HDAC1-gemedieerde MicroRNA-124-5p reguleert NPY om leer- en geheugencapaciteiten te beïnvloeden bij ratten met depressie

Materialen en methoden

Ethische verklaring

De dierproeven die bij deze studie betrokken waren, waren in overeenstemming met de vereisten van de experimentele dierethiek van The First Affiliated Hospital van de Harbin Medical University. De experimenten zijn geoptimaliseerd om de voedingscondities van proefdieren te verbeteren, het aantal gebruikte dieren te verminderen en het dierenleed te verlichten.

Experimentele dieren

Sprague-Dawley (SD) mannelijke ratten van specifieke pathogeenvrije (SPF) kwaliteit, met een gewicht van 200-220 g, werden geleverd door het Animal Research Center, First Affiliated Hospital van Harbin Medical University (Harbin, China). De ratten werden gehouden in een omgeving van SPF-kwaliteit (22-24 ° C, 60-64% vochtigheid, 12 uur licht en donker cycli). Met uitzondering van de periode tijdens het modelleren en andere specifieke tijdstippen, waren de ratten vrij om water en voedsel te krijgen.

Rattengroepering en modelvorming

De gemodelleerde ratten werden willekeurig verdeeld in 8 groepen (n = 10):normale groep (ratten zonder enige behandeling), CUMS-groep (CUMS-geïnduceerde depressieratten), sh-negatieve controlegroep (NC) (CUMS-geïnduceerde depressieratten geïnjecteerd met sh-HDAC1 lentivirus NC), sh-HDAC1-groep (CUMS-geïnduceerde depressieratten geïnjecteerd met sh-HDAC1 lentivirus), anti-miR-NC-groep (CUMS-geïnduceerde depressieratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus NC), anti-miR-124-5p-groep (CUMS- geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus), anti-miR-124-5p + sh-NC groep (CUMS-geïnduceerde depressie ratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus en sh-NPY lentivirus NC) , en anti-miR-124-5p + sh-NPY-groep (CUMS-geïnduceerde depressieratten geïnjecteerd met anti-miR-124-5p lentivirus en sh-NPY lentivirus).

CUMS-geïnduceerde depressie ratmodellen werden vastgesteld met de methode van Willner [18]. De ratten in de normale groep kregen voedsel en water zonder enige prikkels, terwijl ratten in de andere 7 groepen 35 dagen CUMS kregen in onafhankelijke kooien. Deze ratten werden gestimuleerd door gedurende 5 minuten bij 4 °C in ijswater te zwemmen in een bak (30 cm waterdiepte), dag en nacht inversie (ratten die overdag 12 uur in het donker bleven en in een heldere ruimte verlicht door gloeilampen gedurende 12 uur 's nachts), staartklemming door een zwaluwstaartklem gedurende 30 s, 1 minuut schudden, 24 uur vasten en wateronthouding, 30 minuten ultrasone stimulatie (50 Hz), natte opvulling en airconditioning op 17℃. Ratten werden dagelijks willekeurig gestimuleerd door een van deze stimuli en dezelfde stimulus werd in totaal niet meer dan 5 keer toegepast.

Ratten werden verdoofd met 2% pentobarbital-natrium (50 mg/kg) en bilaterale hippocampus (anteroposterieure diameter = 4,8 mm, mediolaterale afstand =  ± 2,5 mm, afstand tussen rugholte en voorste fontanel = − 3,5 mm) werden geïnjecteerd met lentivirus op 1 μL/min door een Hamilton micro-spuit met een 26-G naald. De naald werd 5 minuten op de injectieplaats gehouden om reflux te voorkomen. De schedels werden verzegeld met botwas en de incisies werden gehecht, en de ratten werden 7 dagen teruggevonden [19]. sh-HDAC1 lentivirus en zijn NC, anti-miR-124-5p lentivirus en zijn NC, evenals sh-NPY en zijn NC (titer:10 ⁸ TU/mL) werden gekocht van GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Gedragsfunctietests

Ratten werden gewogen op de dag vóór CUMS-modellering (op de 0-dag), na CUMS-modellering (op de 36e dag) en na lentivirusinterferentie (op de 52e dag).

Een open-veldtest (OFT) zou het autonome en verkennende gedrag van ratten in een nieuwe omgeving kunnen detecteren, die vaak werd gebruikt om depressief gedrag te evalueren. Deze test werd uitgevoerd in een zwarte houten open velddoos (100 cm × 100 cm × 50 cm) met een videovolgsysteem boven de open velddoos om rattenactiviteiten vast te leggen. De onderkant van de open doos was verdeeld in 25 rasters (20 cm × 20 cm) met witte lijnen. De ratten werden in een vooraf gedefinieerde willekeurige volgorde in het centrale rooster geplaatst en de mate waarin ze het rooster kruisten (ratten die een rooster binnengingen met ledematen of dubbele voorpoten met één achterpoot) en het optreden van opfok (ratten die voorpoten optillen en rechtop staan ​​​​met één achterpoot) achterpoot) werden opgenomen door het videovolgsysteem. Deze test is uitgevoerd in een stille en schemerige binnenomgeving. Na elke test werd de open velddoos schoongemaakt met 75% alcohol om geuren te verwijderen.

Anhedonie was een van de cruciale symptomen van depressie. De sucrose-voorkeurstest (SPT) zou het depressieve gedrag van ratten kunnen evalueren. Vóór SPT werd elke rat gedurende 24 uur voorzien van 2 flessen suikerwater (1% sucrose, w/w) en nog eens 24 uur van 1 fles steriel water en 1 fles suikerwater. Daarna werd het sucrosevoorkeurspercentage (SPP) van ratten als volgt gedetecteerd:na 23 uur vasten en wateronthouding mochten ratten gedurende 30 minuten 1 fles steriel water en 1 fles suikerwater (1% sucrose) gebruiken. Na 1 uur was de locatie van de twee flessen omgekeerd en waren de ratten nog 30 minuten vrij om deze twee flessen te gebruiken. Gedurende deze 1 uur werd het verbruik (ml) van deze twee flessen steriel water en suikerwater (1% sucrose) gemeten en werd SPP berekend. SPP = suikerwaterverbruik/(suikerwaterverbruik + steriel waterverbruik) × 100%.

Morris water maze test (MWM) werd op grote schaal toegepast om het ruimtelijke leer- en geheugenvermogen van ratten te evalueren. MWM-test werd uitgevoerd in een cirkelvormige watertank (150 cm in diameter en 60 cm in hoogte) met een waterdiepte van 40 cm. De watertemperatuur werd op 22 ±-1 °C gehouden en het water werd zwart geverfd met niet-giftige en gemakkelijk te reinigen verf. De tank en het wateroppervlak waren verdeeld in 4 kwadranten (SE, SW, NW en NE kwadranten) waarbij elk kwadrant versierd was met het bijbehorende pictogram met een felle kleur en een speciale vorm op de binnenmuur. Het doelplatform was een cirkelvormig transparant platform (11 cm in diameter), gelegen in het midden van het NO-kwadrant en 1,5 cm onder het wateroppervlak ondergedompeld. Boven het midden van de tank werd een videovolgsysteem geïnstalleerd om de zwemsnelheid, het pad en de tijd die werd besteed aan ratten die op het doelplatform kwamen en in kwadranten zwemmen, vast te leggen. Ratten werden in willekeurige volgorde uit 4 kwadranten in water geplaatst en mochten het doelplatform binnen 60 s verkennen en aan boord gaan. De tijd die ratten nodig hadden om aan boord van het platform te gaan, werd geregistreerd als de ontsnappingslatentie. Als ratten er niet in slaagden om binnen 60 s aan boord van het doelplatform te komen, werden ze geleid en werd de ontsnappingslatentie geregistreerd als 60 s. Na elke test mochten ratten 15 seconden op het doelplatform blijven en werden ratten 4 keer per dag gedurende 5 dagen getraind. De uiteindelijke ontsnappingslatentie was het gemiddelde van de ontsnappingslatentie op de 3e-5e. Op de 6e dag van de MWM-test werd een ruimteverkenningstest uitgevoerd. Het doelplatform werd uit de watertank verwijderd en de ratten gingen het water in vanuit het ZW-kwadrant. De tijd van ratten die binnen 60 s in het NE-kwadrant zwommen, werd geregistreerd als de ruimteverkenningstijd.

De tijdlijn van dit experiment wordt getoond in Fig. 1.

Chronologie van de huidige studie

Specimenverzameling

Een dag na de laatste MWM-test werden de ratten geëuthanaseerd en intraperitoneaal geïnjecteerd met 2% pentobarbital-natrium (50 mg/kg). De borstholte werd geopend om hartbloed te verkrijgen met een injectiespuit, die 3 keer gedurende 15 minuten bij 3500 tpm werd gecentrifugeerd, en het supernatant werd bewaard bij -20 ° C. Na bloedafname werd een katheter ingebracht van de linker hartkamer naar de aorta en werd 500 ml normale zoutoplossing geperfuseerd om het volledige bloed te spoelen. Hippocampusweefsels werden gescheiden en in centrifugebuizen van 1, 5 ml geplaatst, gewogen en bewaard bij -80 ° C. Een deel van de hippocampus werd gedurende 2 uur gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd met gradiëntsucrose en ingebed in paraffine.

Detectie van oxidatieve stress en ontstekingsindex

Het serum werd opgewarmd voor detectie van superoxide dismutase (SOD), malondialchehyche (MDA), glutathion (GSH), interleukine (IL)-β, tumornecrosefactor-α (TNF-α) en stikstofmonoxide (NO) concentratie. Kits voor detectie van SOD, MDA en GSH werden geleverd door Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China), terwijl enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kits voor detectie van IL-β, TNF-α en NO door NanJing JianCheng Bioengineering Institute ( Nanjing, China).

Hematoxyline–eosine (HE)-kleuring

De paraffinesecties werden van was ontdaan, gehydrateerd met ethanol, gespoeld met gedestilleerd water en gekleurd met hematoxylinekleuringsoplossing gedurende 20 minuten. Daarna werden de coupes gespoeld met kraanwater totdat de coupes blauw werden. Vervolgens werden de secties gedurende 10 seconden in een 1% ethanolische zoutzuuroplossing geplaatst, gespoeld met kraanwater en gedehydrateerd met ethanol, gevolgd door kleuring in eosine gedurende 2 minuten, dehydratatie met alcohol met een hoge concentratie en permeabilisatie in xyleen. Ten slotte werden de coupes verzegeld en bekeken onder een biologische microscoop.

Detectie van neurotransmitter-expressie

De hippocampusweefsels werden gewogen en gehomogeniseerd door middel van ultrageluid in normale zoutoplossing (100 L/10 mg). Het homogenaat werd 30 minuten op 4 ° C gehouden, 3 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 rpm (4 ° C) om het supernatant te verzamelen. De eiwitconcentratie van het supernatant werd gedetecteerd door bicinchoninezuur (BCA) eiwitdetectiekit (CWBIO, Beijing, China) en de expressieniveaus van norepinefrine (NE), serotonine (5-HT) en dopamine (DA) door ELISA-kits. NE, 5-HT en DA ELISA-kits werden geleverd door Liweiping Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China).

Reverse transcriptie Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

RNA werd geëxtraheerd uit hippocampusweefsels door RNA-extractiekit (Promega, Madison, WI, VS), en de concentratie en zuiverheid van het RNA werden gedetecteerd door een ultraviolette spectrofotometer. Gevolgd door de instructies voor de reverse transcriptiekit (DRR047S, Takara, Dalian, China), werd RNA reverse transcriptie in complementair DNA (cDNA) uitgevoerd. mRNA werd omgekeerd in cDNA getranscribeerd door GoldScript eenstaps RT-PCR Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, VS) terwijl miRNA door Hairpin-it ™ miRNA kwantitatieve detectiekit (GenePharma). RT-qPCR-detectiekit (Promega) werd toegepast om HDAC1-, miR-124-5p- en NPY-expressie in weefsels te detecteren. U6 was geïndiceerd als interne controle voor miR-124-5p, terwijl β-actine voor HDAC1 en NPY. PCR-primers werden verkregen van Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabel 1). De relatieve expressie van doelgenen werd berekend door 2 ^−△△ Ct-methode.

Western Blot-analyse

De hippocampusweefsels werden op ijs in stukken gesneden en gelyseerd door lysaat van radio-immunoprecipitatie-assay (Beijing Solarbio Science &Technology Co. Ltd., Beijing, China) om eiwit te extraheren. De eiwitconcentratie werd bepaald met de BCA-methode. Totaal eiwit (50 g) werd toegevoegd met 5 x natriumdodecylsulfaat (SDS) laadbuffer bij 1:4 en gedurende 5 minuten in een kokend waterbad verwarmd. Vervolgens werd het eiwit onderworpen aan natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, op een membraan geëlektroblot en gedurende 1 uur geblokkeerd met 5% melk. Daarna werd het eiwit onderzocht met de primaire antilichamen tegen HDAC1 (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, VS), NPY (1:800, NeoMakers, Fremont, Californië, VS) en β-actine (1:):1000, Abcam, Cambridge, MA, VK) 's nachts, en opnieuw onderzocht met mierikswortelperoxidase-gelabeld secundair antilichaam. Het membraan werd ontwikkeld door verbeterde chemiluminescentie en de optische dichtheid werd berekend met behulp van de Quantum One grijsanalysesoftware. De eiwitexpressie van het doelgen werd uitgedrukt als de verhouding van de grijswaarde tot de β-actine grijswaarde.

Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)-assay

ChIP-assay werd uitgevoerd in overeenstemming met de instructies van de EZ-ChIP-kit (Millipore, Bedford, MA, VS). HEK293T-cellen werden 10 minuten geïncubeerd met 1% formaldehyde en beëindigd met glycine. Vervolgens werden de cellen gedurende 5 minuten bij 2000 rpm gecentrifugeerd en toegevoegd met SDS-lysebuffer voor ultrasone trillingen. Gecentrifugeerd bij 10.000 g bij 4 gedurende 10 minuten, werden de cellen (100 L) gereageerd met 900 μL ChIP-verdunningsbuffer, 20 μL 50  ×  PIC en 60 μL ProteinA Agarose / Salmon Sperm-DNA bij 4 gedurende 1 uur, en werden 10 min laten staan. De precipitaten werden gedurende 1 minuut bij 700 rpm gecentrifugeerd met 20 L als invoer. Een buis werd toegevoegd met HDAC1-antilichaam (1 L) en immunoglobuline G-antilichaam en de andere buis werd toegevoegd zonder antilichaam. De monsters in de twee buizen werden overnacht geïncubeerd, geëlueerd en ontknoopt. Na het ophalen van het DNA werd het monster getest met RT-qPCR.

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

Bioinformatics-website (//cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) analyseerde de bindingsplaatsen van miR-124-5p en NPY. NPY-wildtype (WT) en NPY-mutant (MUT) plasmiden werden gegenereerd door Huayueyang Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). Gecombineerd met mimic NC of miR-124-5p mimic, werden de plasmiden getransfecteerd in HEK293T-cellen. De activiteit van celluciferase werd bepaald door de luciferasedetectiekit (BioVision) en Glomax20/20 luminometer (Promega).

Statistische analyse

SPSS 21.0 statistische software (IBM Corp. Armonk, NY, VS) werd gebruikt voor gegevensanalyse. De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde  ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden getest door t test. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), waarna paarsgewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc-test. P vertegenwoordigde tweezijdige tests en P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Remming van HDAC1 of miR-124-5p verhoogt het gewicht van depressieve ratten

Ratten werden 1 dag vóór CUMS-modellering (dag 0), 1 dag na stopzetting van modellering (dag 36) en 7 dagen na lentivirusinterferentie (dag 52) gewogen. Er werd geen verschil gedetecteerd in het lichaamsgewicht van ratten in elke groep vóór het modelleren (alle P> 0,05). Na modellering nam het rattengewicht af in de CUMS-groep, sh-NC-groep, sh-HDAC1-groep, anti-miR-NC-groep en anti-miR-124-5p-groep versus de normale groep (alle P < 0.05). Er werd geen discrepantie opgemerkt met betrekking tot het gewicht van de rat in de CUMS-groep, sh-NC-groep, sh-HDAC1-groep, anti-miR-NC-groep en anti-miR-124-5p-groep (alle P> 0,05). Na interferentie nam het gewicht van de rat af in de CUMS-groep versus de normale groep (alle P < 0.05). Er werd geen discrepantie opgemerkt met betrekking tot het gewicht van de rat in de CUMS-groep, sh-NC-groep en anti-miR-NC-groep (alle P> 0,05). Het rattengewicht nam toe in de sh-HDAC1-groep en de anti-miR-124-5p-groep ten opzichte van hun NC-groepen (beide P <-0.05), wat aangeeft dat remming van HDAC1 of miR-124-5p het gewicht van depressieve ratten verhoogde (Fig. 2a).

Remming van HDAC1 of miR-124-5p verhoogt het gewicht en verbetert het leer- en geheugenvermogen van depressieve ratten. een Effecten van remming met HDAC1 of miR-124-5p op het lichaamsgewicht van depressieve ratten; b SPP voor en na remming met HDAC1 of miR-124-5p; c Frequentie van het overschrijden van de gird in OFT voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; d Incidentie van opfok in OFT voor en na remming met HDAC1 of miR-124-5p; e Escape-latentie in MWM-test voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; v Ruimteverkenningstijd in MWM-test voor en na inhibitie met HDAC1 of miR-124-5p; n = 10; een P < 0,05 vergeleken met de normale groep; b P <-0,05 vergeleken met de sh-NC-groep; c P <-0,05 vergeleken met de anti-miR-NC-groep. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd door one-way ANOVA en paarsgewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

Remming van OFWEL HDAC1 of miR-124-5p verbetert leer- en geheugenvermogen bij depressieve ratten

SPT-, OFT- en MWM-tests werden toegepast om SPP, frequentie van het overschrijden van het raster en incidentie van fokken te detecteren, evenals ontsnappingslatentie en ruimteverkenningstijd. Er werd geschetst dat (Fig. 2b-f) vóór interferentie, in vergelijking met de normale groep, SPP, frequentie van het overschrijden van het raster, incidentie van opfok en ruimteverkenningstijd verminderd, terwijl ontsnappingslatentie verlengd in de CUMS-groep, sh-NC groep, sh-HDAC1-groep, anti-miR-NC-groep en anti-miR-124-5p-groep (allemaal P <-0,05), wat de ontwikkeling van depressie-achtig gedrag bij ratten suggereert. Er was geen discrepantie in SPP, frequentie van het overschrijden van het raster, incidentie van fokken, ruimteverkenningstijd en ontsnappingslatentie tussen de CUMS-groep, sh-NC-groep, sh-HDAC1-groep, anti-miR-NC-groep en anti-miR-124 -5p groep (alle P> 0,05). Na interferentie, versus de sh-NC-groep en anti-miR-NC-groep, SPP, nam de frequentie van het oversteken van het raster, de incidentie van fokken en ruimteverkenningstijd toe, terwijl de ontsnappingslatentie verkortte in de sh-HDAC1-groep en anti-miR-124- 5p groep (alle P < 0.05). Er werd geen verschil waargenomen in SPP, frequentie van het overschrijden van het raster, incidentie van fokken, ruimteverkenningstijd en ontsnappingslatentie tussen de CUMS-groep, sh-NC-groep en anti-miR-NC-groep (alle P>-0,05), wat suggereert dat het tot zwijgen brengen van HDAC1 of onderdrukking van miR-124-5p depressie-achtig gedrag zou kunnen verminderen en het leer- en geheugenvermogen bij ratten zou kunnen verbeteren.

Remming van HDAC1 of miR-124-5p vermindert pathologische neuronschade bij depressieve ratten

Observatie van hippocampale laesies door HE-kleuring (Fig. 3a) onthulde dat de netjes gerangschikte neuronen in de hippocampus van ratten in de normale groep een duidelijke morfologie, normale structuur, dichte lagen, heldere celkernen en duidelijke nucleoli vertoonden. De neuronen van ratten in de CUMS-groep waren gekrompen, verminderd in aantal en losjes gerangschikt met ongelijk verdeelde chromatine en verdunde laag. De ratten in de sh-NC- en anti-miR-NC-groepen vertoonden dezelfde situatie als de CUMS-groep. De ratten in de sh-HDAC1- en anti-miR-124-5p-groepen vertoonden verhoogde neuronen in volgorde en verzwakte schade in vergelijking met hun NC-groepen. Er werd aangegeven dat knockdown van HDAC1 of remming van miR-124-5p hippocampale laesies verlichtte bij depressieve ratten.

Remming van HDAC1 of miR-124-5p verzwakt pathologische schade aan de hippocampus en reguleert de expressie van neurotransmitters bij depressieve ratten. een HE-kleuring van hippocampale laesies van depressieve ratten; b ELISA van NE-expressie in hippocampale weefsels; c ELISA van 5-HT-expressie in hippocampale weefsels; d ELISA van DA-expressie in hippocampale weefsels; n = 6; een P < 0,05 vergeleken met de normale groep; b P <-0,05 vergeleken met de sh-NC-groep; c P <-0,05 vergeleken met de anti-miR-NC-groep. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd door one-way ANOVA en paarsgewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

Remming van HDAC1 of miR-124-5p up-reguleert de expressie van neurotransmitters bij depressieve ratten

Depressie was gerelateerd aan stoornissen in de neurotransmitters in de hersenen. Daarom werden de niveaus van DA-, NE- en 5-HT-neurotransmitters in de hippocampus van de rat gemeten met ELISA. De resultaten gaven aan dat (Fig. 3b-d) met de normale groep daarentegen verminderde niveaus van DA, NE en 5-HT werden gevonden bij ratten van de CUMS-groep, sh-NC-groep, sh-HDAC1-groep, anti-miR -NC-groep en anti-miR-124-5p-groep (allemaal P < 0.05). Er werd geen verschil waargenomen in de neurotransmitterexpressie in de CUMS-groep, sh-NC-groep en anti-miR-NC-groep (alle P> 0,05). Ten opzichte van de sh-NC- en anti-miR-NC-groepen namen de DA-, NE- en 5-HT-niveaus toe bij ratten van de sh-HDAC1- en anti-miR-124-5p-groepen (alle P <-0.05), wat impliceert dat neerwaartse regulatie van HDAC1 of reductie van miR-124-5p de niveaus van DA, NE en 5-HT in de hippocampus van depressieve ratten zou kunnen opreguleren.

Remming van HDAC1 of miR-124-5p onderdrukt oxidatieve stress en ontsteking bij depressieve ratten

Oxidatieve stressgerelateerde en ontstekingsfactorexpressie in serum werden gemeten. Met betrekking tot de normale groep waren de SOD- en GSH-activiteiten verminderd, terwijl de MDA-, IL-1β-, TNF-α- en NO-niveaus waren verhoogd in de andere depressiemodelgroepen (alle P < 0.05). SOD- en GSH-activiteiten en niveaus van MDA, IL-1β, TNF-α en NO in de CUMS-groep, sh-NC-groep en anti-miR-NC-groep vertoonden geen verschil (alle P> 0,05). Met betrekking tot de sh-NC-groep en anti-miR-NC-groep werd een toename waargenomen in de SOD- en GSH-activiteiten en werd een afname waargenomen in de MDA-, IL-1β-, TNF-α- en NO-niveaus in de sh- HDAC1-groep en anti-miR-124-5p-groep (allemaal P <-0.05) (Fig. 4a-f), wat aangeeft dat uitputting van HDAC1 of neerwaartse regulatie van miR-124-5p oxidatieve stress en ontsteking bij depressieve ratten zou kunnen verlichten.

Remming van HDAC1 of miR-124-5p onderdrukt oxidatieve stress en ontsteking bij depressieve ratten. een –c Effect van remming van HDAC1 of miR-124-5p op SOD-, MDA- en GSH-concentratie in serum van depressieve ratten; d –f Effect van remming van HDAC1 of miR-124-5p op IL-1β-, TNF-α- en NO-concentratie in serum van depressieve ratten; n = 10; een P < 0,05 vergeleken met de normale groep; b P <-0,05 vergeleken met de sh-NC-groep; c P <-0,05 vergeleken met de anti-miR-NC-groep. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd door one-way ANOVA en paarsgewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

HDAC1 bemiddelt miR-124-5p om NPY te reguleren

RT-qPCR en western blot-analyse werden toegepast voor de detectie van HDAC1, miR-124-5p en NPY in de hippocampus. Er werd geschetst dat (Fig. 5a, b) versus de normale groep, HDAC1 en miR-124-5p toenam en NPY afnam in de CUMS-groep (alle P < 0.05). HDAC1-, miR-124-5p- en NPY-expressie vertoonden geen variaties in de CUMS-groep en sh-NC-groep (alle P> 0,05). Ten opzichte van de sh-NC-groep werd de sh-HDAC1-groep weerspiegeld door verlaagde HDAC1 en miR-124-5p en verhoogde NPY-expressieniveaus (alle P < 0.05). De bovenstaande bevindingen suggereerden de succesvolle lentivirus-interferentie en de positieve relatie tussen miR-124-5p en HDAC1-expressie.

HDAC1 bemiddelt miR-124-5p om NPY te reguleren. een HDAC1-, miR-124-5p- en NPY-mRNA-expressie in hippocampale weefsels na remming van HDAC1 door RT-qPCR (n = 6); b HDAC1- en NPY-eiwitexpressie in hippocampale weefsels na remming van HDAC1 door western-blot-analyse (n = 6); c MiR-124-5p en NPY mRNA-expressie in hippocampale weefsels na remming van miR-124-5p door RT-qPCR (n = 6); d NPY-eiwitexpressie in hippocampale weefsels na remming van miR-124-5p door western blot-analyse (n = 6); een P < 0,05 vergeleken met de normale groep; c P <-0,05 vergeleken met de sh-NC-groep. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd door one-way ANOVA en paarsgewijze vergelijkingen door Tukey's post hoc test

Ook werden miR-124-5p- en NPY-expressie na miR-124-5p-onderdrukking gedetecteerd met de resultaten (Fig. 5c, d) die aantonen dat in relatie tot de normale groep verhoogde miR-124-5p en verminderde NPY werden gepresenteerd in de CUMS-groep (beide P < 0.05). Integendeel, de anti-miR-124-5p-groep neigde naar verlaagde miR-124-5p en verhoogde NPY in relatie tot de anti-miR-NC-groep (beide P < 0.05). Er werd geen discrepantie herkend in de miR-124-5p- en NPY-expressie in de CUMS-groep en anti-miR-NC-groep (beide P> 0,05). De resultaten waren indicatief voor de succesvolle lentivirus-interferentie en de negatieve verbinding tussen NPY en miR-124-5p.

ChIP-assay was om te testen of HDAC1 kon binden aan de miR-124-5p-promotor, en de resultaten toonden aan dat (Fig. 6a, b) HDAD1 alleen gerelateerd was aan de miR-124-5p-promotor (P < 0.001), wat aangeeft dat HDAC1 miR-124-5p direct zou kunnen reguleren.

HDAC1 bindt aan de promotor van miR-124-5p. een Bindende overvloed aan HDAC1- en miR-124-5p-promoterregio in HEK293T-cellen door ChIP-assay (n = 3); b Bindende overvloed aan HDAC1 en niet-gerelateerde intergene regio's in HEK293T-cellen door ChIP-assay (n = 3); c MiR-124-5p en NPY-bindingssite door biologische informatiesoftwarewebsite; d Targeting-relatie tussen miR-124-5p en NPY door dubbele luciferase-reportergentest (n = 3); Vergelijkingen tussen twee groepen werden getest door t testen

De targeting-relatie tussen miR-124-5p en NPY werd voorspeld en geverifieerd door middel van RNA22-tool en dubbele luciferase-reportergentest (Fig. 6c, d). With respect to the cells co-transfection with NPY-3′UTR-WT and mimic NC, the cells with co-transfection of NPY-3′UTR-WT and miR-124-5p mimic showed impaired luciferase activity (P < 0.05). No difference was recognized in the luciferase activity in the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and mimic NC, and the cells co-transfected with NPY-3′UTR-MUT and miR-124-5p mimic (P  > 0.05).

Knockdown of NPY Abolishes the Protective Effects of Inhibited miR-124-5p on Depressed Rats

Spontaneous depletion of NPY and miR-124-5p was programmed to explore their interplay in depressed rats. It was exhibited that (Fig. 7a, b) lower NPY expression level was noticed in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (P < 0.05). Body weight and behavioral function tests illustrated that (Fig. 7c–f) by comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group presented reduced weight, SPP, frequency of crossing the grid, incidence of rearing and space exploration time with increased escape latency (all P < 0.05). HE staining of the hippocampal lesions pictured that (Fig. 8a) in comparison with the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the number of hippocampal neurons was reduced, and hippocampal neurons were darkly stained, sparsely and disorderly arranged in an irregular shape with reduced cell layers in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group. Moreover, versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group, the rats in the anti-miR-124-5p + sh-NPY group was accompanied by reduced DA, NE and 5-HT (all P  < 0.05) (Fig. 8b). Besides, impaired SOD and GSH activities, and increased MDA, IL-1β, TNF-α and NO levels existed in the rats of the anti-miR-124-5p + sh-NPY group versus the anti-miR-124-5p + sh-NC group (all P  < 0.05) (Fig. 8c, d). Collectively, knockdown of NPY abolished the protective effects of repressed miR-124-5p on depressed rat.

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on body weight and behavioral function of depressed rats. een MiR-124-5p and NPY mRNA expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by RT-qPCR (n = 6); b NPY protein expression in hippocampal tissues after inhibition of both miR-124-5p and NPY by western blot analysis (n = 6); c Body weight of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); d SPP of depressed rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); e Frequency of crossing the grid and incidence of rearing after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 10); v Escape latency and space exploration time after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 10); Comparisons between two groups were tested by t testen

Knockdown of NPY abolishes the effects of inhibited miR-124-5p on hippocampal damages of depressed rats. een HE staining of hippocampal lesions of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n = 6); b ELISA of NE, 5-HT and DA expression in hippocampal tissues of rats after inhibition of both miR-124-5p and NPY (n  = 6); C. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on SOD, MDA and GSH concentration in serum (n  = 10); D. Effect of inhibited NPY and suppressed miR-124-5p on IL-1β, TNF-α and NO concentration in serum (n = 10). Comparisons between two groups were tested by t testen

Discussion

Depression is a type of psychiatric disorder comprising a variety of conditions with diverse symptoms [20]. Though emerging studies have implied the role of miRNAs in depression, the precise action of miR-124-5p has been rarely investigated. Hence, the present study is projected for better comprehension of the mechanism of miR-124-5p/HDAC1/NPY axis in depression with the major outcome elaborating that silencing of either HDAC1 or miR-124-5p up-regulated NPY to improve memory and learning abilities of depressed rats.

To begin with, this study discovered HDAC1 expression in hippocampal tissues with the findings suggesting the elevation in the HDAC1 expression. Subsequently, with the purpose to decipher the functional roles of HDAC1 in depressed rats, loss-of-function assays were performed and it was disclosed that knockdown of HDAC1 increased the body weight, improved learning and memory abilities, attenuated pathological damage, up-regulated neurotransmitter expression, and suppressed oxidative stress and inflammation in depressed rats. Currently, a study has implied an increment in the expression of HDAC1 in depressive-like and anxiety-like phenotypes resulted by stress-offspring [21]. Moreover, the expression of HDAC1 is documented to up-regulate in penumbra in photothrombotic stroke [22]. Besides that, the incremental HDAC1 mRNA expression is found in granule and pyramidal cells in temporal lobe epilepsy [23]. As to the functional role of HDAC1, it has been reported that virus-mediated overexpression of neuronal HDAC1 in the hippocampus of mice imposes influences on loss of contextual fear memory in particular [24]. Mechanically, HDAC inhibitors reverse cognitive deficits found in neurodegenerative diseases and age-related memory loss [25]. Actually, it is accepted that the HDAC1 suppression by tianeptinaline has advanced neuroplasticity and reinforced memory [26]. As mentioned in a prior study, it is concluded that repression of HDAC1 inhibits the pathogenic processes that lead to motor neuron degeneration in mitochondrial diseases [27]. Experimentally, the silencing of HDAC1 by 5-thienyl-substituted 2-aminobenzamide-type is partially involved in the prevention of neuronal cell death in Parkinson's disease models [28]. Further supported by those researches, the protective effects of silenced HDAC1 have been witnessed in brain diseases, including but not limited to depression.

Then, our study discovered a targeting relationship between HDAC1 and miR-124-5p, which was supported by a prior study which suggests miR-124 transcription is in the charge of EVI1, acting by connection with the deacetylase HDAC1 [29]. miR-124-5p was the overexpressed gene in depressed rats and knockdown of miR-124-5p had the similar functions of silenced HDAC1 in depressed rats. In fact, there is a study indicating that the expression of miR-124 in the hippocampus is up-regulated from 5 to 6 weeks in depression-like behavior phenotypes [7]. Another study has identified the increase in the miR-124 expression in female with cocaine use disorder [30]. Also, it is previously described that miR-124-3p is highly expressed in stressed rodents in major depressive disorder [31]. Regarding to the effects, knockdown of miR-124 in the prefrontal cortex is reported to attenuate depression-like behavior of mice [9]. Besides that, miR-124 knockdown is believed to serve as an antidepressant agent of chronic corticosterone-induced gypenosides in mice [32]. Drawn from a prior study, knockdown of miR-124 can result in improved behavioral susceptibility to a milder stress paradigm [33]. It is reported that suppression of miR-124 by lentivirus transfection in the hippocampus can protect ketamine-induced neurodegeneration in vivo and in vitro [34]. Anyway, miR-124-5p suppression is an active actor to attenuate depression.

Furthermore, NPY expression was verified to be regulated by HDAC1 and miR-124-5p. The deteriorated deficits associated with HDAC2 in histone acetylation may be related to the decreased expression of NPY and can used to control anxiety-like and drinking behaviors [14]. NPY was down-regulated in depressed rats and up-regulation of NPY promoted learning and memory ability recovery in depressed rats. In the development of depressive-like behaviors, the rat models are manifested with reduced NPY expression [17]. Academically, the expression of NPY is evidenced to decline in mice with depression [35]. Consistently, the above-mentioned study findings are as same as the previous literature to some extent.

The novel findings of study suggested that inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities and increased body weight of depressed rats. In addition, knockdown of miR-124-5p or inhibition of HDAC1 suppressed oxidative stress and inflammation and promoted neurotransmitter expression of depressed rats. Moreover, HDAC1 mediated miR-124-5p to regulate NPY. In the rescue experiments, knockdown of NPY abolished the protective effects of inhibited miR-124-5p on depressed rats.

Conclusion

In summary, this study highlighted the effect of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression with the major findings suggesting inhibited miR-124-5p or suppressed HDAC1 attenuated learning and memory abilities, increased body weight, suppressed oxidative stress and inflammation, as well as promoted neurotransmitter expression in depressed rats. HDAC1/miR-124-5p/NPY axis may provide a reference to treat neurological disorder, which may also update the existed knowledge of depression. However, further studies are still required for thorough comprehension of the complex mechanism of HDAC1/miR-124-5p/NPY axis in depression.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

miR-124-5p:

MicroRNA-124-5p

HDAC1:

Histone deacetylase 1

NPY:

Neuropeptide Y

CUMS:

Chronic unpredictable mild stress

SD:

Sprague–Dawley

SPF:

Specific pathogen-free

NC:

Negative control

OFT:

Open field test

SPT:

Sucrose preference test

SPP:

Sucrose preference percentage

MWM:

Morris water maze test

SOD:

Superoxide dismutase

MDA:

Malondialchehyche

GSH:

Glutathion

IL-β:

Interleukin-β

TNF-α:

Tumor necrosis factor-α

NO:

Nitric oxide

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

HE:

Hematoxylin–eosin

BCA:

Bicinchoninic acid

NE:

Norepinephrine

5-HT:

Serotonin

DA:

Dopamine

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

cDNA:

Complementary DNA

SDS:

Natriumdodecylsulfaat

ChIP:

Chromatin immunoprecipitation

UTR:

Untranslated region

MUT:

Mutant type

WT:

Wild type

ANOVA:

One-way analysis of variance