Groen-gesynthetiseerde Nikkeloxide-nanodeeltjes uit Gember en Knoflook tonen Sterke Antibacteriële en Katalytische Prestaties

Samenvatting

Fyto-gesynthetiseerde nanodeeltjes (NPs) met verminderde chemische toxiciteit zijn wereldwijd in de belangstelling gekomen en zijn recent een essentieel onderdeel van nanotechnologie geworden. We bereidden groen fytochemisch (gember en knoflook) gereduceerde NiO-NPs om synthetische bactericide en katalytische agentia in de textielindustrie te vervangen. NPs werden gekarakteriseerd met ultra-violette zichtbare spectroscopie (UV-Vis), röntgendiffractie (XRD), röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS), Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FTIR), energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDS), scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie elektronenmicroscopie (TEM). De synthese van NPs werd bevestigd door XRD en UV-Vis met sterke absorptie bij 350 nm met grootte variërend tussen 16–52 nm voor gember en 11–59 nm voor knoflook. Scanning en transmissie elektronenmicroscopie bevestigden pleomorfisme met kubische en meer sferische NPs. Bovendien zijn de exacte hoeveelheden knoflook- en gemberextracten (1:3,6 ml) geïmpregneerd om NiO-NPs te synthetiseren met succes bevestigd door FTIR. Fytochemisch gereduceerde NPs door knoflook presenteerden versterkte bactericide activiteit tegen multidrug-resistente Staphylococcus aureus bij toenemende concentraties (0,5, 1,0 mg/50 μl) en degradeerden methylene blauw (MB) kleurstof efficiënt. Concluderend, groen gesynthetiseerde NiO-NPs zijn toekomstige actieve stoffen om medicamenteuze resistentie op te lossen alsmede milieuvriendelijke katalytische agentia die op industriële schaal gekozen kunnen worden.

Inleiding

Nanotechnologie betreft materie met ten minste één dimensie van 1–100 nm die de mogelijkheid biedt om materiaal te ontwerpen door hun grootte te controleren [17]. NPs hebben vanwege hun unieke chemische, fysieke en biologische eigenschappen in diverse velden, waaronder geneeskunde, grote aandacht gekregen. Hun eigenschappen kunnen gemakkelijk gewijzigd worden door de grootte op nanometerschaal te veranderen [47].

Nikkel (Ni) en nikkeloxide (NiO) NPs hebben groot belang vanwege hun specifieke magnetische, katalytische en elektronische eigenschappen in energietechnologie, magnetisme, biomedicijnen en elektronica [9, 26, 35]. NiO met een brede bandkloof van 3,6 tot 4,0 eV en kubische kristalstructuur heeft potentieel door p-type halfgeleider. Deze NPs met hoge chemische stabiliteit, supercondensatoreigenschappen, elektronenoverdrachtsvermogen en electrokatalyse worden gebruikt in biomedicijnen en fotokatalytische, anti-inflammatoire en antibacteriële activiteiten [8, 10, 11, 45]. Het opduiken van infectieuze ziekten, met name antibioticaresistente (MDR), heeft de volksgezondheid wereldwijd verwoest. Over het algemeen zijn zowel pathogene Gram-positieve (G +ve) als Gram-negatieve (G −ve) bacteriestammen onder de grootste volksgezondheidsschijning.

In de zuivelindustrie is boviene mastitis een grote problematische ziekte met grote economische impact gekenmerkt door chemische, microbiologische en fysieke veranderingen in melk, terwijl pathologische veranderingen in de uierklierweefsels [6, 19]. Mastitis-etiologie omvat infectieuze agentia, d.w.z. bacteriën, virussen en schimmels en de belangrijkste zijn bacteriën, verdeeld in twee groepen: majors (Streptococci, Staphylococcus aureus, Corynebacterium pyogenes en Coliform) en minor pathogenen (Corynebacterium bovis en coagulase-negatieve Staphylococci) [25]. Het opduiken van multidrug-resistente Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriestammen vormt een significante dreiging voor de volksgezondheid [23, 32].

Zingiber officinale (gember) is een belangrijke ingrediënt in Ayurveda en Unani, en Chinese kruidenmedicine wordt behandeld voor diverse aandoeningen zoals anti-misselijkheid, verteerhulp, reumatisme en bloedingsstoornissen vanwege de grote diversiteit van vluchtige oliën zoals zingiberol, monoterpeen, sesquiterpeen en sesquiterpeen koolwaterstoffen [12, 13, 43]. Echter, Allium sativum (knoflook) bevat organo-zwavelcomponenten, d.w.z. allylsulfide-groepen, alliin, ajoene, allylcysteine en allicine, en andere zoals vitaminen, fosfolipiden, flavonoïden, aminozuren en vetzuren die de medische eigenschappen orienteren [14, 24]. We wilden de bactericide werking van fytochemisch gereduceerde Ni-metaaloxide NPs beoordelen tegen MDR (S. aureus), een isolaat van boviene mastitis, en dit zal het eerste rapport zijn uit Pakistan in het veterinaire onderzoeksgebied over bovengenoemde agentia.

Methoden

De huidige studie was gericht op het onderzoeken van de bactericide werking van fytochemisch gereduceerde NiO-NPs tegen MDR (S. aureus), een isolaat van boviene mastitis.

Materialen

Nikkelnitraat [Ni(NO₃)₂], natriumhydroxide (NaOH), methylene blauw (MB) en natriumborohydride (NaBH₄) van analytische graad werden gekocht van Sigma-Aldrich®, en verse gember- en knoflookwortels werden verzameld van de lokale markt. Wortels werden in de schaduw gedroogd om constant gewicht te bereiken voor verdere verwerking. Antibioticadiscs werden gekocht van Bioanalyse® (Turkije). Bacteriële groeimedia die gebruikt werden waren van analytische graad door TM Media, (Titan Biotech Ltd, India).

Bereiding van Waterige Extracten

Gember- en knoflookwortels wurden tot fijn stof vermalen door gebruik te maken van een elektrische malmachine en in plastic containers bewaard. Gemalen wortelpoeder werd gemengd met gecontroleerde hoeveelheid gedemineraliseerd water-DIW (1:10) onder vigoreus roeren bij 70 °C gedurende 30 min. Extracten werden afgekoeld, gefiltreerd door Whatman No.1 filterpapier, en opgeslagen bij 4 °C (Fig. 1) tot verder gebruik.

Groene Synthese van NiO-NPs

Gember- en knoflookwaterige extracten van verschillende verhoudingen (1,2, 1,8, 2,4, 3,0, 3,6 en 4,2 ml) werden toegevoegd aan nikkelnitraat (0,1 M) onder continue roering. Geroerde oplossing pH 12 werd gehandhaafd met NaOH (2 M) bij 90 °C gedurende 2 uur. De gevormde neerslagen werden gecentrifugeerd bij 10.000 toer/min gedurende 10 min, gewassen met DIW, en overnacht gedroogd in een hete-luchtoven bij 90 °C geïllustreerd in Fig. 1.

Karakterisering

Absorptiemaxima (ƛ_max) van gesynthetiseerde NPs werden gescand door UV-Zichtbaar spectrophotometer (Genesys 10 S) van 200–800 nm golflengtes. Fase-samenstelling en structurele informatie werden geanalyseerd door röntgendiffractie (XRD) BUNKER D2 phaser met 2θ bereik van (10–80°) uitgerust met Cu Kα1 straling van λ = 1,540 Å. Groen gesynthetiseerde NiO-NP functionele groepen werden vastgelegd met Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (ATR-FTIR). Grootte, vorm en elementaire analyse van NPs werden geanalyseerd door veld-emissie elektronenmicroscoop (FESEM) en transmissie elektronenmicroscopie Hitachi H7100FA (TEM). De monster-samenstelling met corresponderende bandkloof werd onderzocht door röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS).

Isolatie en Identificatie van MDR S. aureus

Isolatie van S. aureus

Klinisch positieve boviene melkmonsters verzameld van particuliere en publieke sector veterinaire ziekenhuizen en boerderijen in Punjab, Pakistan, werden gekweekt op 5% schaapbloedagar en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 24–48 uur. De karakteristieke kolonies verkregen werden verder gestreept op mannitolzoutagar (MSA) TM Media (Titan Biotech Ltd, India) in drievoud om gezuiverde S. aureus te isoleren.

Identificatie van MDR S. aureus

Identificatie van bacteriële kolonies werd gedaan door morfologische kenmerken, Gram-kleuring en biochemische procedures (coagulase- en katalasetest) volgens beschrijving van Burgey's handboek van determinatieve bacteriologie.

Antibioticagevoeligheid van karakteristieke kolonies werd geëvalueerd door schijfdiffusietest gebaseerd op richtlijnen van National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) voor isolatie van MDR S. aureus. Antibioticadiscs bevattende oxytetracycline (30 μg), tylosine (30 μg), gentamicine (10 μg), ciprofloxacine (5 μg) en trimethoprim + sulfamethoxazol (1,25 μg + 23,75 μg) werden aseptisch toegepast op Mueller-Hinton agar (MHA) TM Media (Titan Biotech Ltd, India) 1 × 10⁸ CFU/ml en bij 37 °C 24 uur bewaard [7]. Bacterium dat resistent werd gevonden tegen minimaal drie antibiotica werd MDR gedeclareerd [28].

Antimicrobiële Activiteit

In vitro antimicrobiele actiepotentieel van fytochemisch gereduceerde NiO-NPs werd geëvalueerd door agar-putdiffusiemethode op tien representatieve isolaten van MDR S. aureus verzameld uit mastitische melk. Petrischotels werden afgedaan met 1,5 × 10⁸ CFU/ml (0,5 McFarland standaard) MDR S. aureus op MSA. Putten van 6 mm diameter werden gevormd met behulp van steriele kurkboorder. Verscheidene concentraties van individuele waterige extracten van gember, knoflook en groen gesynthetiseerde (fytochemisch gereduceerde) NiO-NPs werden toegepast. Waterige extracten werden gebruikt in concentraties van (10 mg/100 μl) en (50 mg/100 μl) en NiO (0,5 mg/50 μl) en (1,0 mg/50 μl). Ciprofloxacine (0,005 mg/50 μl) werd gebruikt als positieve controle en DIW als negatieve controle (50 μl).

Statistische Analyse

De antimicrobiële efficiëntie werd berekend in termen van inhibitiezone (mm) grootte, en inhibitiezone diameters werden statistisch geanalyseerd door eenvoudige variantieanalyse (ANOVA) met SPSS 20.

Katalyse

Voor katalytische evaluatie van gesynthetiseerde extract NiO, werd vers bereide waterige natriumborohydride (300 μl) gemengd met 3 ml methylene blauw (0.03 × 10⁻³ M) oplossing. Vervolgens werd 300 μl colloïdale monster van gewenste concentratie aan de oplossingen toegevoegd. Lichtblauwe kleur van methylene blauw kleurstof (MB) verdween, wat vertegenwoordigde kleurstofdegradatie tot leucomethylene blauw zoals getoond in Fig. 2. De absorptie werd genoteerd tussen 200–800 nm met UV-Vis spectrophotometer.

Resultaten en Discussie

Optische eigenschappen van fytochemisch gereduceerde NiO door gember- en knoflookwaterige extracten tussen 200–600 nm worden gepresenteerd in Fig. 3a, b. De maximale absorbantie (λ_max) in NiO-NPs werd waargenomen rond 350 nm (1:3,6 ml) wat toegenomen met extractconcentratie vergezeld door blauwe verschuiving. Absorptiepieken van gember- en knoflookextracten verschenen rond 275 en 280 nm, respectievelijk. Abrupte kleurverandering in reactiemengsels werd gezien van wijnrood naar lichtgroen na incorporatie van wortelextracten. Piekverbreiding wees op deeltjesagglomeratie en elektronische overgang van valentie naar geleidingsbanden met extractconcentratie in NiO zoals onthuld door sterke absorptiebanden [20]. Daarom toonden resultaten in Fig. 3a, b afname in absorptie van gesynthetiseerde NPs met toegenomen of afnemen extractvolume buiten geoptimaliseerde waarde (1:3,6 ml). De bandkloof werd berekend met behulp van Tauc's plot (Vgl. 1).

$$ \left(\alpha hv\right)=B{\left( hv-{E}_g\right)}^{\raisebox{1ex}{$1$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$2$}\right.} $$ (1)

Waarbij α de absorptiecoëfficiënt is, h de constante van Planck, B een constante, υ de fotonfrequentie, en E_g de energie-bandkloof. De geschatte bandkloof van fytochemisch gereduceerde NiO door gember en knoflook uit een plot van (αhʋ)^1/2 tegen fotonenergie (hʋ). De intercept van een raaklijn aan x-as werd vastgelegd, wat bandkloof-energieën van monsters opleverde zoals getoond in Fig. 3c, d. De variaties in bandkloof-energieën werden bepaald bij gember-doping in NiO van 4,15 tot 3,1 eV en met knoflook van 3,5 tot 3,0 eV respectievelijk (Fig. 3c, d).

NiO-NPs kristallijnheid, grootte en fase-samenstelling werden bevestigd door XRD zoals getoond in Fig. 4 a, b. De pieken bij 2θ waarden 37,10°, 43,32°, 62,81° en 76,51° corresponderen met (111), (200), (220) en (311) (JCPDS kaart nr: 00-047-1049) (Fig. 4a, b) gerefereerd door [30]. De piekintensiteit wijst op hexagonale en vlak-gecentreerde kubische (fcc) NiO met gemiddelde grootte 32,9 nm berekend door D = 0,9λ/βcosθ voor gember en 29,92 nm voor knoflook fytochemisch gereduceerde NiO-NPs. De brede pieken duiden op aanwezigheid van zuurstofferuimtes en lokale roosterwanorde in monster [38]. Verscheidene fytochemicaliën van gember (flavonoïden, alkaloïden, tanninen en saponinen) en knoflookwaterige extracten (allicine, allylsulfide, alliin, vetzuren, glycolipiden, fenolen, aminozuren en flavonoïden) die fungeren als capping-agentia zijn verantwoordelijk voor gemiddelde kristalgrootte van metaaloxide NPs [14, 46].

De vastgelegde FTIR-spectra van NiO gebiosynthetiseerd uit gember- en knoflookwortels worden getoond in Fig. 5 a, b. Uitgebreide brede absorptie bij 3380 cm⁻¹ corresponderen met OH en piekverbreiding wijst op carbonylgroep met (N-H) amine rekfrequentie [50]. De scherpe absorptie bij 2313 cm⁻¹ wijst op rektrillingen van CO₂ hetzij luchtmatig of CO₂ binnenin NP-korrels. Snelle absorptie van atmosferische CO₂ wijst op groter oppervlak van materiaal [18]. De brede absorptie bij 1629 cm⁻¹ corresponderen met C=C aromatische ring rek en scherpe pieken bij 1392 en 1064 cm⁻¹ corresponderen met rektrillingen van C–N alifatische aminen [48]. De intense pieken bij 978 cm⁻¹ bevestigden metaal-zuurstof rekfrequentie van NiO [44].

De piekverschuivingen waargenomen na bio-reductie van NiO als 2535–2313, 1828–1629 en 1585–1392 cm⁻¹ wijzen op fytochemicaliën, terpenoïden, flavonoïden, polyolen en proteïnen met ketonen, alcoholen, carboxylatezuren en amine functionele groepen verantwoordelijk voor cheleren en capping in bio-reductie [42].

Oppervlaktemorfologie en grootte van fytochemisch gereduceerde NiO-NPs werden bepaald met behulp van veld-emissie scanning en transmissie elektronenmicroscopie zoals gepresenteerd in Fig. 6a–f. De NiO-NPs toonden pleomorfisme met kubische en meer sferische vorm (< 50 nm) met lichte agglomeratie [40]. De agglomeratie van NPs kon evident zijn door polymere hechting en magnetische interactie tussen de deeltjes [49].

Elementaire analyse en verdere kenmerken van gesynthetiseerde NiO-NPs werden beschreven door energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDS) die zuivere NiO-fasen bevestigde zoals getoond in Fig. 7a, b. De EDS-spectra bevestigden drie pieken direct gerelateerd aan hoge zuiverheid van Ni aanwezig in geteste monsters tussen 1 en 10 kV. De atoomsgewichtspercentages waargenomen door spectra voor Ni, O, C en Zn zijn 54,69, 27,81, 18,06 en −0,55, respectievelijk.

XPS toont C1s, O1s en Ni2p spectra van fytochemisch gereduceerde NiO-NPs in Fig. 8a–d die chemische aard en bindingsstatussen van gesynthetiseerde monsters suggereren. De meest intense pieken bij 284,8 en 286,2 eV demonstreren C1s spectrum (Fig. 8b) corresponderend met C–C en C–OH/C–O–C [21]. De O1s piek bij 530,8 eV (Fig. 8c) kan toegewezen worden aan hydroxylgroepen van zuurstofatomen, zuurstofatomen angrenzend aan nikkelvacatures, of zuurstof-gebonden koolstofatomen C=O [1, 15, 37]. De bijdrage gelegen op 532,2 eV schrijft toe aan zuurstofatomen in geadsorbeerde watermoleculen (NiOH) [31, 41]. Het Ni2p spectrum bevattend Ni2p3/2 en Ni2p1/2 pieken kan gescheiden worden met behulp van Gaussiaans-Lorentziaanse functie in vijf componenten (Fig. 8d). De meest intensieve pieken bij 872,72 en 855,82 eV behoren tot Ni2p1/2 en Ni2p3/2 met corresponderende satelietpieken 879,36 en 861,57 eV, respectievelijk [16]. De spin-baan splitting tussen de Ni (2p1/2) en Ni (2p3/2) en NiO-NP kernniveau is 17,28 eV wat goed correspondeert met eerdere rapporten [33, 34].

De antimicrobiële/bactericide werking van gember- en knoflookwortelextracten en groen/fytochemisch gereduceerde NiO-NPs werd geëvalueerd met behulp van agar-putdiffusie-assay via inhibitiezone-metingen (mm) zoals getoond in Fig. 9a–d en Tabel 1. De resultaten toonden een sterke relatie tussen NP-concentratie en inhibitiezones (mm). Significante inhibitiezones (mm) (P < 0,05) werden vastgelegd voor monster 1 (1,2 ml:1), 2 (1,8 ml:1), 3 (2,4 ml:1), 4 (3 ml:1), 5 (3,6 ml:1) en 6 (4,2 ml:1) variërend (3–4,9 mm) en (3,05–5,2 mm) bij lage en hoge concentraties fytochemisch gereduceerde NiO-NPs door gember (Fig. 9c, d), terwijl (3,15–5,3 mm) en (3,75–5,9 mm) fytochemisch gereduceerde NPs met knoflook tegen MDR S. aureus (Fig. 9e, f). Gemberwortelwaterige extracten toonden nul effectiviteit (Fig. 9a), en knoflookwortels toonden 2,65 en 5 mm inhibitiezones bij lage en hoge concentraties, respectievelijk (Fig. 9b). Alle resultaten werden vergeleken met negatieve controle DIW (0 mm) en positieve controle ciprofloxacine (12,55 mm). Over het algemeen toonden fytochemisch gereduceerde NiO-NPs met knoflook significante (P < 0,05) versterkte bactericide actie tegen MDR S. aureus.

Katalytische Activiteit

Figuur 10 a–e demonstrerend MB katalytische reductie in de aanwezigheid van wortelextracten en groen/fytochemisch gereduceerde NiO-NPs bij kamertemperatuur. Figuur 10 a toont katalytisch potentieel van NiO-NPs gesynthetiseerd door conventionele route terwijl (Fig. 10b, c) katalytisch potentieel van gember- en knoflookwortelwaterige extracten vertegenwoordigen. Katalytische capaciteit van fytochemisch gereduceerde NiO-NPs wordt vertegenwoordigd in Fig. 10d, e. Het is duidelijk dat NiO en plantwortelextracten geen efficiënte nanokatalysatoren zijn omdat ze 15, 21 en 38 minuten verbruikten voor methylene blauw reductie (Fig. 10a–c). Fytochemisch gereduceerde NPs met gember toonden snelle degradatie (λ_max = 8 min) met efficiënte conversie van MB tot leucomethylene blauw (Fig. 10d). Knoflook-gemedieerde NiO-NPs toonden vergelijkbaar patroon van 100% kleurstofreductie in 5 min (Fig. 10e).

Groen/fytochemisch gereduceerde NPs voeren significatieve katalytische kleurstofdegradatie uit door elektronen over te dragen van donor-soorten (BH₄) naar acceptor (MB) en het systeem te stabiliseren door de activeringsenergie te verlagen [27]. De data onthulden groene NPs als efficiënte nanokatalysatoren vergeleken met conventionele NPs en individuele extract.

Conclusie

NiO-NPs met gember- en knoflookwortelextracten dienden als uitstekende bactericide alsook katalytische agentia. Wortelextract-incorporatie met fytochemische groepen resulteerde in succesvolle NiO-NP-synthese onthuld door FTIR. De XRD-pieken bevestigden NiO hexagonale en vlak-gecentreerde kubische (fcc) rooster en SEM bevestigde pleomorfisme met kubische en meer sferische morfologie van NPs met gemiddelde grootte 16–52 (gember-doping) en 11–59 nm (knoflook-doping). Echter, elementaire analyse onthulde chemische aard en bindingsstatussen geanalyseerd door EDS en XPS en presenteerde werkelijk percentage van nikkel en zuurstof, terwijl UV-analyse absorptiepiekenverschil in bereik 350 nm verifieerde en blauwe verschuiving introduceerde bij hogere hoeveelheid dopanten. Fytochemisch knoflook-gereduceerde NiO bij hoge concentratie werd krachtiger gevonden vergeleken met gember-gereduceerde NPs tegen MDR S. aureus alsook efficiënte MB-reductie. Dus groen/fytochemisch gereduceerde NiO uit knoflookwortelextracten kan toegepast worden in geavanceerde geneeskunde als vervanger van antibioticaresistentie en in textielindustrieën als katalytisch agent zonder milieugevaar.