Hoe Multi-walled Koolstofnanobuizen Tomato Zijwortelontwikkeling Bevorderen via Stikstofmonoxide Signaaltransductie

Samenvatting

Volledige studies onthulden dat multi-walled koolstofnanobuizen (MWCNTs) giftig zijn voor planten. Echter, of of hoe MWCNTs de zijwortelvorming (ZW) beïnvloeden, wat een belangrijk onderdeel is van de aanpassingsvermogen van het wortelstelsel aan diverse omgevingscues, blijft controversieel. In dit rapport vonden we dat MWCNTs in tomatenzaailingwortels kunnen binnendringen. De toediening van MWCNTs bevorderde tomaten ZW-vorming in een ongeveer dosis-afhankelijke manier. Endogene stikstofmonoxide (NO) productie werd getriggerd door MWCNTs, bevestigd door de Griess-reagentmethode, elektronparamagnetische resonantie (EPR) en laserscanning confocal microscopie (LSCM), samen met de scavenger van NO. Een oorzaak-gevolgrelatie bestaat tussen MWCNTs en NO in de inductie van ZW-ontwikkeling, aangezien MWCNT-getriggerde NO-synthese en ZW-vorming duidelijk geblokkeerd werden door de verwijdering van endogene NO met zijn scavenger. De activiteit van NO-genererend enzym nitraatreductase (NR) was toegenomen in reactie op MWCNTs. Tungstaat-inhibitie van NR niet alleen de NO-productie verstoorde, maar ook ZW-vorming geïnduceerd door MWCNTs ongedaan maakte. De toevoeging van N^G-nitro-l-arginine methylester (l-NAME), een inhibitor van het mammalische stikstofmonoxidesynthase (NOS)-achtige enzym, faalde om ZW-vorming te beïnvloeden. Collectief stelden we voor dat NO kan fungeren als een downstream signaleringsmolecuul in MWCNT-controle van ZW-ontwikkeling, ten minste deels via NR.

Inleiding

Er zijn veel biologische en biomedische toepassingen van koolstofnanobuizen [1, 2]. Vanwege de unieke capaciteit om gemakkelijk celmembranen te penetreren, is de biosafety van koolstofnanobuizen altijd een debat onderwerp [3, 4]. Tegenwoordig, aangezien de productie en het gebruik van koolstofnanobuizen snel groeien, wordt het belangrijk om de gedetailleerde mechanismen van de cytotoxiciteit in mensen en zoogdieren, en recentelijk in planten te karakteriseren [3,4,5,6,7,8,9]. Het is bekend dat planten en hun gemeenschappen zeer belangrijk zijn voor mensen en milieu, en ze lopen ook risico op blootstelling aan koolstofnanobuizen, door opbouw in gronden via biosolide meststoftoepassing [6, 10, 11]. Als belangrijke leden van koolstofnanobuizen, is de toxiciteit van multi-walled koolstofnanobuizen (MWCNTs), bestaande uit meerdere gerolde lagen van grafeen, breed onderzocht. Studies in zoogdieren onthulden dat blootstelling aan zowel MWCNTs als single-walled koolstofnanobuizen geïnduceerde oxidatieve schade en NF-κB-activatie in humane keratinocyten en A549-cellen [9, 12]. MWCNTs en single-walled koolstofnanobuizen kunnen fuseren met het plasma-membraan, wat celschade veroorzaakt door lipideperoxidatie en oxidatieve stress [9, 11, 13, 14]. Cytotoxiciteit en oxidatieve stress getriggerd door MWCNTs, alsook matige inflammatoire reacties, werden waargenomen in humane navelstreng vene endotheelcellen [15]. Eerdere studie suggereerde dat de primaire toxiciteit van MWCNTs in rode spinazie hoofdzakelijk afkomstig was van reactieve zuurstofsoorten (ROS) overproductie, en de toxische effecten konden omgekeerd worden door de aangevulde ascorbinezuur [7]. In deze zin worden MWCNTs beschouwd als een nieuwe gestresste factor voor organismen, hetzij in dieren of in planten.

Zijwortel (ZW) vorming, een belangrijke determinant van wortelarchitectuur, wordt beschouwd als een indicator van adaptieve reactie op diverse stresses [16]. In hogere planten wordt de vorming van ZW beïnvloed door fytohormonen en een breed scala aan omgevingscues, waaronder waterbeschikbaarheid, nutriënten en abiotische stress, zoals hypoxide en zware metaal stress [17,18,19]. Tegelijkertijd bevestigde voldoende bewijs dat de vorming van ZW niet alleen fungeert als fysieke ondersteuning, maar ook bijdraagt aan water- en nutriëntenopname voor plantengroei en -ontwikkeling [19,20,21]. Verschillende omgevingscues kunnen verschillende specifieke stress-geïnduceerde morfogenetische reactie (SIMR) fenotypen triggeren, waaronder de bevordering van ZW-vorming en een remming van wortelverlenging [17]. De regulatie van ZW-vorming wordt ook strak gecontroleerd door fytohormonen, zoals auxine, en de activatie van celcyclus-regulerende genen in reactie op auxine werd voorgesteld [19, 22]. Tegelijkertijd werd de betrokkenheid van enkele kleine moleculen in auxine-getriggerde wortelorganogenese bevestigd in komkommer, tomaat, soja en koolzaad planten [23,24,25,26,27]. Deze kleine moleculen omvatten waterstofperoxide (H₂O₂), stikstofmonoxide (NO), koolstofmonoxide (CO) en waterstofgas (H₂).

Onder deze heeft NO, een vrijradicaal gas, zich bewezen meerdere fysiologische functies in planten te hebben [28, 29]. Naast de verbetering van plantaanpassing tegen stresses, omvatten de functies van NO de bevordering van wortelhaarontwikkeling, adventieve beworteling en zijwortelvorming [30,31,32,33], hoewel de enzymatische bron(nen) van NO-biosynthese in die voormelde processen onopgelost blijft. In dieren wordt de synthese van NO uit l-arginine gekatalyseerd door het heme-bevattende enzym stikstofmonoxidesynthase (NOS) [34]. Hoewel gen(en) die NOS-enzymen coderen niet geïdentificeerd zijn in planten, wordt de mammalische NOS-achtige activiteit breed gedetecteerd [35, 36], en de inhibitoren van de mammalische NOS, zoals N^G-nitro-l-arginine methylester hydrochloride (l-NAME), kunnen NO-generatie in planten remmen [25, 33, 36,37,38,39]. Belangrijk, voldoende genetisch bewijs onthulde dat NO geproduceerd kan worden door nitraatreductase (NR), een bekend enzym verantwoordelijk voor stikstofstofwisseling in planten [28]. De betrokkenheid van NR-gemedieerde NO-productie in stomaatsluiting en koude-acclimatisatie is genetisch gedemonstreerd [37, 38]. Onze eerdere studie toonde aan dat NR-afhankelijke NO-synthese betrokken is bij auxine-geïnduceerde waterstofgas-gemedieerde zijwortelvorming [39].

Tot nu toe werden verschillende reacties in ZW-vorming, bevordering of remming, respectievelijk gerapporteerd in diverse plantensoorten wanneer aangevuld met nanomaterialen, waaronder MWCNTs [40,41,42,43], goudnanodeeltjes (Au NP, [44]), zinkoxide nanodeeltjes (ZnO NP [45, 46];), titaniumdioxide nanodeeltjes (TiO₂ NP [46];), en grafeenoxide (GO [47,48,49];) (Tabel 1), en geen studie heeft nog definitief bewijs geleverd van een rol van NO in bovengenoemde reacties. In deze studie onthulde de detectie van endogene NO door Griess-reagentmethode, laserscanning confocal microscopie (LSCM) en elektronparamagnetische resonantie (EPR) analyses dat het NO-niveau toegenomen was in MWCNT-behandelde tomatenzaailingen. Daarna werd ZW-vorming waargenomen. We bestudeerden verder de betrokkenheid van NO in ZW-vorming getriggerd door MWCNTs, door endogene NO-niveaus te manipuleren met NO-scavenger en antagonistica die NR en mammalische-achtige NOS-activiteit remmen. Vervolg-experiment onthulde dat NR-afhankelijke NO mogelijk, ten minste deels, essentieel is voor ZW-vorming in reactie op MWCNTs. Dit werk opent dus een nieuw venster voor het begrijpen van de biologische effecten van nanomaterialen in planten.

Materialen en Methodes

Chemicaliën

Tenzij anders aangegeven, werden alle overige chemicaliën verkregen van Sigma-Aldrich (St Louis, MO, VS). MWCNTs, gekocht van Sigma-Aldrich, werd gekarakteriseerd zoals eerdere beschreven [50]. De buitendiameter, binnen-diameter en de lengte van MWCNTs waren 6–12 nm, 2,5–5 nm en 1–9 μm, respectievelijk. Na sonicatiebehandeling werd de verkregen homogenecolloidale suspensie gesteriliseerd en gebruikt.

Overige koolstofnanodeeltjes werden verkregen van Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd., waaronder single-walled koolstofnanobuizen (SWCNTs, XFS22; zuiverheid > 95%, diameter 1–2 nm, lengte 5–30 μm, specifiek oppervlak > 1075 m²/g), grafeen (XF001W; zuiverheid ~ 99%, diameter 0,5–5 μm, dikte ~ 0,8 nm, enkele-laag verhouding ~ 80%, BET oppervlak 500~1000 m²/g; elektrische resistiviteit ≦ 0,30 Ω.cm), en geactiveerd koolstof (AC, XFP06; zuiverheid > 95%, deeltjesgrootte 5 ± 1 μm, poriëvolume 1–1,2 cm³/g, poriën 2,0–2,2 nm, specifiek oppervlak ~ 1500–1700 m²/g).

Daarnaast werd natriumnitroprusside (SNP) gebruikt als NO-vrijmakend verbinding [30,31,32,33]. 2-(4-carboxyfenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide kaliumzout (cPTIO) werd beschouwd als een scavenger van NO [51,52,53,54]. Tungstaat (Tg; een inhibitor van NR [28, 33, 37, 55,56,57];) en N^G-nitro-L-arginine methylester hydrochloride (NAME; een inhibitor van mammalische NOS-achtig enzym [25, 33, 36,37,38,39];) werden ook toegepast. In deze studie werden de concentraties van bovengenoemde chemicaliën bepaald in de proefexperimenten, waaruit significante reacties waargenomen werden.

Plantmateriaal en Groeiomstandigheden en Bepaling van ZW-vorming

Tomaat (Solanum lycopersicum L.) zaden "Jiangshu 14" werden vriendelijk geleverd door Jiangsu Landbouw-instituten, Nanjing, Jiangsu Provincie, China. Geselecteerde zaden van identieke grootte werden gekiemd in gedemineraliseerd water bij 25 ± 1 °C in het donker gedurende 3 dagen. De geselecteerde identieke zaailingen met wortels van 2–3 mm werden vervolgens overgebracht naar 6 mL behandeloplossingen met de aangegeven concentraties van MWCNTs, 200 nM 1-naftylazijnzuur (NAA; een bekende auxine), 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, 20 μM tungstaat (Tg), 0,2 mM NAME, en andere koolstofnanodeeltjes, waaronder 5 mg/mL single-walled koolstofnanobuizen (SWCNTs), grafeen en geactiveerd koolstof (AC), alleen of in combinatie voor de aangegeven tijdstippen. Zaailingen werden gekweekt in een verlichtingsincubator (25 ± 1 °C) met een lichtintensiteit van 200 μmol m⁻² s⁻¹ bij 14/10 uur (licht/donker) fotoperiode.

Na behandelingen werden foto's genomen, en het aantal en de lengte van uitgekomen zijwortel (> 1 mm) per zaailing werden bepaald door gebruik te maken van de Image J software (https://rsb.info.nih.gov/ij/) [39, 58]. Zoals eerder beschreven, werden alleen de zijwortel-induceerbare segmenten gebruikt voor de volgende analyse.

Imaging van MWCNT Distributie door Transmissie Elektronenmicroscopie

De distributie van MWCNTs in tomatenzaailingwortel werd gekarakteriseerd met behulp van transmissie elektronenmicroscopie (TEM; JEOL, JEM-200CX, Tokyo, Japan). Monsterbereiding voor TEM-analyse was volgens eerdere protocol [59].

Imaging van Endogene NO door Laserscanning Confocale Microscoop

NO-imaging werd uitgevoerd door gebruik te maken van een tamelijk specifieke NO-fluorescente probe 4-amino-5-methylamino-2′,7′-difluorofluoresceïne diacetaat (DAF-FM DA). Na de probe grondig was gewassen, werden de afbeeldingen verkregen met behulp van de Zeiss LSM 700 confocale microscoop (Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland, excitatie bij 488 nm, emissie bij 500–530 nm voor NO-analyse). In ons experiment werden 20 individuele monsters willekeurig geselecteerd en gemeten per behandeling. Foto's zijn representatief voor identieke resultaten.

NO-gehalte Bepaald door Griess-reagent Assay

Volgens de methoden eerdere beschreven [50], werd NO-gehalte bepaald met de Griess-reagent assay. Belangrijk, voor het ontlopen van de interferentie veroorzaakt door de geconcentreerde nitraat- en nitrietgehalten in planten, werden de identieke monsters voorgeïncubeerd in 200 μM cPTIO (de scavenger van NO) gedurende 30 min beschouwd als de blanco monsters. Na de toevoeging van Griess-reagent gedurende 30 min, werd absorbantie vastgelegd bij 540 nm, en NO-gehalte bepaald door vergelijking met een standaardkromme van NaNO₂.

Bepaling van NO met Elektronparamagnetische Resonantie (EPR)

Volgens onze eerdere methoden [39, 55, 60], werd de bepaling van NO-niveau met behulp van elektronparamagnetische resonantie (EPR) uitgevoerd. De organische oplosmiddellaag werd gebruikt om NO te bepalen op een Bruker A300 spectrometer (Bruker Instrument, Karlsruhe, Duitsland) onder de volgende omstandigheden: kamertemperatuur; microgolf-frequentie, 9,85 GHz; microgolf-vermogen, 63,49 mW; en modulatie-frequentie, 100,00 kHz.

Bepaling van Nitraatreductase (NR) Activiteit

De NR-activiteit werd spectrophotometrisch gedetecteerd bij 540 nm volgens de eerdere methode [57]. Het geproduceerde nitriet werd spectrophotometrisch bepaald bij 540 nm door de toevoeging van 1 mL van 1% (g/v) sulfenilamide in 3 M HCl samen met 1 mL van 0,02% (v/v) n-(1-naftyl)-ethylenediamine.

Statistische Analyse

Waar aangegeven, werden resultaten uitgedrukt als de gemiddelde waarden ± SE van drie onafhankelijke experimenten met drie biologische replicaten voor elk. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de SPSS Statistics 17.0 software. Voor statistische analyse werd Duncan's meervoudige test (p < 0,05) gekozen als geschikt.

Resultaten

MWCNTs niet alleen Binnendringen in Wortelcellen, maar ook Bevorderen ZW-vorming

ZW-vorming is een belangrijke determinant van wortelstelselarchitectuur. Om het effect van MWCNTs op ZW-vorming te onderzoeken, werden 3-daagse tomatenzaailingen geïncubeerd met een reeks concentraties van MWCNTs (0,05, 0,5, 5 en 50 mg/mL) gedurende 3 dagen. De toepassing van 1-naftylazijnzuur (NAA) werd beschouwd als positieve controle. In ons experiment werden zowel ZW-aantal als lengte bepaald als twee parameters van ZW-vorming. Zoals getoond in Fig. 1, in vergelijking met de controllmonsters, induceerden exogene MWCNTs ZW-vorming significant in een ongeveer dosis-afhankelijke manier, met een maximaal effect in 5 en 50 mg/mL. Vergelijkbare induceerbare reactie werd waargenomen wanneer 200 nM NAA werd toegediend. Rekening houdend met de kosten van MWCNTs en induceerbare reactie in ZW-vorming, werd 5 mg/mL MWCNTs toegepast in de volgende experimenten.

Om de specifieke functie van MWCNTs in de inductie van ZW-vorming te valideren, onderzochten we verder of de andere allotropen van MWCNTs ook dergelijke induceerbare effecten hebben. Zoals getoond in Fig. 2a, vertoonden al deze koolstofnanomaterialen toxische effecten op scheutgroei (data niet getoond). Interessant genoeg, de toepassing van MWCNTs, single-walled koolstofnanobuizen (SWCNTs), grafeen en geactiveerd koolstof met identieke concentratie (5 mg/mL) konden differentiëel resulteren in toenames in ZW-aantal en lengte, vergeleken met de chemisch-vrije controleplanten (Fig. 2b). Onder deze chemicaliën werd de maximaal induceerbare reactie ontdekt in MWCNT-geïncubeerde tomatenzaailingen.

Met behulp van transmissie elektronenmicroscopie (TEM) kan de distributie van MWCNTs gemakkelijk geëvalueerd worden. De resultaten getoond in Fig. 3 onthulden dat MWCNTs, wanneer exogeen toegepast, door tomatenzaailingen geabsorbeerd konden worden, en de distributie van MWCNTs werd gevonden in wortelcellen. Dit resultaat kan begrepen worden, aangezien zaailingwortels direct gekweekt worden in vloeistofoplossing bevattende MWCNTs.

MWCNT-Geïnduceerde NO-synthese en Daarna ZW-vorming waren Gevoelig voor cPTIO, een Scavenger van NO

Om te onderzoeken of NO ook betrokken is bij MWCNT-geïnduceerde ZW-vorming, werd de functie van NO in ZW-vorming geïnduceerd door MWCNTs beoordeeld door endogene NO-niveaus te manipuleren met NO-vrijmakende verbinding en de scavenger. Vergelijkbaar met eerdere resultaten [31], kon de toediening van natriumnitroprusside (SNP) resulteren in de inductie van ZW-vorming, en een additieve reactie werd waargenomen wanneer SNP en MWCNTs samen toegepast werden (Fig. 4). Toen 2-(4-carboxyfenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide kaliumzout (cPTIO; een scavenger van NO) werd toegevoegd, werden de bevorderingsreacties in ZW-vorming veroorzaakt door MWCNTs significant verstoord. Alleen, kon cPTIO ZW-ontwikkeling remmen, vergeleken met de chemisch-vrije controle, wat het belang van endogene NO in wortelorganogenese aangeeft.

Om de belangrijke rol van endogene NO in MWCNT-reactie verder te evalueren, werd een tijdscursus van NO-productie in vivo eerst gedetecteerd met de Griess-reagentmethode. Tijdens bovenstaande bepaling werden de identieke filtraten voorgeïncubeerd met cPTIO beschouwd als blanco voor de nauwkeurige resultaten. Het werd waargenomen dat NO-productie in tomatenzaailingwortels dramatisch toegenomen was tot 24 uur na MWCNT-behandeling en daarna herstelde tot de initiële niveaus (48 uur; Fig. 5a). Bovenstaand maximaal niveau van endogene NO getriggerd door MWCNTs gedurende 24 uur was duidelijk ongedaan gemaakt door cPTIO, een scavenger van NO, wat de specifieke rol van NO suggereert.

Om bovenstaande resultaten te bevestigen, werden zowel LSCM als ESR toegepast. Allereerst werden de veranderingen in endogene NO-niveaus in zaailingwortels van tomaat gemonitord door NO te labelen met behulp van de cel-doorlaatbare, tamelijk NO-specifieke fluorescente probe DAF-FM DA en imaging met LSCM. Vergelijkbaar met de eerdere resultaten (Fig. 5a), in de aanwezigheid van cPTIO, was de toegenomen DAF-FM-afhankelijke fluoresentie-intensiteit getriggerd door MWCNTs grotendeels ongedaan gemaakt (Fig. 5b). Deze resultaten impliceerden dat de DAF-FM-getriggerde fluoresentie gerelateerd is aan endogene NO-niveaus in tomatenzaailingwortels.

MWCNT-geïnduceerde NO-productie werd bevestigd door EPR-spectroscopie. Zoals verwacht, presenteerden zaailingwortels behandeld gedurende 24 uur met MWCNTs de typische hyperfijne structuur triplet van het NO-complex. Echter, de toevoeging van cPTIO maakte bovenstaand signaal ongedaan, wat aangeeft dat MWCNT-blootstelling wel resulteerde in een sterke NO-productie (Fig. 5b). Collectief suggereerden deze gegevens dat NO-synthese vereist kan zijn voor MWCNT-getriggerde ZW-vorming in tomatenzaailingen.

NR Kan Verantwoordelijk Zijn voor MWCNT-Geïnduceerde NO-productie en Daarna ZW-vorming

Aangezien NR en mammalische-achtige NOS twee belangrijke enzymen gerelateerd aan NO-synthese in planten zijn, werden zowel tungstaat (een NR-inhibitor) als NAME (een mammalische NOS-inhibitor) toegepast in het volgende experiment. Hier, tungstaat-behandeling onderdrukte de bevordering van ZW-vorming in MWCNT-behandelde tomatenzaailingwortels aanzienlijk (Fig. 6). Vergelijkend, de inductie van ZW-vorming getriggerd door MWCNTs werd niet sterk geremd door de toevoeging van NAME, wat aangeeft dat mammalische-achtige NOS misschien niet het doelwit NO-synthetiserende enzym is verantwoordelijk voor NO-productie geïnduceerd door MWCNTs. Het werd ook waargenomen dat een lichte maar niet significante afname in ZW-vorming werd waargenomen in tomatenzaailingen wanneer zolang tungstaat als NAME apart toegepast werd.

De rol van NR in MWCNT-getriggerde ZW-vorming werd verder onderzocht door NO-productie te monitoren in reactie op toegepaste MWCNTs met of zonder tungstaat. Vergeleken met de veranderingen in endogene NO-productie (Fig. 5a), toonde tijdscursus-analyse in NR-activiteit dezelfde tendens (Fig. 7a), ook piekend op 24 uur na behandeling met MWCNTs. Deze resultaten suggereerden dat MWCNT-geïnduceerde toename in NO-productie voornamelijk kan voortkomen uit verhoogde activiteit van NR. Consistent werd de inhibitie van NR-afhankelijke NO-productie door tungstaat bevestigd door gebruik te maken van de Griess-reagentmethode (Fig. 7b), LSCM en EPR (Additioneel bestand 1: Figuur S1).

Discussie

Fytotoxiciteit is een significante overweging in het begrijpen van de potentiële milieueffecten van nanodeeltjes [4, 7, 61,62,63]. Overvloedig bewijs onthulde dat MWCNTs giftig zijn voor planten, waaronder het induceren van oxidatieve schade, het remmen van zaadkieming, wortelgroei en -ontwikkeling [11, 63, 64]. Echter, als een fenotype van SIMR, is wortelvertakking door zijwortelvorming een belangrijk onderdeel van de aanpasbaarheid van het wortelstelsel aan diverse omgevingscues [17]. In dit werk integreerden we biologische, farmacologische en biochemische analyse om de betrokkenheid van NR-gemedieerde NO-productie in MWCNT-geïnduceerde ZW-vorming te tonen, ten minste deels in onze experimentele omstandigheden. Ook benadrukte de functie van NO in wortelorganogenese gestimuleerd door MWCNTs de centrale rollen van deze tweede bode betrokken bij plantontwikkelingsproces en aanpassing tegen stress [29,30,31,32,33, 37, 38].

Eerst bevestigden we dat 5 mg/mL MWCNTs (OD 6–12 nm) in wortelweefsels konden binnendringen (Fig. 3). Daarna werd de inductie van tomaten ZW-vorming waargenomen (Fig. 1), namaken de inductierollen van NAA en SNP (Fig. 4), een bekende NO-vrijmakende verbinding [30, 31]. Vergelijkbare induceerbare reacties werden ontdekt in harsbomen [41], sla [42] en Arabidopsis [43] wanneer uitgedaagd met MWCNTs (OD 6–13 nm, ongeveer 9,5 nm en 30–40 nm, respectievelijk). Bijvoorbeeld, de toepassing met ofwel pristiene MWCNT (p-MWCNT) of carboxyl-gefuntionaliseerde MWCNT (c-MWCNT) (gemiddelde diameter 9,5 nm) kon de ontwikkeling van ZW in sla-zaailingen bevorderen [42]. Integenstelling, de remming van primaire wortel en zelfs ZW-vorming werden gelijktijdig gevonden in sojaplanten wanneer onderworpen aan MWCNTs (OD 20–70 nm [40];). Door te vergelijken met de data in buitendiameter van MWCNTs (Tabel 1), stelden we voor dat MWCNT-geëxhibeerde effecten op ZW-vorming varieerden met hun diameters, met bevordering bij lagere diameter en remming bij hogere diameter. Zeker, gerelateerd mechanisme zou zorgvuldig onderzocht moeten worden. Vergelijkbaar fenomeen werd bevestigd in plantzout-tolerantie [50]. Gecombineerd met bovenstaande resultaten, werd verder afgeleid dat de functie van nanomaterialen kan variëren per soort, en vice versa, verschillende typen nanomaterialen kunnen diverse biologische effecten veroorzaken. Echter, andere invloedsfactoren, zoals verschillende dosissen van MWCNTs [48] en zelfs plantengroeiomstandigheden, konden niet gemakkelijk uitgesloten worden.

In vergelijking met andere nanomaterialen, waaronder SWCNT, grafeen en AC met een identieke concentratie, werden de maximaal inductie in ZW-vorming en zelfs toxische effecten op scheutgroei waargenomen in MWCNTs (Fig. 2). Deze kunnen gerelateerd zijn aan de speciale fysieke kenmerken van MWCNTs, een type nanomaterialen die hoge elektrische geleidbaarheid, groot specifiek oppervlak, hoge aspectratio en opmerkelijke thermische stabiliteit hebben [65]. De toxische effecten van nanomaterialen zijn breed gerapporteerd in komkommer, kool, wortel, ui etc. [66, 67].

Voldoende bewijs toonde aan dat NO, optredend als een signaleringsmolecuul, een breed scala aan plantprocessen kan reguleren van milieu-aanpassing tot ontwikkeling en de laatste omvat zaadkieming en wortelorganogenese [29, 68,69,70,71,72,73]. Ons vervolg-experiment onthulde dat NO betrokken kan zijn bij MWCNT-geïnduceerde ZW-vorming. Hoewel verschillende methoden voor imaging van NO-productie in plantcellen zijn toegepast, kunnen de nadelen, waaronder het gebrek aan gevoeligheid en de interferentie door NO-onafhankelijke moleculen, in elke methode bestaan [74]. Dus, drie methoden verantwoordelijk voor NO-imaging en bepaling, waaronder Griess-reagentmethode, LSCM en EPR, samen met de toepassing van cPTIO, een scavenger van NO, werden toegepast in onze experimentele omstandigheden. Door gebruik te maken van drie methoden observeerden we dat een toegenomen endogene NO-productie geïnduceerd door MWCNTs in tomatenzaailingen ongedaan gemaakt werd door cPTIO (Fig. 5), een scavenger van NO [30,31,32]. Belangrijk, dit proces was gecorreleerd met de biologische reactie van MWCNT-geïnduceerde ZW-ontwikkeling, die ernstig geblokkeerd werd toen cPTIO gelijktijdig toegepast werd (Fig. 4).

Vervolg-evaluatie van deze reacties en de potentiële bron(nen) van NO geïnduceerd door exogeen toegepaste MWCNTs onthulde dat NO-productie en daarna ZW-vorming toegeschreven konden worden aan NR-activiteit. In planten genereert NO-productie voornamelijk uit NR en mammalische NOS-achtig eiwit [28]. Echter, plant NOS-gen is nog steeds niet geïdentificeerd [35, 75, 76], hoewel sommige experimenten met inhibitoren van het mammalische NOS-enzym enig bewijs leverden van l-arginine-afhankelijk pad in NO-productie [36, 76]. NR is bevestigd als de belangrijkste bron van NO in planten [28]. Eerdere studies toonden aan dat NR-afhankelijke NO-productie fungeert als een nitraat-gerelateerd signaal betrokken bij de regulatie van wortelarchitectuur [32, 33]. Daarnaast was NR-afhankelijke NO-productie nauw geassocieerd met koude-acclimatisatie [38], zout-tolerantie [50] en abscisinezuur-geïnduceerde stomaatsluiting [77]. Onze resultaten onthulden verder dat tungstaat (een inhibitor van NR) duidelijk MWCNT-geïnduceerde ZW-vorming verstoorde, met name in ZW-lengte (Fig. 6). Integenstelling, was er slechts een lichte afname in ZW-lengte, en geen significant verschil waargenomen in ZW-aantal wanneer l-NAME (een inhibitor van mammalische NOS) werd gebruikt. Consistent toonde biochemische assay aan dat NR-activiteit duidelijk toegenomen was door MWCNTs (Fig. 7a), parallel aan de veranderingen in NO-productie (Fig. 5a). Bovenstaande reacties konden volledig geblokkeerd worden door tungstaat (Fig. 7a, Additioneel bestand 1: Figuur S1). We deduceerden dus dat de toegenomen endogene NO-productie geïnduceerd door MWCNTs voornamelijk toegeschreven kan worden aan het NR-pad. Zeker, verdere genetisch bewijs zou onderzocht moeten worden.

Conclusie

Samenvattend, leveren we bewijs dat MWCNT-geïnduceerde NO-productie via NR vereist kan zijn voor tomaten zijwortelvorming en dit werd samengevat in Fig. 8. Belangrijk, bovenstaande bevindingen bieden inzichten in het ingewikkelde moleculaire mechanisme van MWCNTs-functies in planten.