Goud nanopartikel-gebaseerde immunofluorescentie stelt snelle, gevoelige detectie van inflammatie-geassocieerde kanker biomarkers in staat

Samenvatting

Vroege kankerdetectie hangt af van het identificeren van inflammatoire signalen die maligniteit voorafgaan. We evalueerden primair antistof-geconjugeerde goud nanopartikels (AuNPs) als gerichte contrastmiddelen voor chronische inflammatie in ulcerative colitis (UC) en steatohepatitis modellen, condities die predisponeren voor darm- en leverkanker. AuNPs (7,1 nm) werden gesynthetiseerd via een kosteneffectieve, milieuvriendelijke route en geconjugeerd met anti-COX-2, anti-MIF en Alexa Fluor® 488 (ALEXA). Drie immunofluorescentie (IF) protocollen - 30-min en overnachting incubatie, plus een amplificatie protocol - werden vergeleken met de standaard ALEXA IF workflow. Flow cytometrie (FC) gebruikte AuNPs om M2 macrofagen te labelen. Conjugatie werd bereikt door directe adsorptie, bevestigd door vergelijkbare fluorescentie intensiteit met ALEXA. Het 30-min AuNP protocol verminderde de totale IF tijd van 23 uur naar 5 uur en FC tijd van 4 uur naar 1 uur, wat een arbeidsbesparende, klinisch haalbare alternatief biedt voor inflammatie-gedreven kankerdiagnostiek.

Inleiding

Goud nanopartikels (AuNPs) zijn uitgegroeid tot veelzijdige sondes voor optische imaging, bieden grootte-afstelbare optische eigenschappen, hoge biocompatibiliteit en gemakkelijke functionalisatie. Antistof-AuNP conjugaten maken real-time detectie van goudopname in levende cellen mogelijk, wat nauwkeurige kwantificering van nanopartikeldistributie in ziektestoestanden faciliteren. Historisch werd coloidale goud gebruikt voor elektronenmicroscopie van bacteriële antigenen, en later uitgebreid tot diverse biomedische toepassingen, waaronder genomen, biosensing en fotothermale therapie. In oncologie verbeteren AuNPs fluorescentiesignalen en X-ray attenuatie, wat tumor imaging gevoeligheid verbetert.

Opbouwend op ons eerdere werk dat AuNP-geconjugeerde antistoffen voor colorectaal carcinoom imaging aantoonde, introduceert deze studie drie IF protocollen die conventionele fluoroforen vervangen door AuNPs, waardoor kleuring versneld en reagentverbruik verminderd wordt. We valideren ook AuNPs in FC voor het labelen van M2 macrofagen, sleutelspelers in tumor-geassocieerde inflammatie.

Methoden

Doel

Om aan te tonen dat AuNPs conventionele fluoroforen in IF en FC kunnen vervangen, wat snellere, even betrouwbare kleuring voor inflammatie-gedreven kanker biomarkers biedt.

Reagentia

AuCl₃, PVP (MW 10.000), NaOH, glycerol, PBS, BSA (5%), anti-COX-2, anti-MIF, Alexa Fluor® 488 secundaire antistof, en Fluoroshield met DAPI.

AuNP Synthese en Karakterisering

Sferische AuNPs (7,1 nm) werden bereid door AuCl₃ te reduceren in aanwezigheid van PVP, glycerol en NaOH, wat een dieprode colloid opleverde. UV-vis spectra en fluorescentiemetingen bevestigden monodispersiteit en oppervlakte plasmon resonantie. Antistoffen werden direct geadsorbeerd op AuNPs, wat stabiele conjugaten opleverde.

Diermodellen

Acetinezuur-geïnduceerde UC in vrouwelijke Wistar ratten (n=5) en alcohol-geïnduceerde steatohepatitis in mannelijke Wistar ratten (n=5) werden gevestigd per standaard protocollen. Weefsels werden gefixeerd, ingebettet en gesneden (4 µm) voor IF.

Immunofluorescentie Protocollen

Drie AuNP-gebaseerde protocollen werden geëvalueerd:

• NP1 (30 min): Primair antistof (1:500 COX-2, 1:400 MIF) geïncubeerd 30 min, gevolgd door 30 min AuNP toevoeging.
• NP2 (overnacht): Primair antistof geïncubeerd 18 uur, dan 1 uur AuNP incubatie.
• NP3 (amplificatie): ALEXA gedilueerd (1:200-1:800) gemengd met AuNPs; 1 uur incubatie.

Standaard ALEXA protocollen (A1 overnacht, A2 30 min) diensten als controles. Sneden geïmageerd op Zeiss Observer z.1 met kwantitatieve pixel-gewijze fluorescentieanalyse.

M2 Macrofage Labeling en Flow Cytometrie

RAW 264.7 cellen werden gepolariseerd naar M2 met IL-4 (20 ng mL⁻¹) voor 48 uur. Cellen werden geïncubeerd met COX-2/MIF primair antistoffen en gelabeld met ofwel ALEXA of AuNPs (N1 protocol). Na fixatie werden monsters geanalyseerd op BD FACSCanto II; data verwerkt met FlowJo.

Statistische Analyse

ANOVA met Bonferroni post-hoc (IF) en Dunn's test (FC) beoordeelden significantie; p < 0,05 significant.

Resultaten

Microscopie

H&E beelden bevestigden verwachte inflammatoire pathologie. Fluorescentie intensiteit van NP1 en NP2 matched A1, en NP3 versterkte signaal, wat twee-voudige ALEXA dilutie zonder helderheidsverlies toeliet. Korte-tijd (30 min) protocollen (A2, NP1) produceerden vergelijkbare kleuring met overnacht standaarden, wat haalbaarheid voor snelle diagnostiek aantoont.

Flow Cytometrie

IL-4-gepolariseerde RAW cellen vertoonden verhoogde CD163 (M2 marker) en onveranderde CD86 (M1). AuNP-gelabelde COX-2/MIF produceerden fluorescentie intensiteiten vergelijkbaar met ALEXA, wat efficiënte oppervlaktebinding en minimaal reagentgebruik bevestigt.

Fluorescentie Spectroscopie

AuNPs vertoonden emissie bij 650-900 nm na 320 nm excitatie. Antistof adsorptie verhoogde fluorescentie met ~12 a.u., wat succesvolle conjugatie en versterkt signaal door verminderde zuurstof quenching aangeeft.

Discussie

AuNPs bezitten intrinsieke fluorescentie en fungeren als signaalversterkkers door zuurstoftoegang tot oppervlakte elektronen te blokkeren, wat oppervlakte plasmon resonantie versterkt. Conjugatie via directe adsorptie biedt een eenvoudige, schaalbare benadering, vermijdend covalente chemie en antistofactiviteit behoudend. Het NP1 protocol vermindert de totale IF workflow met 18 uur, terwijl FC tijd daalt van 4 uur naar 1 uur, wat substantiële workflow efficiënties biedt. Belangrijk is dat AuNPs gevoeligheid behouden voor COX-2 en MIF, sleutel biomarkers in UC-geassocieerde darmkanker en alcohol-geïnduceerde steatohepatitis-gerelateerde hepatocellulaire carcinoom. Gegeven de hoge prevalentie van chronische inflammatie in kankerrisico, zijn snelle, kosteneffectieve detectiemethoden essentieel.

Conclusies

AuNP-gebaseerde IF en FC protocollen leveren fluorescentie intensiteiten op niveau met conventionele fluoroforen, terwijl ze incubatietijden en reagentverbruik drastisch verminderen. Deze bevindingen openen wegen voor klinische adoptie van AuNPs in diagnostische pathologie en potentiëel in therapeutische targeting van M2 macrofagen.

Afkortingen

A1

ALEXA standaard protocol

A2

ALEXA gemodificeerd protocol

ALD

Alcoholic liver disease

ALEXA

Alexa Fluor® 488®

AuNP

Goud nanopartikels

BSA

Bovine serum albumine

COX-2

Cyclooxygenase-2

FC

Flow cytometrie

FI

Fluorescentie imaging

IF

Immunofluorescentie

MDA

Malondialdehyde

MIF

Macrophage migration inhibitory factor

NP1

Nanopartikels protocol 1

NP2

Nanopartikels protocol 2

NP3

Nanopartikels protocol 3

SPR

Surface plasmon resonantie

UC

Ulcerative colitis