Milieuvriendelijke biogeconjugeerde gouden nanodeeltjes als efficiënte contrastmiddelen voor door ontsteking geïnduceerde kankerbeeldvorming

Abstract

Voor veel kankers is vroege detectie de sleutel om de overleving te verbeteren en de morbiditeit te verminderen, die gepaard gaat met radicale resecties als gevolg van late diagnose. Hier beschrijven we de efficiëntie van primaire antilichaam-geconjugeerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) om zich specifiek te richten op chronische ontstekingsprocessen, met name M2-macrofagen, in weefselsecties van colitis ulcerosa (UC) en steatohepatitis bij ratten die kunnen leiden tot colorectale kanker en levercarcinoom, respectievelijk. In deze studie laten we zien dat AuNP's die zijn gesynthetiseerd met een eenvoudige, goedkope en milieuvriendelijke methode gemakkelijk kunnen worden geconjugeerd met de antilichamen anti-COX-2, anti-MIF en Alexa Fluor® 488 (ALEXA) om immunofluorescentiekleuring uit te voeren bij ontstoken weefsels. Bovendien toonden we aan dat primaire antilichaam-geconjugeerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) kunnen worden gebruikt om M2-macrofagen te targeten door middel van flowcytometrie. We ontwierpen drie immunofluorescentiekleuringsprotocollen van weefselsectie met AuNP's gedurende 30 minuten en 's nachts incubatie, evenals één flowcytometrieprotocol van M2-macrofaaglabeling met AuNP's gedurende 30 min. Immunofluorescentie- en flowcytometrieresultaten suggereren dat conjugatie werd bereikt door directe adsorptie van antilichamen op het AuNPs-oppervlak. In vergelijking met het standaard ALEXA-protocol in immunofluorescentie (IF) en flowcytometrie (FC), nam ons incubatieprotocol van 30 minuten met AuNP's in plaats van ALEXA af van ongeveer 23 h tot 5 h voor IF en van 4 h tot 1 h voor FC, blijkt minder arbeidsintensief te zijn, waardoor de methode geschikt is voor diagnostiek van kanker door ontstekingen.

Inleiding

In medisch en biologisch onderzoek neemt de belangstelling voor gouden nanodeeltjes (AuNP's) voor optische microscopiestudies en diagnostische procedures, met name confocale lasermicroscopie, toe. Het gebruik van antilichaam/AuNP-conjugaten maakt real-time detectie van goudopname in levende cellen (bijv. kankercellen) op het niveau van afzonderlijke deeltjes mogelijk, waardoor de intracellulaire hoeveelheden NP's kunnen worden geschat [1,2,3].

Dankzij de fysisch-chemische eigenschappen van AuNP's kunnen ze worden gebruikt in veel medische onderzoeken, zoals genomica, biosensitiviteit, immunoassay, klinische chemie, detectie en fotothermolyse van micro-organismen en kankercellen [1]. Faulk en Taylor [4] beschreven de eerste methode van antilichaamconjugatie met colloïdaal goud voor directe elektronenmicroscopische visualisatie van de oppervlakte-antigenen van salmonellae. Sindsdien zijn er veel onderzoeken ontwikkeld die gericht zijn op de toepassing van nanodeeltjes geconjugeerd met biomacromoleculen, zoals antilichamen, lectines en enzymen, op verschillende gebieden, bijvoorbeeld biochemie, microbiologie, immunologie en morfologie [1, 4]. In kankeronderzoeken worden zeer specifieke en gevoelige op AuNP gebaseerde contrastmiddelen gebruikt voor zowel röntgen- als optische beeldvormingsmodaliteiten, aangezien AuNP's de fluorescentie-intensiteit van geconjugeerde moleculen kunnen verbeteren [5, 6].

In 2014 hebben we aangetoond dat AuNP's kunnen worden toegepast op de indirecte immunofluorescentie (IF) kleuringsmethode in celculturen [6]. In de huidige studie beschrijven we drie nieuwe methoden voor immunofluorescentie (IF) kleuring met behulp van AuNPs. Hier gebruiken we weefselcoupes en vergelijken we de fluorescentie-intensiteit van elk van deze methoden met het standaard kleuringsprotocol met Alexa Fluor® 488 (ALEXA) antilichaam (A1) met als doel het optimaliseren van een fluorescentietechniek voor klinische toepassing [7,8,9 ].

Fluorescentiebeeldvorming (FI) voor targeting op kankercellen maakt gebruik van een verscheidenheid aan optische beeldvormingstechnologieën om de detectie van vroege neoplasie te verbeteren op basis van moleculaire handtekeningen die specifiek zijn voor kanker [10]. Sinds 2013 is er een snelle toename van het aantal klinische onderzoeken met FI. Screening wordt over het algemeen overwogen voor patiënten met een hoog risico, die gebaseerd zijn op een combinatie van leefstijlfactoren, genetica of een persoonlijke ziektegeschiedenis, terwijl surveillance is voorbehouden aan patiënten met de diagnose dysplasie/chronische ontsteking of patiënten met een vermoedelijke maligniteit. FI kan helpen bij het identificeren van kwaadaardige laesies met verbeterde specificiteit en gevoeligheid in vergelijking met de momenteel beschikbare technieken. Bovendien kan op FI gebaseerde screening een minder invasieve, meer kosteneffectieve manier bieden om kankerachtige of precancereuze laesies op te sporen. In het bijzonder zal het vermogen van FI om laesies eerder te detecteren dan conventionele screeningmethoden niet alleen resulteren in verbeterde behandelresultaten, maar ook in lagere behandelingskosten, omdat het de noodzaak van multimodale zorg zal voorkomen, die nodig is voor degenen die bij latere diagnose worden gediagnosticeerd [11] . In deze studie laten we zien dat antilichaam/AuNPs-conjugaten met succes kunnen worden toegepast voor beeldvorming van chronische ontstekingen door middel van fluorescentiemicroscopie.

Methoden/experimenteel

Doel van het onderzoek

Het doel van deze studie is om aan te tonen hoe fluorescentie-eigenschappen van gouden nanodeeltjes kunnen worden gebruikt in IF- en flowcytometrietechnieken. Daarnaast hebben we de met AuNP's geteste protocollen vergeleken met het standaardprotocol met ALEXA en hebben we bewezen dat het mogelijk is om de AuNP's te gebruiken in een protocol dat sneller is, maar even betrouwbaar als het standaardprotocol.

Chemische stoffen en reagentia

Goudtrichloride (30 wt% in HCl), polyvinylpyrrolidon (PVP, MW = 10.000), natriumhydroxide, cellulosemembraan voor dialysebuizen en glycerol waren producten van Sigma-Aldrich Chemical Co (Saint Louis, VS). Zwavelzuur en waterstofperoxide werden gekocht bij Vetec (Rio de Janeiro, Brazilië). Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en runderserumalbumine (BSA, 5%) werden gekocht bij Life Technologies Corporation© (California, VS). Anti-COX-2 (cyclo-oxygenase-2) en primaire antilichamen tegen MIF (macrofaagmigratieremmende factor) werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology (São Paulo, Brazilië), terwijl Goat Anti-Rat IgG H&L Alexa Fluor® 488 secundair antilichaam werd gekocht bij ABCAM® (Cambridge, VK). Fluoroshield-montagemedium met DAPI (20 ml) van ABCAM® (Cambridge, VK) werd gebruikt voor tegenkleuring van DNA.

Productie en karakterisering van AuNP's en fluorescentiespectroscopie

Sferische AuNP's (7,1-nm) werden geproduceerd en gekarakteriseerd volgens een onderzoek van Gasparotto et al. [12]. Kortom, al het glaswerk werd bewaard in KMnO₄ + NaOH-oplossing 's nachts, gespoeld met gedeïoniseerd water, bewaard in H₂ O₂ + H₂ SO₄ oplossing (1:1 v /v ) gedurende 10 min, opnieuw gespoeld met gedeïoniseerd water en gedroogd voor gebruik. PVP (0,20 g) en goudchloride (6,80 mg) werden opgelost in 10 ml water. In een aparte beker werden glycerol (0,18 g) en NaOH (0,080 g) opgelost in 10 ml water. De glycerol-NaOH-oplossing werd vervolgens toegevoegd aan de AuCl₃ -PVP-oplossing om de volgende eindconcentraties te verkrijgen:1,0 mmol/L⁻¹ Au³⁺ , 0,10 M NaOH, 0,10 M glycerol en 10 g/L⁻¹ PVP. Het uiteindelijke mengsel had een dieprode kleur door de vorming van AuNP's. De colloïdale ultraviolet-zichtbare absorptiespectra van de AuNP's werden verkregen met een Evolution 60S UV-zichtbare spectrofotometer (Thermo Scientific, MA, VS). Fluorescentiespectroscopie werd uitgevoerd met een RF-5301 PC-spectrofluorfotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan).

Experimenteel ontwerp

Alle drie de protocollen werden getest op controlegroepen van twee chronische ontstekingsmodellen, door azijnzuur geïnduceerde colitis ulcerosa (UC) [7] en door alcohol geïnduceerde steatohepatitis [8, 9] bij ratten.

Door azijnzuur geïnduceerde UC werd uitgevoerd op vrouwelijke Wistar-ratten (220 ± 20 g BW), verkregen van het Biotechnology Center/Universidade Federal da Paraiba. De dieren werden in twee groepen verdeeld (n = 5 per groep):azijnzuurcontrole en niet-colitische ratten. De dieren werden 's nachts gevast en verdoofd met ketamine (70 mg/kg, 10%) en xylazine (10 mg/kg, 2%). UC werd geïnduceerd volgens methoden die oorspronkelijk zijn beschreven door MacPherson en Pfeiffer [13] en gemodificeerd door Millar et al. [14]. Een katheter werd voorzichtig in de dikke darm ingebracht. Vervolgens werd 10% azijnzuur (0,5 ml) in 0,9% zoutoplossing in het lumen van de dikke darm gedruppeld. De niet-colitische groep kreeg 0,5 ml 0,9% zoutoplossing intracolonisch toegediend. De ratten werden gedurende 30 seconden in een liggende Trendelenburg-positie gehouden om lekkage van de intracolonische instillatie te voorkomen.

De dieren werden 's nachts gevast en geëuthanaseerd met een overdosis thiopental, 48 uur na inductie. Vervolgens werd de dikke darm aseptisch verwijderd, gespoeld met PBS en op een ijskoude plaat geplaatst. De dikke darm werd ontdaan van vet en mesenterium. Vervolgens werd elk monster gewogen en de lengte ervan gemeten onder een constante belasting (2 g). Daarna werd de dikke darm longitudinaal geopend en gescoord op macroscopisch zichtbare schade op een schaal van 0 tot 10 volgens de criteria beschreven door Bell et al. [15].

Steatohepatitis door alcohol werd geïnduceerd bij mannelijke Wistar-ratten (290 ± 10 g BW) verkregen van de afdeling Biofysische en Farmacologie - Federale Universiteit van Rio Grande do Norte (UFRN). De dieren werden in twee groepen verdeeld (n = 5 per groep):alcoholische en niet-alcoholische ratten. Ethanoloplossing (7 g/kg lichaamsgewicht van 30% v /v ) werd gebruikt als chronische dosis voor de alcoholische groep. Dieren in de niet-alcoholische groep kregen oraal een equivalent volume zoutoplossing (0,9% NaCl) via sondevoeding. Gavage procedures werden eenmaal per dag uitgevoerd in beide groepen gedurende 28 dagen.

Op dag 29 werd euthanasie uitgevoerd door intraperitoneale injectie van 7,5 ml/kg ketamine (50 mg/ml) en 2,5 ml/kg xylazine (20 mg/ml). Vóór euthanasie moesten alle diergroepen 12 uur vasten. Eenmaal bewusteloos ondergingen de dieren een hartpunctie gevolgd door verwijdering van de lever. Leverfragmenten werden ondergedompeld in 10% gebufferde formaldehyde voor histopathologische analyse.

Dieren met zowel door azijnzuur geïnduceerde UC als door alcohol geïnduceerde steatohepatitis werden onder standaardomstandigheden gehuisvest (12 uur licht/donker cyclus, 22 ± 0.1 °C en 50-55% vochtigheid) met ad libitum toegang tot voedsel en water. Dieren werden behandeld volgens de ethische principes voor dierproeven.

Histologie

Vijf paraffineblokken van de positieve controles (azijnzuurcontrole en alcoholcontrole) van elk ontstekingsmodel werden gebruikt voor indirecte IF-kleuring. De primaire antilichamen anti-COX-2 en anti-MIF bleken goede ontstekingsmarkers te zijn bij respectievelijk azijnzuur-geïnduceerde UC en alcohol-geïnduceerde steatohepatitis, door een betrouwbare kleuring te verschaffen in termen van fluorescentie-intensiteit die kan worden gebruikt om verschillende protocollen.

De weefsels werden gefixeerd in 10% gebufferd formaldehyde, gedehydrateerd met ethylalcohol (70%, 80%, 90%, 95% en P.A.), geklaard in Xylol en geïmpregneerd in paraffine volgens het standaardprotocol [8]. Voorafgaand aan de voorbereiding van de secties voor indirecte IF-kleuring, werden de objectglaasjes 24 uur in een oven bij 60 ° C bewaard.

Ontwerpen voor immunofluorescentie en protocollen

Drie weefselcoupes (4 m) van elk dier werden van paraffine ontdaan in xyleen en gewassen in een reeks afnemende concentraties ethanol, van 99% ethanol tot 50% ethanol. Ten slotte werden weefselcoupes tweemaal gewassen in dH₂ O en één keer wassen met PBS. Het ophalen van antigeen werd uitgevoerd door de coupes gedurende 30 minuten in een 10 mM natriumcitraat met 0, 05% Tween 20 bij 95 ° C en vervolgens gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT) te plaatsen. Achtergrondruis/signaal werd verminderd door de coupes 20 min te incuberen in 0,1% Sudanzwart in 70% alcohol bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten in 0,02% PBS-Tween 20. De monsters werden permeabel gemaakt in 0,2% Triton-X-100 in PBS (drie wasbeurten, elk 5 min), gewassen in PBS en vervolgens geblokkeerd met PBS, 5% BSA, dH₂ O, en Triton-X-100. Dia's werden gedurende 2 uur geïncubeerd met blokoplossing in een vochtige kamer. Zoals weergegeven in tabel 1 en figuur 1, werd de incubatie van de primaire antilichamen tegen COX-2 en anti-MIF uitgevoerd volgens drie verschillende protocollen (NP1, NP2 en NP3). Deze protocollen werden vergeleken met twee op ALEXA gebaseerde protocollen die verschillen in de tijd van incubatie van het primaire antilichaam - het ALEXA-standaardprotocol (incubatie gedurende de nacht) dat door onze onderzoeksgroep is aangenomen als standaardprotocol voor de meeste procedures (A1) en het door ALEXA gewijzigde protocol (A2; 30 min incubatie). NP1 is een nanodeeltjesafhankelijke immunofluorescentiekleuringsmethode met 30 min voor primaire incubatie. Primaire antilichamen werden verdund in 1% BSA in verhoudingen van 1:500 (anti-COX-2) en 1:400 (anti-MIF), en elk monster werd gedurende 30 min geïncubeerd in een vochtige kamer bij kamertemperatuur (20 ° C). . Vervolgens werd 100-150 μl AuNP's aan de monsters toegevoegd, die nog eens 30 min bij kamertemperatuur (20 ° C) werden geïncubeerd. In het tweede nanodeeltjesafhankelijke protocol (NP2) werden primaire antilichamen verdund in 1% BSA en rechtstreeks op de objectglaasjes aangebracht, die een nacht in de koelkast werden bewaard. Daarom zijn A2 en NP1 beide 30 minuten incubatieprotocollen, maar A2 wordt uitgevoerd met een secundair fluorescerend antilichaam (ALEXA), terwijl NP1 AuNP's heeft als fluoroforen. Dit geldt ook voor de overnachtincubatieprotocollen A1 en NP2. Na de respectieve incubatietijden werden de objectglaasjes van elk protocol driemaal gewassen met PBS om het overtollige primaire antilichaam te verwijderen. Vervolgens werd 100-150 μl nanodeeltjes toegevoegd aan elk glaasje in NP2, terwijl ALEXA (1:400) werd toegevoegd in A1. Na 1 uur incubatie met AuNP's (NP2) en ALEXA (A1) werden alle objectglaasjes driemaal gewassen met PBS.

Afbeeldingen van hematoxyline- en eosinekleuring van door azijnzuur geïnduceerde UC en alcohol-geïnduceerde steatohepatitis-controlegroepen. een Negatieve controle van UC-model (× 100; schaalbalk = 100 μm). b Azijnzuur-geïnduceerde UC. De rode pijl geeft de infiltratie van leukocyten in het slijmvliesgebied aan (× 100; schaalbalk = 100 μm). c Negatieve controle van steatohepatitis (× 200; schaalbalk = 50 μm). d Door alcohol veroorzaakte steatohepatitis. De zwarte pijl geeft de infiltratie van leukocyten aan (× 200; schaalbalk = 50 μm)

Het derde protocol (NP3) was ontworpen om de versterkende eigenschappen van AuNP's in fluorescerende systemen te onderzoeken. In NP3 werden AuNP's aangebracht tijdens verdunning van ALEXA in 1% BSA. Drie verdunningen van secundair antilichaam (1:200, 1:400 en 1:800) in BSA met AuNP's werden getest om de fluorescentie-intensiteiten van elke verdunning te vergelijken met A1. De verdunningen werden op een zodanige manier bereid dat het volume van AuNP's evenredig was met het volume van BSA, bijvoorbeeld voor een verdunning van 1:200 werd 2 l ALEXA verdund in 199 μl AuNP's + 199 μl BSA. De incubatietijd voor de primaire antilichamen in A1 en NP3 was ongeveer 18 h ('s nachts), terwijl de incubatietijd voor ALEXA + AuNPs-suspensie 1 h was.

Ten slotte werden monsters gemonteerd met behulp van Fluoroshield Mounting Medium met DAPI. De objectglaasjes werden bewaard in een tegen licht beschermde doos en bewaard bij 4°C tot microscopische analyse. Fluorescerende beelden werden verkregen met een Zeiss Observer z.1 rechtopstaande microscoop voor fluorescentie- en helderveldbeeldvorming (×-20 en x-10 objectieven, Carl Zeiss, Jena, Duitsland) met AxioCam MRc. De rekenkundige gemiddelde parameter van de Zeiss ZEN lite blue edition-software (Carl Zeiss) werd gebruikt om de intensiteit van de fluorescentie pixel voor pixel voor elk beeld van het ALEXA-kanaal kwantitatief te evalueren. Ten minste drie monsters van elk dier (vijf dieren per groep) werden geanalyseerd en er werden vijf foto's gemaakt van elk fragment met de × 10-doelstelling.

Inductie van M2-gepolariseerde TAM's in vitro

Voor evaluatie van primaire antilichaam-geconjugeerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) in M2-macrofagen, RAW 264,7-cellen (5 × 10⁵ cellen/putje in een plaat met 12 putjes) werden 24 uur gekweekt in compleet medium met 10% foetaal runderserum aangevuld met 20 ng/ml IL-4. Na behandeling met IL-4 werden de cellen driemaal gewassen met serumvrij DMEM, gevolgd door 48 uur kweken in hetzelfde medium. Cellen werden geanalyseerd met behulp van een Telaval 31-lichtmicroscoop (ZEISS, Oberkochen, Duitsland).

Flowcytometrie

Na incubatie met IL-4 gedurende 48 h, RAW 264,7-cellen en M2-macrofagen (1,5 × 10⁴ cellen / putje in een plaat met 12 putjes) werden verzameld met een schraper en geblokkeerd met 0,5 g BSA in 100 ml PBS (PBA) gedurende 45 min, gevolgd door incubatie met PerCP-geconjugeerd anti-muis CD163 (1:1000) en FITC -geconjugeerde anti-muis CD86 (1:1000) bij 4 °C gedurende 60 min. Bovendien werden M2-macrofagen gelabeld met COX-2 en MIF primaire antilichamen en zo geconjugeerd aan AuNP's. M2-gepolariseerde TAM's werden verzameld en gefixeerd met 2% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 min, gevolgd door incubatie met de anti-COX-2 en anti-MIF primaire (1:100) gedurende 60 min bij 4 ° C en; daarna werden de cellen gelabeld met geit anti-konijn Alexa® Fluor 488-geconjugeerd secundair antilichaam (Thermo Fisher Scientific) in incubatieoplossing (1:100) bij kamertemperatuur gedurende 60 min zoals beschreven in het Alexa-standaardprotocol [16]. Volgens het protocol (N1) waarbij AuNP's het geit-anti-konijn Alexa® Fluor 488-geconjugeerde secundaire antilichaam vervangen, werden M2-macrofagen geoogst, gewassen met PBS en geïncubeerd met de primaire anti-COX-2 en anti-MIF (1:100 ) in incubatieoplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met AuNP's (1:5) bij 4 ° C gedurende 30 min (AuNPs-excitatie bij 520 nm). Na de laatste wasstap werden gelabelde cellen geanalyseerd in een BD FACSCanto II (BD Biosciences, Nederland) en FlowJo-software (versie 10.1; Tree Star Inc., VK). Alle flowcytometrie-analyses werden uitgevoerd met monsters in drievoud en driemaal herhaald. Vergelijking tussen standaard ALEXA- en AuNPs-protocollen wordt getoond in Tabel 2.

Statistische analyse

Variantieanalyse (ANOVA) en Bonferroni's post hoc test werden uitgevoerd voor immunofluorescentieanalyse. Voor flowcytometrie-analyse werden de significante verschillen tussen de groepen berekend met behulp van ANOVA en Dunn's test, zoals aangegeven. Een p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd voor alle uitgevoerde analyses.

Resultaten

Microscopie-analyse

De sectie in Fig. 1a toont een weefselsectie gekleurd met hematoxyline en eosine (negatieve controle). Het chronische ontstekingsproces geïnduceerd door azijnzuur is afgebeeld in figuur 1b, dat verlies van weefselarchitectuur laat zien met als gevolg vernietiging van het epitheel, een vermindering van slijmbekercellen, de aanwezigheid van bloedingen en leukocyten in de buurt van de beschadigde plaatsen. In de figuur werd ophoping van vettige druppeltjes en ontstekingsinfiltraat (neutrofielen en lymfocyten) gezien in de lever van ratten die werden blootgesteld aan chronische alcoholblootstelling.

In termen van fluorescentie-intensiteit leken AuNP's op ALEXA, een conventionele fluorofoor voor IF-kleuring. In zowel lever- als colonmonsters waren de verschillen in de fluorescentie-intensiteit van NP1 en NP2 minimaal of niet aanwezig in vergelijking met A1. In Fig. 2 worden meerdere vergelijkingen getoond tussen de IF-protocollen die zijn getest met behulp van primaire anti-COX-2- en anti-MIF-antilichamen. Figuren 2a en d laten zien dat de fluorescentie-intensiteiten van A2, NP1 en NP2 niet significant verschillen in vergelijking met het A1-protocol (^# p> 0,05), wat suggereert dat incubatieprotocollen van 30 minuten (ofwel met behulp van ALEXA of AuNP's) toepasbaar kunnen zijn in een diagnostische context.

Vergelijking van fluorescentie-intensiteit tussen groepen. een Fluorescentie-intensiteit van AuNP's in A2, NP1 en NP2 in vergelijking met door A1-alleen door azijnzuur geïnduceerde UC (anti-COX-2-antilichaam). b Alle verdunningen van NP3 (1:200, 1:400 en 1:800) in vergelijking met de fluorescentie-intensiteit van A1 (1:400)-alleen azijnzuur-geïnduceerde UC (anti-COX-2 antilichaam). c Vergelijking van de fluorescentie-intensiteit tussen door azijnzuur geïnduceerde dieren en negatieve controles na korte tijd (A2 en NP1) en overnacht incubatie (A1 en NP2). d Fluorescentie-intensiteit van AuNP's in A2, NP1 en NP2 in vergelijking met A1-only alcohol-geïnduceerde steatohepatitis (anti-MIF-antilichaam). e Alle verdunningen van NP3 (1:200, 1:400 en 1:800) in vergelijking met de fluorescentie-intensiteit van A1 (1:400)-alleen alcohol-geïnduceerde steatohepatitis (anti-MIF-antilichaam). v Vergelijking van de fluorescentie-intensiteit bij door alcohol geïnduceerde steatohepatitis-dieren en negatieve controles na 30 minuten incubatie (A2 en NP1) en incubatie gedurende de nacht (A1 en NP2). Statistieken:ANOVA en Bonferroni's post hoc test, ^# p ≥ 0.05, **p < 0.01,***p < 0.001 en ****p < 0.0001

Bovendien toonde het NP3-protocol (Fig. 2b, e) aan dat het mogelijk is om de AuNP's te combineren met ALEXA, zodat de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit werd verhoogd (***p < 0,001), waardoor zelfs een dubbele verdunning van ALEXA mogelijk is zonder dat de fluorescentie afneemt ten opzichte van de 1:400 verdunning die oorspronkelijk werd getest op A1 (^# p> 0.05).

Ten slotte hebben we de zieke groepen vergeleken met de gezonde groepen (Fig. 2f) om aan te tonen dat alle geteste protocollen, hetzij met ALEXA of met AuNP's, effectief zijn in het detecteren van het begin van ontstekingsprocessen die worden gekenmerkt door antigenen COX-2 en MIF. Figuren 3 en 4 ondersteunen de gegevens die grafisch worden weergegeven in Fig. 2. Zowel ALEXA als AuNP's worden weergegeven in groene kleuring, waarvan de verdeling overeenkomt met plaatsen met verhoogde leukocytinfiltratie en weefselbeschadiging.

Anti-COX-2 IF-beelden van colonmonsters uit de zoutoplossing (negatieve controle) en de door azijnzuur geïnduceerde UC-groepen gekleurd met groene fluorescerende verbindingen (ALEXA, AuNP's of beide) en DAPI (blauw) voor kernen. een Negatieve controle gekleurd met ALEXA standaardprotocol (A1) met anti-COX-2 en ALEXA (groen). b Negatieve controle gekleurd met gemodificeerd ALEXA-protocol (A2) met anti-COX-2 en ALEXA. c Negatieve controle gekleurd met nanodeeltjesprotocol 1 (NP1) met anti-COX-2 en AuNP's (groen) in plaats van ALEXA. d Negatieve controle gekleurd met nanodeeltjesprotocol 2 (NP2) met anti-COX-2 en AuNP's in plaats van ALEXA. e Positieve controle gekleurd met A1. v Positieve controle gekleurd met A2. g Positieve controle gekleurd met NP1. u Positieve controle gekleurd met NP2. ik Positieve controle gekleurd met nanodeeltjesprotocol (NP3) met anti-COX-2 + AuNP's met 1:200 ALEXA. j Positieve controle gekleurd met NP3 (met 1:400 verdunning van ALEXA). k UC positieve controle gekleurd met NP3 (met 1:800 verdunning van ALEXA). Vergrotingen, × 200. Schaalbalk = 50 μm

Anti-MIF IF-beelden van levermonsters uit de zoutoplossing (negatieve controle) en door alcohol geïnduceerde steatohepatitis-groepen gekleurd met groene fluorescerende verbindingen (ALEXA, AuNP's of beide) en DAPI (blauw) voor kernen. een Negatieve controle gekleurd met ALEXA standaardprotocol (A1) met anti-MIF en ALEXA (groen). b Negatieve controle gekleurd met ALEXA gemodificeerd protocol (A2) met anti-MIF en ALEXA. c Negatieve controle gekleurd met nanodeeltjesprotocol 1 (NP1) met anti-MIF en AuNP's (groen) in plaats van ALEXA. d Negatieve controle gekleurd met nanodeeltjesprotocol 2 (NP2) met anti-MIF en AuNP's in plaats van ALEXA. e Positieve controle gekleurd met A1. v Positieve controle gekleurd met A2. g Positieve controle gekleurd met NP1. u Positieve controle gekleurd met NP2. ik Positieve controle gekleurd met nanodeeltjesprotocol 3 (NP3) met anti-MIF + AuNP's met 1:200 ALEXA. j Positieve controle gekleurd met NP3 met een 1:400 verdunning van ALEXA. k Positieve controle gekleurd met NP3 met een 1:800 verdunning van ALEXA. Vergrotingen, × 200. Schaalbalk = 50 μm

In termen van klinische toepassing bleek het NP1-protocol het meest veelbelovend te zijn, aangezien het in vergelijking met het standaard A1-protocol een besparing van 18 h mogelijk maakt.

Flowcytometrie:primaire antilichaam-geconjugeerde gouden nanodeeltjes (AuNP)-gelabelde M2-macrofagen

Om M2-macrofagen verder te karakteriseren, werd de expressie van M1- (CD86)- en M2- (CD163)-gerelateerde makers in IL-4-gestimuleerde RAW 264.7-cellen geanalyseerd in flowcytometrie. Flowcytometrieresultaten toonden aan dat de M2-gerelateerde markers zoals de CD163-receptor significant hoger waren dan de natieve cel (Fig. 5a, c, p <-0,001) terwijl CD86-receptorexpressie geen verschil liet zien tussen M2-macrofagen en naïeve cellen (Fig. 5b, c, p> 0,05). De resultaten suggereerden dat IL-4 (20 ng/ml) met succes de wijziging van klassieke macrofagen in M2-macrofagen induceerde. Na deze stap werden M2-macrofagen geïncubeerd met COX-2 en MIF primaire antilichamen en vervolgens gelabeld met AuNP's om de efficiëntie van primaire antilichaam-geconjugeerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) te vergelijken met het standaardprotocol (ALEXA). De resultaten toonden aan dat met COX-2 en MIF-antilichaam geconjugeerde gouden nanodeeltjes (Fig. 5d, f, p < 0.001) of ALEXA (Fig. 5e, f, p < 0,001) vertoonde een hogere fluorescentie-intensiteit in M2-macrofagen in vergelijking met ongekleurde monsters.

COX-2 en MIF-antilichaam-geconjugeerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) hebben een hoge affiniteit op het oppervlak van M2-macrofagen. een –c RAW 264,7-cellen werden gedurende 24 uur gestimuleerd met IL-4 (20 ng / ml), gevolgd door flowcytometrie-analyse om de hoeveelheid CD163, een M2-macrofaagmarker en CD86, een M1-marker te kwantificeren. d , v Ofwel COX-2 en MIF-antilichaam-geconjugeerde gouden nanodeeltjes of e , v ALEXA 488 vertoonde een hogere fluorescentie-intensiteit in M2-macrofagen in vergelijking met ongekleurde monsters. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD, ^# p> 0.05, ***p < 0.001, p < 0,0001. De weergegeven representatieve stroomgegevens zijn afkomstig van experimenten die ten minste drie keer onafhankelijk zijn uitgevoerd

Fluorescentiespectroscopie

Om de fluorescentie-emissiespectra voor gezuiverde AuNP's te meten in de afwezigheid en aanwezigheid van anti-COX-2 (Fig. 6a), anti-MIF (Fig. 6b) en ALEXA (Fig. 6c), was de excitatiegolflengte vastgesteld bij 320 nm en de emissie werd geregistreerd in het bereik van 650 tot 900 nm. Een toename van de excitatiegolflengte veranderde het emissiebereik van de deeltjes niet, waardoor de mogelijkheid van een verstrooiingsproces werd uitgesloten. Fluorescentie-emissies waren licht verhoogd met anti-COX-2-opname (verhoogd met 11,93 absorptie-eenheden (au) voor de hoogste antilichaamconcentratie), anti-MIF (verhoogd met 12,15 au voor de hoogste antilichaamconcentratie) en ALEXA (verhoogd met 3,18 au voor de hoogste antilichaamconcentratie). de hoogste antilichaamconcentratie) in combinatie met AuNP's.

Fluorescentie-emissiespectra van AuNP's geëxciteerd bij 320 nm in aanwezigheid van anti-COX-2 (a ), anti-MIF (b ), en ALEXA (c ). Het TEM-beeld van de sferische nanodeeltjes die in dit onderzoek zijn gebruikt, met de grootte en distributie ervan (d ). Excitatie- en emissiespleten waren 10 nm. De concentratie van AuNP's werd constant gehouden op 29,6 ng/ml⁻¹ . De antilichaamconcentraties zijn 100 ng/ml⁻¹ (blauwe curve), 150 ng/ml⁻¹ (rode curve), en 200 ng/ml⁻¹ (groene curve)

Discussie

Het is aangetoond dat AuNP's fluorescentie-eigenschappen hebben, vanwege hun chemische structuur en grootte, en kunnen werken als amplificerende moleculen van fluorescerende signalen. Meer specifiek, AuNP-fluorescentie zelf is afkomstig van aurofiele interacties op het oppervlak van goudatomen [17, 18]. De gegevens uit figuur 6 zijn vergelijkbaar met de bevindingen van onderzoeken naar zilveren nanodeeltjes, die de verhoogde fluorescentie-emissie te danken hebben aan de concurrentie tussen adsorberende soorten en de moleculaire zuurstof opgelost in oplossing. Daarom kan de verhoogde fluorescentie-emissie van gouden nanodeeltjes worden toegeschreven aan het feit dat BSA op hun oppervlak wordt geadsorbeerd [19].

Het fluorescentiesignaal is een functie van het oppervlakteplasmonresonantiefenomeen (SPR). Vandaar dat de toename van de hoeveelheid vrije elektronen leidt tot een intenser SPR-signaal, aangezien SPR de collectieve oscillatie van vrije elektronen is. De geadsorbeerde BSA verhindert dat de vrije elektronen aan het oppervlak binden aan de zuurstofmoleculen, wat leidt tot een toename van het fluorescentiesignaal [20, 21]. Anti-COX-2, anti-MIF en ALEXA zijn mogelijk geadsorbeerd aan de AuNP's, waardoor O₂ wordt voorkomen van het bereiken van het oppervlak van de nanodeeltjes. Dit wordt ondersteund door Fig. 6, waar de toename van het fluorescentiesignaal optrad bij zeer lage concentraties van de verschillende antilichamen. Het is echter de moeite waard om op te merken dat ALEXA een hogere concentratie nodig had om O₂ . te veroorzaken isolatie van het AuNPs-oppervlak.

Het chronische ontstekingsproces wordt gekenmerkt door de infiltratie van immuuncellen, voornamelijk macrofagen, op de plaatsen van verwonding veroorzaakt door azijnzuur of ethanol in het respectieve model. Ontsteking wordt ook gekenmerkt door de leukocyt-afhankelijke afgifte van verschillende cytokinen en mediatoren als reactie op een pathogeen of een stressvolle toestand. Van deze cytokinen is bekend dat COX-2 en MIF markers zijn voor verschillende ontstekingsprocessen, aangezien het pro-inflammatoire cytokinen zijn. De groene kleuring die wordt waargenomen in Fig. 3 en Fig. 4 is te wijten aan de afgifte van respectievelijk COX-2- en MIF-cytokinen.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ). In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

Conclusions

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.