reverse transcriptie naar complementaire DNA (cDNA) uitgevoerd. mRNA werd revers getranscribeerd naar cDNA door GoldScript one-step RT-PCR Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, VS) terwijl miRNA door Hairpin-it™ miRNA kwantitatieve detectiekit (GenePharma). RT-qPCR detectiekit (Promega) werd toegepast om HDAC1, miR-124-5p en NPY expressie in weefsels te detecteren. U6 werd aangewezen als interne controle voor miR-124-5p terwijl β-actine voor HDAC1 en NPY. PCR primers werden verkregen van Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabel 1). De relatieve expressie van doegenen werd berekend door 2^−△△Ct methode.

Western Blot Analyse

De hippocampale weefsels werden op ijs in stukjes gesneden en gelyseerd door radio-immunoprecipitatie assay lysaat (Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd., Beijing, China) om eiwit te extraheren. De eiwitconcentratie werd bepaald door BCA methode. Totaal eiwit (50 μg) werd toegevoegd met 5 × natrium dodecyl sulfaat (SDS) laadbuffer bij 1:4 en verhit in een kokend waterbad gedurende 5 min. Vervolgens werd het eiwit onderworpen aan natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide gel elektroforese, geëlektroblot op een membraan en geblokkeerd met 5% melk gedurende 1 uur. Daarna werd het eiwit geprobed met primaire antilichamen tegen HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, Californië, VS) en β-actine (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, VK) overnacht, en opnieuw geprobed met perioxidase-gelabeld secundair antilichaam. Het membraan werd ontwikkeld door versterkte chemiluminescentie, en de optische dichtheid werd berekend door Quantity One grijsanalyse software. De eiwitexpressie van het doegene werd uitgedrukt als de verhouding van de grijwaarde tot β-actine grijwaarde.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) Assay

ChIP assay werd uitgevoerd in overeenstemming met de instructies van de EZ-ChIP kit (Millipore, Bedford, MA, VS). HEK293T cellen werden geïnculeerd met 1% formaldehyde gedurende 10 min en beëindigd door glycine. Vervolgens werden de cellen gecentrifugeerd bij 2000 t/min gedurende 5 min, en toegevoegd met SDS Lyse Buffer voor ultrasonificatie. Gecentrifugeerd bij 10.000 g bij 4℃ gedurende 10 min, de cellen (100 μL) werden gereageerd met 900 μL ChIP Verdunningsbuffer, 20 μL van 50 × PIC en 60 μL ProteïneA Agarose/Zalm Sperm DNA bij 4℃ gedurende 1 uur, en mochten 10 min staan. De neerslagen werden gecentrifugeerd bij 700 t/min gedurende 1 min met 20 μL als input. Een buis werd toegevoegd met HDAC1 antilichaam (1 μL) en immunoglo buline G antilichaam en de andere buis werd zonder antilichaam toegevoegd. De monsters in de twee buizen werden overnacht geïnculeerd, geëlueerd en gedekoppeld. Na DNA terugwinning, werd het monster getest door RT-qPCR.

Dubbele Luciferase Reporter Gen Assay

Bioinformatica website (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) analyseerde de bindingsplaatsen van miR-124-5p en NPY. NPY-wild type (WT) en NPY-mutant (MUT) plasmiden werden gegenereerd door Huayueyang Biotechnologie Co., Ltd. (Beijing, China). Gecombineerd met mimic NC of miR-124-5p mimic, werden de plasmiden getransfecteerd in HEK293T cellen. Cellen luciferase activiteit werd bepaald door de luciferase detectiekit (BioVision) en Glomax20/20 luminometer (Promega).

Statistische Analyse

SPSS 21.0 statistische software (IBM Corp. Armonk, NY, VS) werd gebruikt voor data analyse. De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden getest door t test. Vergelijkingen onder meerdere groepen werden geëvalueerd door eensijdige variantieanalyse (ANOVA), waarna paargewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test. P vertegenwoordigde tweezijdige testen en P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Inhibitie van Zowel HDAC1 als miR-124-5p Verhoogt het Gewicht van Gedprimeerde Ratten

Ratten werden gewogen 1 dag vóór CUMS modellering (dag 0), 1 dag na beëindiging van modellering (dag 36), en 7 dagen na lentivirus-interferentie (dag 52). Geen verschil werd gedetecteerd in het lichaamsgewicht van ratten in elke groep vóór modellering (alle P > 0,05). Na modellering, daalde het rattengewicht in de CUMS groep, sh-NC groep, sh-HDAC1 groep, anti-miR-NC groep en anti-miR-124-5p groep versus de normale groep (alle P < 0,05). Geen discrepantie werd opgemerkt wat het rattengewicht betreft in de CUMS groep, sh-NC groep, sh-HDAC1 groep, anti-miR-NC groep en anti-miR-124-5p groep (alle P > 0,05). Na interferentie, daalde het rattengewicht in de CUMS groep versus de normale groep (alle P < 0,05). Geen discrepantie werd opgemerkt wat het rattengewicht betreft in de CUMS groep, sh-NC groep, en anti-miR-NC groep (alle P > 0,05). Het rattengewicht steeg in sh-HDAC1 groep en anti-miR-124-5p groep ten opzichte van hun NC groepen (beide P < 0,05), wat aangeeft dat inhibitie van HDAC1 of miR-124-5p het gewicht van gedprimeerde ratten verhoogde (Fig. 2a).

Inhibitie van zowel HDAC1 als miR-124-5p verhoogt gewicht en verbetert leer- en geheugencapaciteiten van gedprimeerde ratten. a Effecten van inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p op het lichaamsgewicht van gedprimeerde ratten; b SPP voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; c Frequentie van roosterkruising in OFT voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; d Incidentie van oprechten in OFT voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; e OntSnappingslatentie in MWM test voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; f Ruimtelijke verkennings tijd in MWM test voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; n = 10; a P < 0,05 vergeleken met de normale groep; b P < 0,05 vergeleken met de sh-NC groep; c P < 0,05 vergeleken met de anti-miR-NC groep. Vergelijkingen onder meerdere groepen werden geëvalueerd door eensijdige ANOVA, en paargewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

Inhibitie van Zowel HDAC1 als miR-124-5p Verbetert Leer- en Geheugencapaciteiten in Gedprimeerde Ratten

SPT, OFT en MWM test werden toegepast om SPP, frequentie van roosterkruising en incidentie van oprechten, alsook ontSnappingslatentie en ruimtelijke verkennings tijd te detecteren. Het werd उल्लिखित dat (Fig. 2b–f) vóór interferentie, in vergelijking met de normale groep, SPP, frequentie van roosterkruising, incidentie van oprechten en ruimtelijke verkennings tijd afnamen, terwijl ontSnappingslatentie verlengde in de CUMS groep, sh-NC groep, sh-HDAC1 groep, anti-miR-NC groep en anti-miR-124-5p groep (alle P < 0,05), wat de ontwikkeling van depressie-achtige gedragingen in ratten suggereert. Er was geen discrepantie in SPP, frequentie van roosterkruising, incidentie van oprechten, ruimtelijke verkennings tijd en ontSnappingslatentie onder de CUMS groep, sh-NC groep, sh-HDAC1 groep, anti-miR-NC groep en anti-miR-124-5p groep (alle P > 0,05). Na interferentie, versus de sh-NC groep en anti-miR-NC groep, namen SPP, frequentie van roosterkruising, incidentie van oprechten en ruimtelijke verkennings tijd toe terwijl ontSnappingslatentie verkorte in de sh-HDAC1 groep en anti-miR-124-5p groep (alle P < 0,05). Geen verschil werd waargenomen in SPP, frequentie van roosterkruising, incidentie van oprechten, ruimtelijke verkennings tijd en ontSnappingslatentie onder de CUMS groep, sh-NC groep en anti-miR-NC groep (alle P > 0,05), wat suggereert dat silencing van HDAC1 of onderdrukking van miR-124-5p depressie-achtige gedragingen kon verzwakken en leer- en geheugencapaciteiten in ratten kon verbeteren.

Inhibitie van Zowel HDAC1 als miR-124-5p Verzwakt Pathologische Zeuwaanschade in Gedprimeerde Ratten

Observatie van hippocampale letsels door HE kleuring (Fig. 3a) onthulde dat de netjes gerangschikte neuronen in de hippocampus van ratten in de normale groep duidelijke morfologie, normale structuur, dichte lagen, duidelijke celkernen, en duidelijke nucleoli vertoonden. De neuronen van ratten in de CUMS groep waren ingetrokken, verminderd in aantal en losjes gerangschikt met ongelijk verdeeld chromatine en verdunde laag. De ratten in de sh-NC en anti-miR-NC groepen toonden dezelfde situatie als de CUMS groep. De ratten in de sh-HDAC1 en anti-miR-124-5p groepen toonden verhoogde neuronen in orde en verzwakte schade in vergelijking met hun NC groepen. Het werd aangegeven dat knockdown van HDAC1 of inhibitie van miR-124-5p hippocampale letsels in gedprimeerde ratten verlichtte.

Inhibitie van zowel HDAC1 als miR-124-5p verzwakt pathologische hippocampus schade en up-reguleert neurotransmitter expressie in gedprimeerde ratten. a HE kleuring van hippocampale letsels van gedprimeerde ratten; b ELISA van NE expressie in hippocampale weefsels; c ELISA van 5-HT expressie in hippocampale weefsels; d ELISA van DA expressie in hippocampale weefsels; n = 6; a P < 0,05 vergeleken met de normale groep; b P < 0,05 vergeleken met de sh-NC groep; c P < 0,05 vergeleken met de anti-miR-NC groep. Vergelijkingen onder meerdere groepen werden geëvalueerd door eensijdige ANOVA, en paargewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

Inhibitie van Zowel HDAC1 als miR-124-5p Up-reguleert Neurotransmitter Expressie in Gedprimeerde Ratten

Depressie was gerelateerd aan hersen-neurotransmitter stoornissen. Daarom werden de niveaus van DA, NE, en 5-HT neurotransmitters in ratten hippocampus gemeten door ELISA. De resultaten gaven aan dat (Fig. 3b–d) in vergelijking met de normale groep, verlaagde niveaus van DA, NE en 5-HT gevonden werden in ratten van de CUMS groep, sh-NC groep, sh-HDAC1 groep, anti-miR-NC groep en anti-miR-124-5p groep (alle P < 0,05). Geen verschil werd waargenomen in de neurotransmitter expressie in de CUMS groep, sh-NC groep en anti-miR-NC groep (alle P > 0,05). Relatief tot de sh-NC en anti-miR-NC groepen, namen DA, NE en 5-HT niveaus toe in ratten van de sh-HDAC1 en anti-miR-124-5p groepen (alle P < 0,05), wat impliceert dat down-regulatie van HDAC1 of reductie van miR-124-5p de niveaus van DA, NE en 5-HT in de hippocampus van gedprimeerde ratten kon up-reguleren.

Inhibitie van Zowel HDAC1 als miR-124-5p Onderdrukt Oxidatieve Stress en Inflammatie in Gedprimeerde Ratten

Oxidatieve stress-gerelateerde en inflammatoire factor expressie in serum werden gemeten. Ten opzichte van de normale groep, waren SOD en GSH activiteiten verstoord, terwijl MDA, IL-1β, TNF-α en NO niveaus verhoogd waren in de andere depressiemodel groepen (alle P < 0,05). SOD en GSH activiteiten, en niveaus van MDA, IL-1β, TNF-α en NO onder de CUMS groep, sh-NC groep en anti-miR-NC groep toonden geen verschil (alle P > 0,05). In relatie tot de sh-NC groep en anti-miR-NC groep, werd een toename opgemerkt in de SOD en GSH activiteiten en een afname waargenomen in de MDA, IL-1β, TNF-α, en NO niveaus in de sh-HDAC1 groep en anti-miR-124-5p groep (alle P < 0,05) (Fig. 4a–f), wat aangeeft dat uitputting van HDAC1 of down-regulatie van miR-124-5p oxidatieve stress en inflammatie in gedprimeerde ratten kon verlichten.

Inhibitie van zowel HDAC1 als miR-124-5p onderdrukt oxidatieve stress en inflammatie in gedprimeerde ratten. a–c Effect van inhibitie van zowel HDAC1 als miR-124-5p op SOD, MDA en GSH concentratie in serum van gedprimeerde ratten; d–f Effect van inhibitie van zowel HDAC1 als miR-124-5p op IL-1β, TNF-α, en NO concentratie in serum van gedprimeerde ratten; n = 10; a P < 0,05 vergeleken met de normale groep; b P < 0,05 vergeleken met de sh-NC groep; c P < 0,05 vergeleken met de anti-miR-NC groep. Vergelijkingen onder meerdere groepen werden geëvalueerd door eensijdige ANOVA, en paargewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

HDAC1 Medeert miR-124-5p om NPY te Reguleren

RT-qPCR en western blot analyse werden toegepast voor detectie van HDAC1, miR-124-5p en NPY in de hippocampus. Het werd उल्लिखית dat (Fig. 5a, b) versus de normale groep, HDAC1 en miR-124-5p toegenomen en NPY afgenomen in de CUMS groep (alle P < 0,05). HDAC1, miR-124-5p, en NPY expressie toonden geen variaties in de CUMS groep en sh-NC groep (alle P > 0,05). Relatief tot de sh-NC groep, werd de sh-HDAC1 groep weerspiegeld door verlaagde HDAC1 en miR-124-5p en verhoogde NPY expressieniveaus (alle P < 0,05). De bovenstaande bevindingen suggereerden de succesvolle lentivirus-interferentie en de positieve relatie tussen miR-124-5p en HDAC1 expressie.

HDAC1 medeert miR-124-5p om NPY te reguleren. a HDAC1, miR-124-5p en NPY mRNA expressie in hippocampale weefsels na inhibitie van HDAC1 door RT-qPCR (n = 6); b HDAC1 en NPY eiwitexpressie in hippocampale weefsels na inhibitie van HDAC1 door western blot analyse (n = 6); c MiR-124-5p en NPY mRNA expressie in hippocampale weefsels na inhibitie van miR-124-5p door RT-qPCR (n = 6); d NPY eiwitexpressie in hippocampale weefsels na inhibitie van miR-124-5p door western blot analyse (n = 6); a P < 0,05 vergeleken met de normale groep; c P < 0,05 vergeleken met de sh-NC groep. Vergelijkingen onder meerdere groepen werden geëvalueerd door eensijdige ANOVA, en paargewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

Ook werden miR-124-5p en NPY expressie na miR-124-5p onderdrukking gedetecteerd met de resultaten (Fig. 5c, d) die aantoonden dat in relatie tot de normale groep, verhoogde miR-124-5p en verlaagde NPY gepresenteerd werden in de CUMS groep (beide P < 0,05). Integenstelling, de anti-miR-124-5p groep neigde naar verlaagde miR-124-5p en verhoogde NPY in relatie tot de anti-miR-NC groep (beide P < 0,05). Geen discrepantie werd herkend in de miR-124-5p en NPY expressie in de CUMS groep en anti-miR-NC groep (beide P > 0,05). De resultaten waren indicatief voor de succesvolle lentivirus-interferentie en de negatieve connectie tussen NPY en miR-124-5p.

ChIP assay was om te testen of HDAC1 kon binden aan de miR-124-5p promoter, en de resultaten toonden aan dat (Fig. 6a, b) HDAC1 alleen gerelateerd was aan de miR-124-5p promoter (P < 0,001), wat aangeeft dat HDAC1 miR-124-5p direct kon reguleren.

HDAC1 bindt aan de promoter van miR-124-5p. a Bindingsrijkdom van HDAC1 en miR-124-5p promoter regio in HEK293T cellen door ChIP assay (n = 3); b Bindingsrijkdom van HDAC1 en ongerelateerde intergenische regio's in HEK293T cellen door ChIP assay (n = 3); c MiR-124-5p en NPY bindingsplaats door biologisch informatica software website; d Doelrelatie tussen miR-124-5p en NPY door dubbele luciferase reporter gen assay (n = 3); Vergelijkingen tussen twee groepen werden getest door t test

De doelrelatie tussen miR-124-5p en NPY werd voorspeld en geverifieerd via RNA22 tool en dubbele luciferase reporter gen assay (Fig. 6c, d). Ten opzichte van de cellen co-transfectie met NPY-3′UTR-WT en mimic NC, toonden de cellen met co-transfectie van NPY-3′UTR-WT en miR-124-5p mimic verminderde luciferase activiteit (P < 0,05). Geen verschil werd herkend in de luciferase activiteit in de cellen co-getransfecteerd met NPY-3′UTR-MUT en mimic NC, en de cellen co-getransfecteerd met NPY-3′UTR-MUT en miR-124-5p mimic (P > 0,05).

Knockdown van NPY Ongedaan Maakt de Beschermende Effecten van Geïnhibeerde miR-124-5p op Gedprimeerde Ratten

Spontane uitputting van NPY en miR-124-5p was geprogrammeerd om hun wisselwerking in gedprimeerde ratten te verkennen. Het werd getoond dat (Fig. 7a, b) lagere NPY expressieniveau werd opgemerkt in de anti-miR-124-5p + sh-NPY groep versus de anti-miR-124-5p + sh-NC groep (P < 0,05). Lichaamsgewicht en gedragsfunctietesten illustreerden dat (Fig. 7c–f) in vergelijking met de anti-miR-124-5p + sh-NC groep, de ratten in de anti-miR-124-5p + sh-NPY groep verminderd gewicht, SPP, frequentie van roosterkruising, incidentie van oprechten en ruimtelijke verkennings tijd presenteerden met verhoogde ontSnappingslatentie (alle P < 0,05). HE kleuring van de hippocampale letsels toonde aan dat (Fig. 8a) in vergelijking met de anti-miR-124-5p + sh-NC groep, het aantal hippocampale neuronen verminderd was, en hippocampale neuronen donker gekleurd, spaarzam en onordelijk gerangschikt in een onregelmatige vorm met verminderde cellagen in de anti-miR-124-5p + sh-NPY groep. Bovendien, versus de anti-miR-124-5p + sh-NC groep, de ratten in de anti-miR-124-5p + sh-NPY groep werd vergezeld door verminderde DA, NE en 5-HT (alle P < 0,05) (Fig. 8b). Behalve dat, verstoorde SOD en GSH activiteiten, en verhoogde MDA, IL-1β, TNF-α en NO niveaus bestonden in de ratten van de anti-miR-124-5p + sh-NPY groep versus de anti-miR-124-5p + sh-NC groep (alle P < 0,05) (Fig. 8c, d). Collectief, knockdown van NPY onthield de beschermende effecten van onderdrukte miR-124-5p op gedprimeerde rat.

Knockdown van NPY onthield de effecten van geïnhibeerde miR-124-5p op lichaamsgewicht en gedragsfunctie van gedprimeerde ratten. a MiR-124-5p en NPY mRNA expressie in hippocampale weefsels na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY door RT-qPCR (n = 6); b NPY eiwitexpressie in hippocampale weefsels na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY door western blot analyse (n = 6); c Lichaamsgewicht van gedprimeerde ratten na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY (n = 10); d SPP van gedprimeerde ratten na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY (n = 10); e Frequentie van roosterkruising en incidentie van oprechten na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY (n = 10); f OntSnappingslatentie en ruimtelijke verkennings tijd na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY (n = 10); Vergelijkingen tussen twee groepen werden getest door t test

Knockdown van NPY onthield de effecten van geïnhibeerde miR-124-5p op hippocampale schade van gedprimeerde ratten. a HE kleuring van hippocampale letsels van ratten na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY (n = 6); b ELISA van NE, 5-HT en DA expressie in hippocampale weefsels van ratten na inhibitie van zowel miR-124-5p en NPY (n = 6); C. Effect van geïnhibeerde NPY en onderdrukte miR-124-5p op SOD, MDA en GSH concentratie in serum (n = 10); D. Effect van geïnhibeerde NPY en onderdrukte miR-124-5p op IL-1β, TNF-α en NO concentratie in serum (n = 10). Vergelijkingen tussen twee groepen werden getest door t test

Discussie

Depressie is een type psychiatrische stoornis die een verscheidenheid aan condities met diverse symptomen omvat [20]. Hoewel opkomende studies de rol van miRNA's in depressie hebben geïmpliceerd, is de precieze werking van miR-124-5p zelden onderzocht. Daarom is de huidige studie geprojecteerd voor beter begrip van het mechanisme van miR-124-5p/HDAC1/NPY as in depressie met het belangrijkste resultaat dat uitlegt dat silencing van zowel HDAC1 als miR-124-5p NPY up-reguleert om geheugen- en leer capaciteiten van gedprimeerde ratten te verbeteren.

Allereerst ontdekte deze studie HDAC1 expressie in hippocampale weefsels met de bevindingen die de toename in HDAC1 expressie suggereerden. Vervolgens, met het doel de functionele rollen van HDAC1 in gedprimeerde ratten te ontrafelen, werden loss-of-function assays uitgevoerd en werd onthuld dat knockdown van HDAC1 het lichaamsgewicht verhoogde, leer- en geheugencapaciteiten verbeterde, pathologische schade verzwakte, neurotransmitter expressie up-reguleerde, en oxidatieve stress en inflammatie onderdrukte in gedprimeerde ratten. Momenteel heeft een studie geïmpliceerd dat er een toename is in de expressie van HDAC1 in depressieve-achtige en angst-achtige fenotypen als gevolg van stress-nakomelingen [21]. Bovendien is de expressie van HDAC1 gedocumenteerd om op te reguleren in penumbra in fotothrombotische beroerte [22]. Daarnaast wordt de incrementele HDAC1 mRNA expressie gevonden in granule en piramidecellen in temporale loep epilepsie [23]. Wat betreft de functionele rol van HDAC1, is gerapporteerd dat virus-gemedieerde overexpressie van neuronale HDAC1 in de hippocampus van muizen invloed uitoefent op verlies van contextuele angstgeheugen in het bijzonder [24]. Mechanisch keeren HDAC-remmers cognitieve deficitiën om die gevonden worden in neurodegenerative ziekten en leeftijdsgerelateerd geheugenverlies [25]. Eigenlijk wordt geaccepteerd dat de HDAC1 onderdrukking door tianeptinaline geavanceerde neuroplasticiteit heeft en geheugen versterkt [26]. Zoals vermeld in een eerdere studie, wordt geconcludeerd dat repressie van HDAC1 de pathogene processen die leiden tot motorneuron degeneratie in mitochondriale ziekten remt [27]. Experimenteel is de silencing van HDAC1 door 5-thienyl-gesubstitueerde 2-aminobenzamide-type deels betrokken bij de preventie van neuronale celdood in Parkinson ziekte modellen [28]. Verder ondersteund door die onderzoeken, zijn de beschermende effecten van gesilenceerde HDAC1 getuigd in hersenziekten, inclusief maar niet beperkt tot depressie.

Vervolgens ontdekte onze studie een doelrelatie tussen HDAC1 en miR-124-5p, wat ondersteund werd door een eerdere studie die suggereert dat miR-124 transcriptie in de handen is van EVI1, werkend door verbinding met de deacetylaas HDAC1 [29]. miR-124-5p was het overexprimeerde gen in gedprimeerde ratten en knockdown van miR-124-5p had vergelijkbare functies als gesilenceerde HDAC1 in gedprimeerde ratten. In feite is er een studie die aangeeft dat de expressie van miR-124 in de hippocampus up-reguleert van 5 tot 6 weken in depressie-achtige gedragsfeno-typeringen [7]. Een andere studie heeft de toename in miR-124 expressie geïdentificeerd in vrouwen met cocaïne gebruikstoornis [30]. Ook is het eerder beschreven dat miR-124-3p hoog geëxprimeerd is in gestreste knaagdieren in majeure depressieve stoornis [31]. Met betrekking tot de effecten, wordt gerapporteerd dat knockdown van miR-124 in de prefrontale cortex depressie-achtig gedrag van muizen verzwakt [9]. Daarnaast wordt aangenomen dat miR-124 knockdown dient als antidepressivum middel van chronische corticosteron-geïnduceerde gypenosiden in muizen [32]. Getrokken uit een eerdere studie, kan knockdown van miR-124 resulteren in verbeterde gedragsgevoeligheid voor een mildere stress paradigma [33]. Het wordt gerapporteerd dat onderdrukking van miR-124 door lentivirus transfectie in de hippocampus kan beschermen tegen ketamine-geïnduceerde neurodegeneratie in vivo en in vitro [34]. Op welke manier dan ook, miR-124-5p onderdrukking is een actieve actor om depressie te verzwakken.

Verder werd NPY expressie geverifieerd als gereguleerd door HDAC1 en miR-124-5p. De gedeterioreerde deficitiën geassocieerd met HDAC2 in histonacetylering kunnen gerelateerd zijn aan de verminderde expressie van NPY en kunnen gebruikt worden om angst-achtige en drinkgedrag te controleren [14]. NPY was down-gereguleerd in gedprimeerde ratten en up-regulatie van NPY bevorderde leer- en geheugencapaciteitsherstel in gedprimeerde ratten. In de ontwikkeling van depressieve-achtige gedragingen, worden de rattenmodellen ge manifesteerd met verminderde NPY expressie [17]. Academisch is de expressie van NPY bewijs voor afname in muizen met depressie [35]. Consistent zijn de bovenstaande studiebevindingen tot op zekere hoogte hetzelfde als de eerdere literatuur.

De nieuwe bevindingen van de studie suggereerden dat geïnhibeerde miR-124-5p of onderdrukte HDAC1 leer- en geheugencapaciteiten versterkten en het lichaamsgewicht van gedprimeerde ratten verhoogden. Bovendien onderdrukte knockdown van miR-124-5p of inhibitie van HDAC1 oxidatieve stress en inflammatie en bevorderde neurotransmitter expressie van gedprimeerde ratten. Bovendien medeerde HDAC1 miR-124-5p om NPY te reguleren. In de reddingsexperimenten, onthield knockdown van NPY de beschermende effecten van geïnhibeerde miR-124-5p op gedprimeerde ratten.

Conclusie

Samengevat, benadrukte deze studie het effect van HDAC1/miR-124-5p/NPY as in depressie met de belangrijkste bevindingen die suggereren dat geïnhibeerde miR-124-5p of onderdrukte HDAC1 leer- en geheugencapaciteiten versterkten, lichaamsgewicht verhoogden, oxidatieve stress en inflammatie onderdrukten, alsook neurotransmitter expressie bevorderden in gedprimeerde ratten. HDAC1/miR-124-5p/NPY as kan een referentie bieden voor de behandeling van neurologische stoornissen, wat ook de bestaande kennis over depressie kan bijwerken. Echter, verdere studies zijn nog steeds vereist voor grondig begrip van het complexe mechanisme van HDAC1/miR-124-5p/NPY as in depressie.

Beschikbaarheid van data en materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

Histondeacetylaas 1

NPY:

Neuropepti Y

CUMS:

Chronische onvoorspelbare milde stress

SD:

Sprague–Dawley

SPF:

Specifieke pathogen-vrij

NC:

Negatieve controle

OFT:

Open veld test

SPT:

Sucrose voorkeur test

SPP:

Sucrose voorkeur percentage

MWM:

Morris water labyrinth test

SOD:

Superoxidedismutase

MDA:

Malondialdehyde

GSH:

Glutathione

IL-β:

Interleukine-β

TNF-α:

Tumornecrosefactor-α

NO:

Stikstofmonoxide

ELISA:

Enzyme-gekoppelde immunosorbent assay

HE:

Hematoxyline-eosine

BCA:

Bicinchoninzuur

NE:

Norepinephrine

5-HT:

Serotonine

DA:

Dopamine

RT-qPCR:

Reverse transcriptie kwantitatieve polymerase ketting reactie

cDNA:

Complementaire DNA

SDS:

Natrium dodecyl sulfaat

ChIP:

Chromatine immunoprecipitatie

UTR:

Onvertaalde regio

MUT:

Mutant type

WT:

Wild type

ANOVA:

Eensijdige variantieanalyse