Nano-kleien: een veelbelovende nano-immuunverdediging tegen COVID-19

Samenvatting

Ondanks tal van pogingen kan de ontwikkeling van een effectieve vaccin tegen COVID-19 nog lang duren. Traditionele/natuurlijke geneesmiddelen, die al door mensen worden ervaren, kunnen een vroegere oplossing bieden. Gezien de ervaring van het onderzoeks team met het gebruik van nano-kleien als hoog-affiniteit materiaal voor kankermetastasen, melanombehandeling en botregeneratie, stellen we voor deze nano-kleien te gebruiken voor de preventie/behandeling van COVID-19. Vanwege hun hoge affiniteit zouden nano-kleien de virussen kunnen vangen voordat deze binden met het humane hACE2. In deze studie zijn moleculaire simulaties en modellering van de interactie tussen coronavirus spike- en hACE2-eiwitten uitgevoerd, met en zonder nano-kleien. De resultaten toonden een zeer hoge mate van affiniteit/cohesie tussen SARS-CoV-2 spike en nano-kleien vergeleken met die tussen de spike en hACE2. We stellen dat deze nano-kleien, die al als dragers voor geneesmiddelen worden gebruikt, ook geïnjecteerd kunnen worden als 'alleen-kleien' geneesmiddel. Aanbevelingen voor toekomstige in vitro en in vivo studies worden gegeven.

Achtergrond

Het plotselinge opduiken en de snelle verspreiding van het nieuwe coronavirus, SARS-CoV-2, hebben de gezondheid en het leven van mensen aanzienlijk beïnvloed, naast een kritieke impact op de wereldeconomie. Het SARS-CoV-2 spike S-eiwit bindt met hoge affiniteit aan het humane angiotensine-converterend enzyme 2 (hACE2) en gebruikt dit als ingangsreceptor om doelcellen binnen te dringen. Het spike-eiwit op het virusoppervlak medieert de coronaviruseinstap in gastheercellen. De SARS-CoV-2 spike bevat een receptor-bindend domein (RBD) dat specifiek hACE2 herkent als receptor. Het oppervlak van hACE2 bevat twee virus-bindende hotspots die cruciaal zijn voor de binding van SARS-CoV-2 S. Verschillende natuurlijk geselecteerde mutaties in het SARS-CoV-2 RBD omringen deze hotspots en reguleren de infectiositeit, pathogenese en cross-species en mens-tot-mens transmissie.

Op dit moment zijn er geen klinisch goedgekeurde vaccins of geneesmiddelen die specifiek SARS-CoV-2 targeten. Volgens het standaardprotocol voor vaccinontwikkeling kan het nog lang duren voordat een effectief vaccin beschikbaar is. Er is veel interesse in de ontwikkeling van therapeutische antilichamen tegen SARS-CoV-2. Ondanks veel pogingen zijn deze antilichamen nog niet ontdekt, behalve in een paar proeven. Een proef toonde krachtige neutralisatie van SARS-CoV-2 door binding aan het RBD van het S-glycoproteïne. In deze proef worden antilichaamcocktails, een mengsel van verschillende antilichamen, aanbevolen vanwege het verhoogde neutralisatie-effect. Echter, het gebruik van antilichamen van genesen SARS-CoV patiënten om SARS-CoV infecties te behandelen heeft in het verleden geleid tot bijwerkingen zoals Antilichaam-Avhangige Versterking (ADE), wat verhoogde virale infectiositeit en schadelijke immuunreacties veroorzaakte. Bovendien, gebaseerd op ervaringen met vaccinontwikkeling voor SARS-CoV en MERS, lijken de kansen op succes voor SARS-CoV-2 dun. Daarom kunnen natuurlijke/traditionele geneesmiddelen met een historie van veilige consumptie door mensen als een van de behandelopties voor SARS-CoV-2 worden overwogen. Omdat nano-kleien een natuurlijk materiaal zijn met een historie van menselijk gebruik, stellen we 'hooggeladen nano-kleien' voor als coronavirus-blokkeerders en inhibitoren van de spike-gemedieerde instap in humane cellen.

Nano-kleien, nano-grote natuurlijke materialen afkomstig van mineralen in sedimentgesteenten, hebben een zeer hoge affiniteit voor bacteriën en virussen. Vanwege isomorphe substitutie in hun moleculaire structuur vertonen deze nano-kleien een ladingsdeficiëntie op hun oppervlakken. Deze ladingsdeficiëntie wordt geneutraliseerd door watermoleculen en opgeloste kationen. De geladen structuur en het grote oppervlak van kleinanodeeltjes geven ze een affiniteit voor geladen entiteiten, zoals op bacteriële oppervlakken en bacteriële toxinen. Hun unieke biomedische eigenschappen omvatten hoge absorptie, de mogelijkheid om microben te omhullen, en geen toxiciteit. Elk van de elektrisch actieve kleimineralen heeft zijn eigen morfologie, karakteristieken en interactiegedrag. De best bestudeerde biomedische toepassing van nano-kleien is het dienen als dragers en complexen voor antikankergeneesmiddelen zoals 5-fluorouracil en trastuzumab. Ze zijn daarom een potentiële alternatieve geneesmiddel voor verschillende ziekten. Kleinanodeeltjes zijn vanwege hun adhesieve aard ook gebruikt als dragers voor gereguleerde afgifte geneesmiddelen. Nano-kleien zijn ook succesvol gebruikt om bovine rotavirus en bovine coronavirus te adsorberen en te behandelen.

Op basis van al deze ervaring van de auteurs met het hoge-affiniteit potentieel van nano-kleien, stellen we voor dat nano-kleien nabootsen als antilichamen en dus coronavirussen kunnen aantrekken en omhullen voordat deze binden met humane hACE2. Dit artikel is een eerste stap om deze perceptie te bevestigen via een moleculaire simulatie- en modelleringbenadering. Op basis van de resultaten van de moleculaire simulaties wordt een overzicht van aanbevelingen voor de volgende fasen van in vitro en in vivo onderzoek gegeven. Aangezien deze nano-kleien ook succesvol als geneesmiddeldragers worden gebruikt, stellen we ook voor dat ze geïnjecteerd/ingegeten kunnen worden als 'alleen-kleien' geneesmiddel, en dus hebben we een voorlopige nano-kleien administratiemethode voorgesteld.

Materialen - Moleculen

Selectie en formulering van SARS-CoV-2 en hACE2

Moleculen van SARS-CoV-2 spike S en hACE2 zijn verkregen via de protein databank website RCSB. De moleculaire modellen van SARS-CoV-2 spike S en hACE2, geformuleerd in Materials Studio software, worden respectievelijk getoond in Fig. 3a, b. Voordat ze aan simulaties worden onderworpen, werden deze moleculen geladen met de ladingsequilibratiemethode QEq van de software.

Selectie en formulering van nano-klei kristalliet

Na-montmorilloniet, een van de meest actieve leden van de smectietgroep kleimineralen, is geselecteerd voor de studie. Na-montmorilloniet is een gelaagd fyllosilicaat klei smectiet. In colloïdale vorm kan de ruimte tussen burenlagen vrije natrium-, calcium- of magnesiumkationen bevatten die elektrostatisch worden aangetrokken tot de extern negatief geladen oppervlakken. In de gedroogde poedervorm bestaat Na-montmorilloniet uit equidimensionale vlokken/bladen met afmetingen van ongeveer 0,5 × 0,5 × 0,001 micron. Deze negatieve ladens op hun interlaagoppervlakken worden gebalanceerd door de kationen. Als colloïden dissocieren de interlaagkationen van de deeltjes en associëren ze met andere negatief geladen oppervlakken. Deze deeltjes hebben ook positief geladen randen door de aanwezigheid van gebroken bindingen aan hun uiteinden. Morfologie en verdere karakteristieken van deze nano-kleien zijn verstrekt in Tabel 1, terwijl de formulering van hun kristallieten in Materials Studio software hieronder wordt uitgelegd.

Methoden - Moleculaire Simulaties

Deze deel van de studie bestond uit de simulatie en beoordeling van de interacties van het SARS-CoV-2 spike S met kleikristallieten en met hACE2. Hoewel deze modellen geen complete replicatie van de daadwerkelijke in vitro omstandigheden zijn, zijn ze voorzien van alle essentiële interacties en zijn ze zeer geschikt voor de beoogde relatieve en vergelijkende studie.

In de software werden de sorptie en simulaties van de geformuleerde configuraties van SARS-CoV-2 S, Na-montmorilloniet kristallieten en hACE2 uitgevoerd met Monte Carlo (MC) en moleculaire mechanica (MM) technieken. De verbetering van affiniteit in alle gesimuleerde configuraties werd beoordeeld aan de hand van de berekende cohesieve energiedichtheid (CED) - CED wordt beschouwd als een maat voor de cohesie van het moleculaire systeem. Vanwege de grote berekeningen betrokken bij de simulaties, werden deze berekeningen uitgevoerd met de high-performance computing faciliteiten (HPC) bij KFUPM, KSA. De algehele methodologie en de keuze van specifieke methoden en simulatieparameters waren gebaseerd op eerdere onderzoeken van de auteurs.

SARS-CoV-2 Spike (S) Interacties met hACE2 en Kleikristallieten

Om de interactie van SARS-CoV-2 S met kleikristallieten te simuleren, werden verschillende aantallen kristallieten van Na-montmorilloniet klei gesorbeerd op het SARS-CoV-2 S model. Voor deze sorptiesimulaties werd de Metropolis Monte Carlo methode geselecteerd in de Sorptie module van de software. In elke sorptiestap bezetten kleikristallieten ruimtes rond het spike S model om de totale energie van het complex te verlagen. Het vereiste aantal kristallieten werd gesorbeerd in maximaal 25.000 stappen, en vervolgens werd de energie van het systeem geminimaliseerd met de Forcite module van de software gebaseerd op MD principes. Hetzelfde sorptieproces werd herhaald voor de interactiemodellering van het SARS-CoV-2 spike molecuul met hACE2. In dit proces werden hACE2 moleculen gesorbeerd rond het RBD van het spike S van SARS-CoV-2. Na voltooiing van het sorptieproces werd de energie van de formulering geminimaliseerd met de MD-gebaseerde module van de software.

Cohesieve Energiedichtheid (CED) Meting

In deze studie werd de beoordeling van de affiniteit/bindingsniveau in de SARS-CoV-2-kleikristalliet en SARS-CoV-2-hACE2 complexen gemeten door de veranderingen in de CED. Na de sorptie van kleikristallieten en de daaropvolgende uitvoering van moleculaire dynamica van elk van de configuraties, werd de CED bepaald met de cohesieve energiedichtheid optie van de Forcite module van de software. De auteurs hebben ervaren dat het CED concept, bestaande uit de totale, van der Waals en elektrostatische CEDs, de verschillende moleculaire processen en interacties redelijk nauw kan verklaren en de mate van affiniteit/binding die ontstaat tussen de gesimuleerde complexen kan simuleren. Kwantitatief gedefinieerd is CED de hoeveelheid energie die nodig is voor de overgang van 1 mol materiaal van de vloeibare naar de gasfase. Het is ook een maat voor de wederzijdse affiniteit/aantrekkingskracht van moleculen en wordt uitgedrukt als zowel elektrostatische als van der Waals krachten, gemiddeld over een NPT ensemble.

Resultaten en Discussie

De eindconfiguratie van het SARS-CoV-2 S-hACE2 complex is getoond in Fig. 4a, terwijl de complexen tussen SARS-CoV-2 spike en verschillende aantallen klei Na-montmorilloniet kristallieten respectievelijk getoond worden in Fig. 4b, c. Voor vergelijkingsdoeleinden worden de totale CEDs van verschillende verhoudingen/aantallen van de kleikristallieten op de SARS-CoV-2 spike en de interactie van de laatstgenoemde met hACE2 geplot in Fig. 5.

Op basis van onze ervaring hebben we gehypotheseerd dat nano-kleien, vanwege hun hoge adhesieve eigenschappen, ook als SARS-CoV-2 inhibitoren kunnen fungeren. Ze kunnen dit doen door sterk te associëren met het spike S aanwezig op SARS-CoV-2. De resultaten verkregen uit de moleculaire simulaties van de interacties geven aan dat door de zeer hoge CED tussen SARS-CoV-2 en de nano-kleien vergeleken met de voormalige en hACE2 (Fig. 5), ze SARS-CoV-2 kunnen remmen om te engageren met hACE2. Bovendien kan uit Fig. 5 worden geconcludeerd dat de mate van remming door nano-kleien toeneemt op een hoeveelheid (dosering)-afhankelijke manier.

Nano-klei Interacties met SARS-CoV-2 Spike S

Auteurs hebben in hun eerdere onderzoek de rol van nano-kleien aangetoond bij het bevorderen van adhesie tussen kankercellen en hun micro-omgeving en dus het controleren van metastasen. Adhesiemetingen van 75/25 mengsel van Na-montmorilloniet en palygorskiet toonden een toename van adhesie met 100% tussen kankercellen en extracellulaire matrix eiwitten. Een bijbehorende SEM van de nano-kleien die Raji cellen en fibronectine eiwitten binden, is getoond in Fig. 6b. Auteurs ontdekten ook in hun eerdere onderzoek dat elektrostatische, van der Waals en ZP aantrekkingen domineren in de adhesieprocessen. We concluderen dat dezelfde mechanismen ook de binding van de adhesieve oppervlakken van de nano-kleien aan de spike van SARS-CoV-2 zouden hebben gefaciliteerd. ZP is een maat voor de dispersie- of flocculatieneiging in colloïdale vorm, inclusief interacties met andere componenten in het suspensiemedium. Als algemene regel duidt een zetapotentieel groter dan 30 mV (positief of negatief) op dispersieneiging, terwijl een zetapotentieel van minder dan 5 mV doorgaans resulteert in agglomeratie. Hogere dispersieneigenschappen ZP van de kleinanodeeltjes gebruikt in de studie (-24 tot -32 mV) leiden tot hogere dispersieneiging en dus tot de generatie van hoger oppervlak wat de interacties met de SARS-CoV-2 spike versterkt. Hoewel Na-montmorilloniet nanodeeltjes op basis van hun ZP hydrofiel van aard zijn, bevorderen ze in de aanwezigheid van zouten ook secundaire adhesiemechanismen tussen hydrofobe en hydrofiele oppervlakken. Het moet ook worden opgemerkt dat deze kleinanodeeltjes een hoge dispersieneiging hebben vanwege hun hydrofiele aard en relatief hogere afstotende zuur-base (AB) interacties. Hoge dispersie resulteert op zijn beurt in de generatie van hoog oppervlak voor het vergroten van aantrekkelijke interacties. Grotere oppervlakken bevorderen grotere aantrekking door van der Waals aantrekking en elektrostatische krachten tussen tegenovergesteld geladen oppervlakken. Daarnaast worden, hoewel in mindere mate, de positief geladen randen van Na-montmorilloniet deeltjes ook elektrisch aangetrokken tot de spike S.

Nano-kleien als Pseudo-antilichamen

Op basis van al het huidige en eerdere onderzoek van de auteurs, dat het hoge-affiniteit potentieel van nano-kleien aantoont, stellen we voor dat nano-kleien nabootsen als antilichamen en dus coronavirussen kunnen aantrekken en omhullen voordat deze engageren met humane hACE2. Antilichamen zijn glycoproteïnen gesynthetiseerd door plasmacellen als onderdeel van de adaptieve immuunrespons om te helpen bij de clearance van infectie uit het lichaam. Antilichamen helpen bij infectieclearance op meerdere manieren, zoals opsonisatie van pathogenen om fagocytose te faciliteren, activatie van het complementsysteem, agglutinatie van microben, en neutralisatie van virussen en toxinen. Wanneer gebonden aan virale oppervlakte-eiwitten, voorkomen antilichamen de instap van virussen in de cel door de binding van virussen aan hun doelreceptor op de cel te voorkomen. Antilichaambinding kan op verschillende plaatsen op het oppervlakte-eiwit plaatsvinden wat leidt tot verschillende mechanismen die hetzelfde effect veroorzaken. In het geval van SARS-CoV-2 zijn twee virale neutralisatiemechanismen door antilichamen waargenomen en getoond in Fig. 1c, d. Een van de mechanismen betreft directe binding van antilichamen aan de hechtingsplaats van de SARS-CoV-2-RBD, wat resulteert in het antilichaam concurrerend met de doelreceptor hACE2. Een ander mechanisme betreft de binding van antilichamen aan andere plaatsen op RBD zonder competitie met de doelreceptor. Het laatstgenoemde blijkt betrokken te zijn bij neutralisatie door het meest krachtige Monoclonale Antilichaam (mAb) ontdekt in de studie. Analog aan de antilichamen interactie met SARS-CoV-2 RBD, wat de laatste remt om te engageren met hACE2, is een vergelijkbaar moleculair model voorbereid voor nano-kleien wat resulteert in een vergelijkbare remming van coronavirussen en getoond in Fig. 8. Vanwege hun zeer hoge affiniteit zouden nano-kleien aangetrokken worden tot spikes van SARS-CoV-2 en dus de binding van RBDs van deze spikes met hACE2 beperken.

Voorgestelde Nano-klei Administratie Methodologie

Het gebruik van klei als geneesmiddeldragers is meerdere keren getest, met veelbelovende resultaten van weinig tot geen cytotoxiciteit aan cellen van het menselijk lichaam. Kaoliet kleimineraal werd getest voor gebruik in een potentiële geneesmiddelafgiftesysteem en bleek een hoge biocompatibiliteit en zeer lage cytotoxiciteit te hebben. Poly (d,l-lactide-co-glycolide)/montmorilloniet nanopartikelen cytotoxiciteit in vitro werd ook als verwaarloosbaar aangetoond. Palygorskiet-polyethyleenimine-fluoresceïne isothiocyaanaat nanocomposieten vertoonden ook bijna geen cytotoxiciteit in vitro. Auteurs hebben ook ervaren met het injecteren van nano-kleien subcutaan voor de behandeling van melanoom tijdens in vivo studies. Op basis van het gebruik van klei als kankergeneesmiddeldrager en in andere gereguleerde afgifte geneesmiddelen, stellen we voor dat nano-kleien geïnjecteerd kunnen worden als 'klei-alleen' geneesmiddel, onder voorbehoud van verificatie in vivo en klinische proeven.

Hoewel nano-kleien niet-biologisch afbreekbaar zijn, kan een uitgebreid begrip van het ontwerp van vergelijkbare anorganische nanopartikelen met hun metabolische prestaties in het lichaam, uitgevoerd in de studie, deze nano-kleien ook categoriseren als humane lichaam clearbare anorganische agenten.

Conclusies en Aanbevelingen

Op basis van al het huidige en eerdere onderzoek van de auteurs, dat het hoge-affiniteit potentieel van nano-kleien aantoont, kunnen deze nabootsen als antilichamen en dus coronavirussen aantrekken en omhullen voordat deze engageren met humane hACE2.

De resultaten van de moleculaire simulaties voor de interactie van SARS-CoV-2 spike S met de kleikristallieten resulteren in de vorming van nauw interactieve sterke van der Waals aantrekkingsvelden. Deze van der Waals aantrekkingsvelden creëren een hogere CED van de klei/SARS-CoV-2 configuratie. De substantiële toename van totale CED na toevoeging van kleikristallieten is ook een getuigenis van een zeer hoge affiniteit van SARS-CoV-2 met deze deeltjes vergeleken met de affiniteit van de voormalige met hACE2.

We stellen voor het onderzoek voort te zetten door in vitro interactiestudies uit te voeren tussen SARS-CoV-2 en verschillende percentages nano-kleien. Op basis van de optimale dosering nano-klei ontwikkeld in de in vitro fase, stellen we voor in vivo studies op dieren uit te voeren. De dierenstudie moet zowel met als zonder nano-klei worden uitgevoerd om de nano-klei dosering te finaliseren en de basis te leggen voor klinische proeven.