Hoog Biocompatibele Au-nanokooi@PEG Nanodeeltjes: Een Nieuw CT-Contrastmiddel voor Verbeterde In Vivo Imaging

Samenvatting

In de afgelopen jaren zijn contrastmiddelen breed toegepast in imagingtechnologie om de kwaliteit te verbeteren. Nanodeeltjes hebben een betere in vivo detectiemogelijkheid dan conventionele moleculaire contrastmiddelen. In deze studie werd een nieuw type Au-nanokooi@PEG nanodeeltjes (AuNC@PEGs) met een sterke röntgenabsorptiecoëfficiënt gesynthetiseerd als contrastmiddel voor computed tomography (CT) scan imaging. De resultaten lieten zien dat AuNC@PEGs een goede waterige dispersie, lage cytotoxiciteit en een sterke röntgenabsorptievermogen hadden. Verder lieten in vivo studies zien dat de gesynthetiseerde AuNC@PEGs een duidelijke contrastversterking, een lange circulatieperiode in het bloed en verwaarloosbare toxiciteit in vivo vertoonden. Daarom hebben de in deze studie gesynthetiseerde gefunctionaliseerde AuNC@PEGs een groot potentieel voor klinische toepassing in CT-scan imaging.

Inleiding

In de afgelopen jaren is de computed tomography (CT) scan de meest gebruikte diagnostische imagingtechniek in klinische omstandigheden, met een brede toepassing in de bestudering van diverse menselijke weefsels. Vanwege de sterke doorstraling, het hoge contrastvermogen en de relatief eenvoudige beeldverwerking, wordt de CT-scan beschouwd als de krachtigste niet-invasieve beeldvormende diagnostische techniek in het moderne medische systeem [1, 2]. Tijdens het imagiproces is er echter geen natuurlijk contrast tussen de laesie en sommige omringende structuren. Daarom moet een contrastmiddel, een stof met een relatief hogere of lagere dichtheid, worden gebruikt om de doeltekst of weefsels en organen te onderscheiden. Bovendien heeft deze stof variërende absorptiemogelijkheden in verschillende weefsels en kan worden waargenomen via röntgenbestraaling in zachte weefsels. Het gebruik van sommige moleculen en verschillende micropartikel-contrastmiddelen in CT-scan imaging is beoordeeld [3,4,5].

Op dit moment is het meest gebruikte contrastmiddel voor CT-scan een organisch molecuul dat jodium bevat. Gejodeerde moleculen, zoals jodide-ion of niet-ionische preparaten, worden breed gebruikt als contrastmiddel voor CT-scans in de klinische praktijk. Hoewel gejodeerde moleculen een goede CT-scan contrastversterking kunnen bieden, hebben ze een snelle nierclearance, een korte circulatieperiode in het lichaam en allergeen eigenschappen, wat de verdere toepassing aanzienlijk beperkt [6, 7]. Vanwege de snelle verwijdering van het jodiumcontrastmiddel is het effectieve tijdvenster voor bloedpoolimaging ernstig beperkt, en is een hoog-contrast beeld moeilijk te verkrijgen. Bovendien kan de snelle clearance van een hoge dosis medicijnen potentiële bijwerkingen in de nieren hebben [8, 9].

In het laatste decennium heeft de toepassing van nanodeeltjes in de biomedische wetenschappen, met name in diagnostische imaging, veel aandacht gekregen [10]. In vergelijking met jodiumgebaseerde contrastmiddelen hebben nanodeeltjes een lading van contrasteigenschappen die kleine moleculen niet bezitten, en ze hebben ook een specifieke grootte, vorm en oppervlak [11, 12]. Over het algemeen hebben nanodeeltjes met een hoog atoomnummer, zoals goud, zilver en andere metalen nanodeeltjes, een uitstekende röntgenabsorptiecoëfficiënt; dus hebben ze een opmerkelijk contrastversterkend vermogen [13, 14]. Onder deze nanodeeltjes zijn goudnanodeeltjes snel ontwikkeld op het gebied van de biomedische wetenschappen en worden ze beschouwd als vervanger voor jodiumgebaseerde imagingagentia vanwege hun significante biologische inertie en de gemakkelijkheid van synthese en oppervlaktemodificatie [15,16,17]. Goudnanodeeltjes hebben een langere bloedcirculatietijd, lager risico op nefrotoxiciteit en een sterkere röntgenabsorptiecoëfficiënt dan jodiumverbindingen. Daarom kan een lagere dosering worden aangeboden, en is het risico op bijwerkingen laag [18]. Verscheidene goudnanodeeltjes, waaronder nanosferen, nanostaven en nanosterren, zijn breed gebruikt als contrastmiddel voor CT-scan imaging [19, 20], met veelbelovende resultaten. Onder de verschillende goudnanostructuren hebben de Au-nanokoeien een hol interieur en dunne poreuze wand; dus hebben ze een groter oppervlak en een effectievere CT-scan imaging mogelijkheid dan andere goudnanodeeltjes met verschillende morfologieën [21, 22]. In de afgelopen jaren zijn Au-nanokoeien gebruikt als contrastversterker voor optische coherentietomografie en fotoakoestische tomografie en bleken ze goede prestaties te hebben. Tegelijkertijd, vanwege het grote absorptieoppervlak van de Au-nanokoeien, zijn ze ook effectieve fotothermale transducers [23, 24]. Voor zover we weten, hebben slechts een paar studies het gebruik van Au-nanokoeien als contrastmiddel voor CT-scan imaging beoordeeld. Gebaseerd op de bovengenoemde studies, hebben we het gebruik van Au-nanokoeien als CT-scan contrastmiddel verder onderzocht. De toepassing van nanodeeltjes in CT-scan imaging vereist oppervlakken met biocompatibiliteit en biologische activiteiten. Polyethyleenglycol (PEG) is een biologisch afbreekbaar en biocompatibel polymer, dat ook wordt gebruikt als stealth-materiaal om opname door het RES (reticulo-endotheliale systeem) te voorkomen en de biocompatibiliteit, nierscavenging-vermogen en bloedcirculatietijd te verbeteren; dus kunnen PEGylerde nanodeeltjes lang in het bloed worden behouden [15, 25,26,27,28].

In deze studie werden nieuwe AuNC@PEGs bereid en gekarakteriseerd. Vervolgens werd de in vitro biocompatibiliteit van AuNC@PEGs geëvalueerd door MTT-kleurmeting, lactaatdehydrogenase (LDH) lekkagemethode, intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) concentratiebepaling, Calcein-AM/PI kleuring en andere experimentele technieken. Daarnaast werden hematologische en histologische analyses uitgevoerd om de toxiciteit van AuNC@PEGs in vivo te bepalen. De resultaten lieten zien dat AuNC@PEGs een grote in vitro en in vivo biocompatibiliteit hadden. Bovendien bleken AuNC@PEGs een sterkere in vitro en in vivo CT-scan imaging mogelijkheid te hebben. Deze experimentele resultaten toonden aan dat de gesynthetiseerde AuNC@PEGs duidelijke voordelen hebben, zoals sterk contrast, lange bloedcirculatietijd en laag risico op nefrotoxiciteit. Daarom hebben de in deze studie gesynthetiseerde gefunctionaliseerde AuNC@PEGs een groot potentieel voor klinische toepassing in CT-scan imaging.

Methoden

Alle experimentele protocollen, inclusief relevante details, zijn goedgekeurd door de Regionale Ethische Commissie van de Jinzhou Medical University in de provincie Liaoning, China.

Materialen en Instrumenten

De LDH- en ROS-testkits zijn gekocht van het Nanjing Institute of Bioengineering, China, en de Calcein-AM/PI kleurkits van Shanghai Dongren Chemical Technology Co., Ltd., China. Andere chemische stoffen en oplosmiddelen zijn gekocht van Sigma-Aldrich. Alle coupes zijn beoordeeld met een fluorescentiemicroscoop (DMI4000B, Leica, Wetzlar, Duitsland). De karakteristieken van de gesynthetiseerde nanodeeltjes zijn geëvalueerd met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Een 256-rij, 512-slice spiraal CT-scan (Philips, Duitsland) werd gebruikt, en de imagingparameters waren als volgt: snijtdikte, 0,625 mm; buisspanning, 100 Kvp; en buistroom, 100 mA.

Synthese van AuNC@PEGs

Au-nanokoeien werden bereid met een eenvoudige galvanische vervangingsreactie tussen Ag-nanokubussen en HAuCl₄ oplossing, volgens een eerdere studie [29, 30]. Typisch werden 25-nm Ag-nanokubussen bereid in diethyleenglycol en gebruikt als sjablonen voor de synthese van 30-nm Au-nanokoeien. Vervolgens werd SH-PEG (MW ≈ 2000, 10 mg opgelost in 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)) toegevoegd aan de AuNC-oplossing (pH 8,0, 6,55 nM, 6 mL) en overnacht geroerd in het donker onder stikstofbescherming. Na het wassen van de AuNC@PEGs nog drie keer, werden ze gedispergeerd in waterige oplossing.

Evaluatie van In Vitro Toxiciteit

In deze studie werden MTT-kleurmeting, LDH-lekkagemethode, intracellulaire ROS-concentratiebepaling en Calcein-AM/PI-kleuring gebruikt om de toxiciteit van de gesynthetiseerde AuNC@PEGs in vitro te detecteren. De HUVEC-cellen werden geïnoculeerd in 96-gatenplaten met een dichtheid van 1 × 10⁴/put. Het RPMI-1640-medium aangevuld met 10% foetale kalvesserum en penicilline (100 μg/mL) en streptomycine werd gebruikt. Vervolgens werden de gecultureerd bij 37 °C en 5% kooldioxide in een incubator gedurende 12 uur. Daarna werd het medium met AuNC@PEGs in verschillende concentraties (10, 20, 50, 100, 200, 500 en 1000 μg/mL) toegevoegd voor verdere cultivering. Na 24 uur werd de MTT-test verkregen. Het cultuurmedium zonder nanodeeltjes werd gebruikt als controle in elke groep.

Vervolgens werd de hoeveelheid lactaatdehydrogenase (LDH) die vrijkwam uit HUVEC-cellen behandeld met AuNC@PEGs in verschillende concentraties bepaald om de toxiciteit in vitro te evalueren. De cellen werden geïnoculeerd op dezelfde manier als bij MTT en vervolgens behandeld met AuNC@PEGs in verschillende concentraties (10, 20, 50, 100, 200, 500 en 1000 μg/mL) gedurende 24 uur. Vervolgens werd het supernatans gescheiden, gecentrifugeerd en overgebracht naar een schone 96-gatenplaat. De activiteit van LDH in het cultuurmedium werd beoordeeld volgens de instructies van de fabrikant, en de absorbantie werd bepaald met een enzymlabelinstrument (450 nm).

Op basis van het principe van het meten van de intracellulaire ROS-concentratie met de ROS-kit, werd DCFH geoxideerd tot dichlorofluoresceïne (DCF), een sterk groen fluorescerende stof, in de aanwezigheid van 2',7'-dichlorofluoresceïne (DCFH-DA). De HUVEC-cellen werden gecultureerd in 24-gatenplaten gedurende 12 uur, behandeld met AuNC@PEGs in verschillende concentraties (50, 100, 200 en 500 μg/mL) gedurende 24 uur, en geïncubeerd met DCFH-DA bij 37 °C gedurende 40 minuten. De cellen behandeld met waterstofperoxide (H₂O₂) werden gebruikt als positieve controle. De fluoresentie-intensiteit van de cellen werd waargenomen met een fluorescentiemicroscoop (λex, 485 nm; λem, 525 nm). Voor de beoordeling werd een serum- en vriesvrij medium driemaal gebruikt voor wassen.

Voor levend/dood kleuring werden de HUVEC-cellen geïnoculeerd in 24-gatenplaten en 12 uur gecultureerd. Vervolgens werden de cellen behandeld met AuNC@PEGs in verschillende concentraties (10, 20, 50, 100, 200, 500 en 1000 μg/mL) gedurende 24 uur. Na verteering met trypsine-EDTA via centrifugatie, werden de cellen gewassen met PBS (pH = 7,4); vervolgens werd de bereide celsuspensie gemengd met het vooraf geconfigureerde Calcein-AM/PI reagent en gecultureerd bij 37 °C gedurende 15 minuten. Om de toxiciteit van AuNC@PEGs te detecteren, werd het aantal dode cellen beoordeeld via fluorescentiemicroscopie.

Diermodel

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de criteria van het Dierenbeschermings- en Gebruikscomité van de Jinzhou Medical University. Na het experiment werden de dieren gedood volgens humanitaire principes. In deze studie werden volwassen Sprague Dawley ratten van 250–300 g gebruikt (aangeschaft van het Dierencentrum van de Jinzhou Medical University). In dit experiment werden alle dieren willekeurig in groepen verdeeld. Chlooraalhydraatoplossing (10 gew%) werd via de buikholte toegediend; vervolgens werden alle materialen via de staartvliet geïnjecteerd.

In Vitro en In Vivo CT-scan Imaging

Voor in vitro CT-scan imaging werden AuNC@PEGs in verschillende concentraties en jodiumoplossingen in EP-buizen geplaatst en in de juiste volgorde gerangschikt, en werd een CT-scan uitgevoerd van voor naar achter. Bij de in vivo CT-scan werden de dieren na anesthesie van kop tot staart gescand, met het midden van de buikholte als oriëntatiepunt. De positie van de dieren veranderde niet elke keer. Alle oorspronkelijke data (0,625 mm beeld) werden overgedragen naar de Philips-workstation voor analyse via CT-scan.

Evaluatie van In Vivo Toxiciteit

Hematologische analyse werd uitgevoerd met de standaard bloedafname via de saphevene vene. De weefsels van het hart, lever, milt, long en nier van de ratten werden 48 uur gevormeld met 4% paraformaldehydd en na dehydratatie in paraffin inbed. De paraffincoupe was 5 μm dik en op een objectglas gemonteerd. Hematoxyline-eosine (H&E) kleuring werd vervolgens uitgevoerd, en analyse werd onder een microscoop gedaan.

Statistische Analyse

Data werden geanalyseerd met een eenvoudige variantieanalyse, en de P-waarde werd gebruikt als index. Een P-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd, uitgedrukt als het gemiddelde van SD.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisering van de AuNC@PEGs

Oppervlaktefunctionaliserings en groottecontrole zijn twee sleutelfactoren voor de ontwikkeling van hoogpresterende nano-contrastmiddelen [15]. De structuur en eigenschappen van AuNC@PEGs werden bepaald door TEM en DLS. Fig. 1a toonde de resultaten dat de grootte van AuNC@PEGs ongeveer 40 nm was met hoge uniformiteit; tegelijkertijd werd de hydratatiestraal van AuNC@PEGs ook gebruikt om de dispersie in de oplossing te testen, zoals getoond in Fig. 1b, de hydratatiestraal van AuNC@PEGs was ongeveer 50 nm, wat aantoont dat AuNC@PEGs zeer stabiel waren zonder enige aggregatie. AuNC@PEGs hebben een kleinere grootte en relatief goede biologische inertie, wat beter is voor nanomedische toepassingen. Bovendien wijst de holle kooi-structuur op grote interne en externe specifieke oppervlaktes en betere CT-scan imaging mogelijkheden, en de omringende metalen wanden boden extra bescherming voor lading tijdens verwerking, transport en opslag. Met zijn duidelijke kern-schelpstructuur, was de buitenkant bedekt met PEG van biologische toepasbaarheid, wat de biocompatibiliteit effectief kan verbeteren en macrofaagopname kan ontlopen.

Veiligheid en Stabiliteit van AuNC@PEGs In Vitro

Voordat AuNC@PEGs voor in vivo imaging werden gebruikt, evalueerden we hun veiligheid en stabiliteit. Het effect van AuNC@PEGs op de levensvatbaarheid van HUVEC-cellen werd gedetecteerd met de MTT-test (Fig. 2a). De cellen werden behandeld met AuNC@PEGs in verschillende concentraties (10, 20, 50, 100, 200, 500 en 1000 μg/mL) gedurende 24 uur. De resultaten van de MTT-test lieten zien dat de celoverlevingsgraad van de AuNC@PEGs vergelijkbaar was met die van de controlegroep en een gunstige biocompatibiliteit had wanneer de concentratie van AuNC@PEGs 200 μg/mL bereikte. De celoverlevingsgraad bij een concentratie van 1000 μg/mL was nog steeds > 75%.

Verder werd de LDH-test ook gebruikt om de biocompatibiliteit van AuNC@PEGs in vitro te evalueren. In normale cellen mag LDH niet door het celmembraan passeren. Wanneer het celmembraan beschadigd is, wordt LDH vrijgemaakt via het celmembraan [31]. Dus evalueerden we de veiligheid van AuNC@PEGs door de LDH-inhoud in het celsupernatans te meten (Fig. 2b) door cellen te behandelen met AuNC@PEGs in verschillende concentraties gedurende 24 uur. De resultaten lieten zien dat het LDH-niveau dat door de cellen vrijkwam, iets toegenomen was vergeleken met de onblootgestelde controlecellen wanneer de concentratie van de AuNC@PEGs < 200 μg/mL was, en significant lager was dan die van de positieve controlegroep (H₂O₂), wat consistent was met de resultaten van de MTT-test, en 200 μg/mL van AuNC@PEGs als optimale concentratie werd gevonden om een goede cytocompatibiliteit te hebben.

Daarnaast werden oxidatieve stresstesten en beoordeling van levende/dode cellen immunofluorescence-kleuring (Calcein-AM/PI) uitgevoerd om de toxiciteit van AuNC@PEGs in vitro te detecteren. Oxidatieve stress is een schadelijke toestand voor alle levende systemen, en overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen oxidatieve stress veroorzaken [32, 33]. Daarom maatten we het ROS-niveau in de cellen. Na 24 uur inductie door AuNC@PEGs in verschillende concentraties, verschilde de groene fluoresentie-intensiteit van de geïnduceerde cellen bij een concentratie van 50–200 μg/mL niet significant van die van de controlegroep, en was significant lager dan die van de positieve controlegroep (Fig. 2c). De fluoresentie-intensiteit was evenredig met het ROS-niveau. Zoals getoond in Fig. 3, was de overlevingsgraad van HUVEC-cellen bij een concentratie van 0–200 μg/mL > 90% (Fig. 3a–f). De bovengenoemde resultaten bevestigden dat AuNC@PEGs bij een concentratie van 200 μg/mL stabiel zijn en een goede celcompatibiliteit hebben, en ze kunnen veelbelovende klinische contrastmiddelen zijn.

In Vitro CT-scan Imaging en Bepaling van CT-waarde

Om de haalbaarheid van de AuNC@PEGs in CT-scan imaging te evalueren, vergeleken we de contrastversterkingen van verschillende molaire concentraties (AuNC@PEGs) met het klinisch gebruikte contrastmiddel (jodium). CT-scan beelden werden verkregen, en de CT-waarden werden gemeten. AuNC@PEGs werden vergeleken met jodiumimagingagentia op gelijkaardige concentraties (50, 100, 200, 500 en 1000 μg/mL). De resultaten lieten zien dat de CT-waarde toegenomen met de toename van de concentratie (Fig. 4a), en volgens de analyse van de CT-waarden van AuNC@PEGs en jodiumcontrastmiddel (Fig. 4b), was de absorptiecoëfficiënt van AuNC@PEGs beter dan die van jodiumgebaseerde contrastmiddelen op gelijkaardige concentraties, wat aangeeft dat het gebruik van AuNC@PEGs voor CT-scan imaging beter is.

In Vivo CT-scan Imaging

Vanwege het hoge contrastvermogen van AuNC@PEGs, vergeleken we de imagingkwaliteit van AuNC@PEGs met die van jodiumagentia in vivo. Tweehonderd microliter AuNC@PEGs (200 μg/mL) werden via de staartvliet van de ratten geïnjecteerd. De tijd van bloedpoolangiografie in AuNC@PEGs werd geëvalueerd via pre-injectie (0 min) en post-injectie continue tijdpunt scanning (10, 20, 30, 40, 60 en 90 min). Vervolgens werden de ratten in de controlegroep geïnjecteerd met jodiumcontrastmedium in een passende concentratie. De injectiedosering en scantijd waren vergelijkbaar met die van AuNC@PEGs. Na de injectie van een contrastmiddel observeerden we gelijktijdig de contrastversterkingen van de nier (Fig. 5) en de vulling van de blaas (SI Fig. 1). De resultaten lieten zien dat de nier in de AuNC@PEGs groep de piek bereikte na 30 min en volledig uitgeplast werd na 90 min en die in de jodiumgebaseerde contrastmiddel groep de piek bereikte na 20 min en volledig uitgeplast werd na 60 min. Vervolgens observeerden we dat de blaas geleidelijk gevuld werd met contrastmiddel in de loop van de tijd. Deze bevinding toonde aan dat de tijd van bloedpoolangiografie van AuNC@PEGs beter was dan die van het jodiumgebaseerde contrastmiddel. De langere bloedcirculatietijd van AuNC@PEGs kan een betere diagnose bieden, en het AuNC@PEG heeft een betere ontwikkelingsperspectief.

Veiligheid van AuNC@PEGs In Vivo

Zoals getoond in Fig. 6a, werden de standaardparameters van routinematig bloed en lever- en nierfunctieanalyses weerspiegeld door hemoglobinegehalte, gemiddelde corpusculaire hemoglobineconcentratie, gemiddeld corpusculair volume, trombocytaantal, rode bloedcellaantal, witte bloedcellaantal, albumineconcentratie, alaninetransaminasegehalte, aspartaattransaminasegehalte en creatininagehalte. In de statistische analyse werd geen significant verschil waargenomen tussen de AuNC@PEG, jodiumcontrastmiddel en controlegroepen (P > 0,05). Daarnaast werden de organen (het hart, lever, milt, long en nier) van de ratten histologisch geanalyseerd, zoals getoond in Fig. 6b, 24 uur na de injectie van AuNC@PEGs (200 μg/mL); gesneden en gekleurd (H&E). In vergelijking met de controlegroep (niet geïnjecteerd met nanomaterialen), werden geen duidelijke morfologische veranderingen en letsels gevonden zoals getoond onder de microscoop. De bovengenoemde resultaten bevestigden verder de veiligheid en betrouwbaarheid van AuNC@PEGs in vivo.

Conclusie

We hebben AuNC@PEG ontwikkeld, een nieuw type CT-scan contrastmiddel, met kenmerken zoals kleine grootte, hoog contrast, lange bloedretentietijd en laag toxiciteitsrisico. In vitro en in vivo toxiciteitsevaluaties lieten zien dat AuNC@PEGs een goede biocompatibiliteit en laag risico op bijwerkingen hadden. De imagingprestaties van CT-scan in vitro en in vivo lieten zien dat AuNC@PEGs een hogere röntgenabsorptiecoëfficiënt en langere bloedpoolangiografietijd hebben dan traditionele jodiumgebaseerde imagingagentia. Bovendien zijn AuNC@PEGs superieur aan jodiumgebaseerde imagingagentia, en het gebruik van AuNC@PEGs is praktisch. Al deze resultaten lieten zien dat AuNC@PEGs een hogere röntgenabsorptiecoëfficiënt hebben dan traditionele jodiumgebaseerde contrastmiddelen en dat de imagingprestaties van AuNC@PEGs hoger waren dan die van traditionele jodiumgebaseerde contrastmiddelen. Daarom hebben de in deze studie gesynthetiseerde gefunctionaliseerde AuNC@PEGs een groot potentieel voor klinische toepassing in CT-scan imaging.