Biologisch Afbreekbare, Tumor-responsieve Nanodeeltjes voor Dubbele-modus Borstkanker Imaging

Samenvatting

Gasgevulde ultrasoon (US) contrastmiddellen kollapsen gemakkelijk in het lichaam, en het gas kan gemakkelijk overflowen, wat de effectiviteit van US-imaging beperkt. Om dit probleem aan te pakken, is een injecteerbaar gas-genererend multi-mode systeem ontwikkeld dat de MR-negatieve contrastmiddel Fe₃O₄, de fluorescerende kleurstof Cy5.5 en de CO₂-vrijgevende donor (Na₂CO₃) draagt. De nanodeeltjes kunnen continu koolstofdioxide (CO₂) gas genereren in zuur tumorweefsel in het lichaam, wat de tumor een sterk echo-signaal geeft onder ultrasone imaging. Daarnaast leveren de nanodeeltjes uitstekende effecten voor MR- en fluorescentie-imaging van het tumorweefsel. De resultaten geven aan dat dit pH-responsieve NP-systeem goede effecten biedt in MR/US/fluorescentie-imaging. Deze studie biedt een nuttige referentie voor multi-modale tumorimaging.

Inleiding

In de klinische praktijk worden microbellen primair toegepast als ultrasooncontrastmiddelen voor de realtime imaging van diverse organen en bloedvaten. Traditionele ultrasooncontrastmiddelen bestaan typisch uit materialen zoals lipiden of eiwitten die lucht of perfluorkoolstofgassen omhullen. De gassoorten ingesloten in de microsferen hebben lage stabiliteit in het bloed en een korte halfwaardelevenstijd vanwege de snelle diffusie van microbeldefecten. Bovendien, omdat de deeltjesgrootte van de gasgevulde microbellen meestal groot is (ongeveer 1 tot 8 μm), is het moeilijk voor de microbellen om in de gastheer tumoromgeving te penetreren door weefsextravasatie. Daarom is de huidige toepassing van micron-grote bellen in intravasculaire imaging beperkt. Ideale ultrasooncontrastmiddelen zouden over het algemeen een optimale grootte voor transport door de weefselvatruimte, een adequate duur van akoestisch effect, goede targeting en bio-compatibiliteit, en gemakkelijke excretie uit het lichaam moeten vertonen. Het concept van "gas-genererende nanodeeltjes" werd in eerdere onderzoeken voorgesteld, en dergelijke nanodeeltjes hebben potentieel voor gebruik in ultrasooncontrastimaging. Deze gas-genererende nanodeeltjes zijn superieur aan de huidige gasgevulde microbellen in prestaties, en het continu gegenereerde gas stelt intense ultrasone imaging mogelijk. Gas-genererende nanodeeltjes kunnen permeatie en retentie verbeteren, en ze kunnen stabiel in het bloed circuleren en effectief accumuleren in het tumorweefsel.

Het blijft een uitdaging om kleine en occulte tumoren te detecteren met traditionele imagingmethoden, zoals magnetische resonantie imaging (MRI), gecomputeriseerde tomografie (CT) en ultrasone, die beperkt zijn door lange acquisitietijden, hoge stralingsdosis en slechte gevoeligheid. Het is noodzakelijk om verschillende imagingmethoden te integreren en multi-modale imagingtechnologie te ontwikkelen geïntegreerde synergie voor de vroege detectie van kanker te bereiken. Superparamagnetische ijzeroxide (Fe₃O₄) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt als negatieve MRI-contrastmiddelen in T2-gewogen imaging. Fe₃O₄ heeft aantrekkelijke algemene eigenschappen, waaronder kleine deeltjesgrootte, sterke penetratie, hoge magnetisatie, goede metabolisme en relatief lage toxiciteit. Fe₃O₄ contrastmiddelen voor de MRI-diagnose van vroege-stadia kanker zijn uitgebreid bestudeerd vanwege hun hoge relaxatie en contrast. Bovendien heeft realtime fluorescentie-imaging een uitstekende resolutie en kan een waardevolle methode zijn voor het definiëren van tumorstadiering, het leiden van tumorresectie en het monitoren van behandelingseffecten.

Hierin worden deze nanodeeltjes hoofdzakelijk geencapsuleerd door poly(lactide-co-glycolide)zuur (PLGA), wat goedgekeurd is door de Food and Drug Administration (FDA) voor gebruik als een veilig biomateriaal. De PLGA-deeltjes worden gemodificeerd met RGD-peptide om binding aan αvβ3-integrine op het oppervlak van borstkankercellen mogelijk te maken en met Cy5.5 als fluorescerende kleurstof voor in vivo imaging, en ze worden geencapsuleerd met Fe₃O₄ om te fungeren als T2-negatief contrastmiddel in MRI (Schema 1a). Vanwege de opgereguleerde glycolyse in tumorweefsel, wat meer melkzuur en protonen in de extracellulaire omgeving kan produceren, is de pH van tumorweefsels (6,8–7,2) lager dan die van normale weefsels (pH 7,4). Daarom ontwierpen we natriumcarbonaat (Na₂CO₃) in de PLGA om CO₂-bellen te produceren bij de lagere pH van tumorweefsels voor ultrasone imaging. Om hun veelbelovende toepassing in tumorimaging te verifiëren, werden de uitgebreide eigenschappen van deze multi-modale nanodeeltjes voor in vitro imaging systematisch gekarakteriseerd, inclusief hun cytotoxiciteit, targetingspecificiteit en biodistributie in tumorweefsel, door drie imagingmodi.

Biologisch Afbreekbare, Tumor-responsieve Nanodeeltjes voor Dubbele-modus Borstkanker Imaging

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisatie van Na₂CO₃/Fe₃O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP's

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's zijn ontworpen als RGD-getargete multi-mode contrastmiddelen door een biocompatibel polymere PLGA te encapsuleren met Fe₃O₄ en Na₂CO₃ en een integrine-gerichte agent via een biologische afbreekbare chemische binding (Schema 1b).

Transmissie elektronenmicroscopie-afbeeldingen toonden aan dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's heldere spheren waren met uniform verdeelde ijzeroxide-deeltjes zichtbaar in de schil (Fig. 1a). De gemiddelde hydrodynamische grootte van de NP's werd gemeten als 117,6 nm door dynamische lichtverstrooiing, en de gemiddelde polydispersiteitsindex was 0,234 (Fig. 1b). De oppervlaktelading van de NP's werd bevestigd door zeta-potentiaalmetingen te zijn -21,7 mV (Fig. 1c). Fluorescentiespectrume meting onthulde dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD de maximale emissiegolflengte had bij 685 nm, wat aangeeft dat Cy5.5 succesvol in de PLGA-kern geencapsuleerd was (Fig. 1d). De verzadigingsmagnetisatiewaarden voor Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD en vrije Fe₃O₄ NP's waren respectievelijk 32,6 en 42,5 emu/g (Fig. 1e). Deze bevindingen gaven de superparamagnetische karakteristiek van de nanodeeltjes bij kamertemperatuur aan. Het FTIR-spectrum van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD toonde aan dat N-H-rekkingsvinging en –OH-absorptiepiek verschenen rond 3432 cm⁻¹. Daarnaast vonden we een versterking (1628 cm⁻¹) van de C=O-rekkingsvinging. Vergeleken met die van de niet-gerichte NP's, was de karakteristieke piek (de carboxyl) bij 1735 cm⁻¹ van de gerichte NP's aanzienlijk verminderd. De resultaten toonden de binding tussen de carboxylgroep op het microsfeeroppervlak en de aminogroep op RGD-peptide. In vitro binding van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's wordt getoond in Fig. 1f.

In vitro Binding van Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD NP's

αvβ3-integrine is doorgaans hoog geëxprimeerd op borstkankertumor-endotheelcellen en kan tumor-metastase bevorderen. Cellulaire immunofluorescentie voor de expressie van αv-integrine in MDA-MB-231-cellen was veel hoger dan die in MCF-7-cellen; A549-cellen dienden als positieve controles (Fig. 2a). De cellulaire opname van NP's werd bestudeerd met CLSM (Fig. 2b). De Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's toonden een veel hogere bindingsratio aan MD-MB-231-cellen dan niet-gerichte NP's. De fluorescentie-afbeeldingen onthulden ook dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's gebonden waren aan het celcytoplasma, en samengevoegde afbeeldingen toonden dezelfde locaties als de expressie van αv-integrine.

Cytotoxiciteitsassay

De in vitro cytotoxiciteit van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's werd geschat in MDA-MB-231-cellen met behulp van een CCK8-assay, terwijl A549 en MCF-7-cellen behandeld met NP's als controles diensteden (Fig. 2c). In het bereik van Fe-concentraties van 5–80 μg/mL werd de cellevensvatbaarheid van A549 en MB231-cellen niet significant verminderd, en beide waren boven de 70%. In tegenstelling, toonden MCF-7-cellen een significante afname in cellevensvatbaarheid tot ongeveer 50% bij Fe-concentraties hoger dan 40 μg/mL. De CCK8-resultaten toonden aan dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's significant lagere cytotoxiciteit vertoonden in MDA-MB-231-cellen over een gegeven concentratiebereik.

In vitro Contrast Imaging

We gebruikten een agar-gel phantom om de prestaties van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's in vitro te bestuderen bij verschillende pH-waarden (Fig. 3a). De ultrasone contrastafbeeldingen van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's waren significant verbeterd bij zwak zuur pH (pH 6,8) vergeleken met pH 7,2, waarschijnlijk omdat pH 7,2 niet voldoende CO₂-bellen produceert voor ultrasone imaging. In tegenstelling, toen de NP's in een zwak zure omgeving waren, konden voldoende bellen worden gegenereerd voor ultrasone imaging. Deze karakteristiek is relevant voor tumoren, die hoge weefselheterogeniteit en diverse pH-niveaus (pH 6,8–7,2) in vivo vertonen. De signaalintensiteit van de ultrasone afbeelding werd vervolgens geanalyseerd (Fig. 3b). De signaalintensiteitsverhoudingen van de niet-gerichte NP (pH = 7), niet-gerichte NP (pH = 5), gerichte NP (pH = 7) en gerichte NP (pH = 5) groepen relatief tot de signaalintensiteit van de blanco groep waren 112%, 145%, 167% en 178 ± 4%, respectievelijk, wat duidelijk aangeeft dat de gerichte NP-groep (pH = 5) de sterkste US-signaal had.

Voor de MRI-studie in vitro, naarmate de concentratie Fe in de Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's toenem, toonde de T2-gewogen signaalintensiteit een significante afname, wat de mogelijkheid van deze NP's voor gebruik als T2 MR-contrastmiddelen aangeeft (Fig. 3c). De transversale relaxatiesnelheid (r2) van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's werd berekend als 19,597 mM⁻¹ s⁻¹. Hoewel de transversale relaxatiesnelheid (r2) van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's lager is dan die van veel andere MRI-superparamagnetische agenten, kan de samenstelling van Fe₃O₄ de r2 verhogen, wat 2,94 keer hoger was dan de r2 van SPIO-deeltjes die klinisch gebruikt worden.

Ultrasone Contrast Imaging van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's

Om het potentieel van de Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's voor ultrasone imaging in tumoren te demonstreren, gaven we een staartvijininjectie van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's aan borstkanker-xenograft naakte muizen en monitorerden de ultrasone afbeeldingen als functie van tijd (Fig. 4a). Voor injectie werden afbeeldingen van de tumor, lever en subcutane gebied vastgelegd. Onmiddellijk na injectie toonde het gebied van de tumorweefsels geen contrastversterking. Versterking van het tumorgebied werd waargenomen vanaf 30 minuten na injectie en duurde 90 minuten. De in vivo ultrasone resultaten toonden aan dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's voldoende bellen in zure tumorweefsels genereerden om echogene reflectiviteit voor ultrasone imaging te produceren. Als controle hebben we ook afbeeldingen verkregen van de lever en subcutane weefsels op verschillende tijden na injectie van de gerichte NP's. Gedurende de observatieperiode werd geen significante versterking gevonden in het subcutane injectiegebied, en de versterking in de lever, die afnam over tijd, was significant lager dan die in de tumoren (Fig. 4b). Dit resultaat geeft aan dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's die in het lichaam circuleren bij fysiologische pH geen substantiële hoeveelheid CO₂-bellen produceren voor ultrasone contrastversterking.

MRI van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's

Voor in vivo MRI, om te demonstreren dat NP's gebruikt kunnen worden voor tumor-specifieke imaging, werden Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's direct in tumoren en spieren geïnjecteerd. De resultaten toonden aan dat het tumorgebied een significante afname in T2-MR-contrast vertoonde na injectie van de gerichte NP's, en de signaalintensiteit daalde significant van 8875 op 0 min naar 5972 op 120 min na injectie (Fig. 5a, b). Echter, met dezelfde hoeveelheid nanodeeltjes geïnjecteerd, toonde het subcutane spiergebied een veel lagere T2-signaaldaling. Deze bevinding demonstreert de effectiviteit van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's met hypersensitieve integrine-gerichte T2-MR-contrastmiddelen voor gebruik in tumor-gerichte imaging. In de staartvijin-injectiegroep toonde T2-MR-imaging ook een duidelijke contrastafname in de tumor op 24 uur post-injectie, wat de hoge tumoraccumulatie van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's aantoont (Fig. 5c, d). Bovendien werden verminderde T2-signalen waargenomen in de lever en nieren, wat aangeeft dat de ijzerionen in de NP's snel uit het lichaam kunnen worden gecleared. Daarom onthulde MRI dat de PLGA-omhulle Fe₃O₄ nanodeeltjes efficiënte passive tumor targeting vertoonden via het verhoogde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR), met name RGD-gemedieerde targeting, maar konden worden afgebroken en snel in vivo geëxcreteerd.

Fluorescentie-imaging en Histologie

Tweehonderd microliter NP's werden intraveneus in muizen geïnjecteerd voor in vivo fluorescentie-imaging. In de geïnjecteerde groep met RGD-gerichte NP's nam het fluorescentiesignaal van Cy5.5 in het tumorgebied geleidelijk toe en bereikte een piek op 4 uur na injectie, wat aangeeft dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's effectief in de tumor kunnen accumuleren. In de niet-gerichte groep werden NP's na injectie door het hele lichaam verdeeld en snel gecleared, en ze accumuleerden niet gedurende een lange periode in de tumor (Fig. 6a). De muizen werden vervolgens gedissecteerd, en de hooforganen en tumoren werden verzameld voor in vitro fluorescentie-imaging, wat een hoge tumoropname van de gerichte NP's onthulde (Fig. 6b, c). De fluorescentie-intensiteit van Cy5.5 in de tumoren van muizen geïnjecteerd met gerichte NP's was 1,5 keer die in muizen geïnjecteerd met niet-gerichte NP's.

Verder werd tumor-specifieke targeting van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's geverifieerd door weefsel-fluorescentie-imaging van bevroren tumorsecties (Fig. 7a). Immunofluorescentiekleuring van tumorsecties met antilichamen tegen αv- en β3-integrine onthulde significante expressie van αvβ3-integrine in tumorweefsels. De fluorescentie van αv- en β3-integrine werd samengevoegd met de Cy5.5-fluorescentie van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's om een immunekleuringsafbeelding te verkrijgen die colocalisatie onthulde. De immunofluorescentieresultaten in de tumorweefsels gaven aan dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's specifiek binden aan αvβ3-integrine in MB231 maligne borstkanker. Bovendien toonde H&E-kleuring van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's vergeleken met de niet-gerichte groep aan dat alle orgaanweefselsneden normale pathologische morfologie hadden en geen histopathologische schaderespons (Fig. 7b). Alle resultaten van de bovengenoemde cytotoxiciteit en histologische analyse gaven aan dat Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's geen significante toxiciteit induceerden aan hoofdoorgaanweefsels in vivo, en hun goede bio-compatibiliteit kan redelijkerwijs worden toegeschreven aan PLGA.

Conclusies

Concluderend, de bovenstaande resultaten demonstreren een creatieve en succesvolle benadering voor MRI van borstkanker door een magnetische targeting en een gas-genererend systeem dat geactiveerd wordt in de tumormicro-omgeving. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's vertonen uitstekende imagingprestaties en goede bio-compatibiliteit in MR/ultrasone/fluorescentie-imagingmodi. Ons werk toont het sterke potentieel voor tumordiagnose met verbeterde multi-modale imaging.

Materialen en Methodes

Materialen

Poly(lactide-co-glycolide)zuur (PLGA) (lactide:glycolide = 75:25, Mw = 20.000), Cyanine5.5 kleurstof en polyvinylalcohol (PVA) werden gekocht bij Sigma-Aldrich Company (Shanghai, China). Het RGD-peptide was op maat gesynthetiseerd door GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, China). Fe₃O₄ nanodeeltjes en natriumcarbonaat (Na₂CO₃) werden aangeschaft bij Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, China). Dichloormethaan (CH₂Cl₂) en dimethylsulfoxide (DMSO) werden verkregen van Solarbio Company (Peking, China). Alle chemicaliën waren van analytische graad.

Synthese van Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD Nanodeeltjes

Eerst werden 12,5 mg PLGA en 0,25 ml chloroforme samen gemengd. Vervolgens werden 5 μl Cy5.5, 15 μl olyzuur-gemodificeerde magnetische nanodeeltjes gedispergeerd in chloroforme (OA@Fe₃O₄, 10 mg/ml), 5 μl natriumcarbonaat (Na₂CO₃) en 1,5 ml 1% PVA-oplossing in volgorde toegevoegd en geëmulsificeerd met een ultrasoon processor gedurende 2 min. Daarna werd 12,5 ml 0,3% PVA-oplossing toegevoegd en 3-4 uur gerold bij kamertemperatuur, en 12,5 ml 0,4% PVA-oplossing werd toegevoegd voor roeren (500 rpm/min) overnachten om residuele organische oplosmiddelen te verwijderen. De bovengenoemde oplossing werd verscheidene keren ultrafiltratie-gewassen met ddH₂O en vervolgens gedilueerd met PB-buffer (pH = 7,4) tot een eindvolume van 1,25 ml. Vervolgens werden 0,25 mg EDC en 1,25 mg NHS toegevoegd aan de bovengenoemde gemengde oplossing. Het mengsel werd 30 minuten gerold bij 25 °C en vervolgens driemaal gewassen met ultrafiltratie en heropgelost in PB-bufferoplossing (pH = 7,4). Vervolgens werd 1,25 mg cRGD toegevoegd aan de oplossing en 4 °C overnachten gerold. Om EDC, NHS en eventuele residuele cRGD te verwijderen, werd de transparante oplossing gefiltreerd door een ultrafiltratiebuis. Ten slotte werden Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NP's heropgelost in 1,25 ml gedemineraliseerd water en opgeslagen bij 4 °C.

Nanodeeltjes Karakterisatie

De dynamische diameters en zeta-potentiaal van nanodeeltjes werden gemeten met een Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, VK). De morfologie van de nanodeeltjes werd verkregen met behulp van een FEI Tecnai F20 transmissie elektronenmicroscoop. De Cy5.5-lading werd vastgelegd met een Hitachi F-7000 fluorescentiespectrometer. FTIR werd uitgevoerd met een Fourier-transformatie infraroodspectrometer (Alpha II, Bruker, Zwitserland). Een trillende monster magnetometer (VSM, Lake Shore 7410) werd toegepast om de hysterese-kromme van de nanodeeltjes en vrije Fe₃O₄ te bepalen.

Cellen en Dieren

Humane borstkanker MDA-MB-231-cellen werden vriendelijk geleverd door de Stamcelbank, Chinese Academie van Wetenschappen. Cellen werden onderhouden bij 37 °C in 95% lucht en 5% CO₂. Vrouwelijke BALB/c-muizen (4 weken) werden aangeschaft bij Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. en onderhouden volgens protocollen goedgekeurd door het Guangxi Medical University Laboratory Animal Center. Dierproeven werden gevolgd met de Richtlijn voor Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren, uitgegeven door het Dierenethiekcomité van Laboratoriumdierencentrum, Guangxi Medical University. MDA-MB-231 borstkankercellen werden getransplanteerd in de rechterflank van BALB/c-muizen (2 × 10⁶ in 200 μl cellen per muis) en toegestaan te groeien gedurende 10–14 dagen (gemiddelde diameter 5 mm) voor imaging.

Cellulaire Expressie van αv-integrine

Cellulaire immunofluorescentie werd uitgevoerd om de hoge expressie van αv-integrine in MDA-MB-231-cellen te bevestigen. A549 en MCF-7-cellen werden als controles gebruikt. Cellen werden gezaaid op 35 mm glasbodem cultuurschoteltjes (MatTek, VS) bij 2 × 10⁴ cellen ml⁻¹ gedurende 24 uur. Na incubatie werden cellen 20 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Vervolgens werden ze geïncubeerd met konijnen monoklonale anti-integrine αv-antistoof (ab179475, Abcam) bij 4 °C overnachten en anti-konijn IgG-antistoof gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Ten slotte werden de cellen gekleurd met DAPI. Afbeeldingen werden verkregen door confocale laserscanningmicroscopie (TCS SP8, Leica, Duitsland).

Om de targeting-efficiëntie van de nanodeeltjes te beoordelen, werd een cellulaire opnamestudie uitgevoerd met behulp van confocale laserscanningmicroscopie (CLSM). Cellen werden gezaaid op 35 mm glasbodem cultuurschoteltjes (MatTek, VS) bij 2 × 10⁴ cellen ml⁻¹ gedurende 24 uur. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met RGD-gerichte NP's (30 μg ml⁻¹, 0,5 ml) bij pH 7,4 gedurende 2 uur, en niet-gerichte NP's werden als controles gebruikt. Na incubatie werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten en vervolgens geïncubeerd met αv-antistoof. Middels colocalisatie verifieerden we de gerichte binding van de nanodeeltjes aan de integrine op de cellen.

CCK8 Assay

De bio-compatibiliteit van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD nanodeeltjes werd geëvalueerd door een cytotoxiciteitsstudie. MDA-MB-231, A549 en MCF-7-cellen werden gezaaid op 96-puttenplaten bij 5 × 10³ cellen ml⁻¹ gedurende 24 uur. Vervolgens werd 0,1 ml van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP-suspensie bij Fe-concentraties van 5, 10, 20, 40 en 80 μg/ml aan elke put toegevoegd en 24 uur geïncubeerd. Ten slotte werd 10 μl CCK8-oplossing toegevoegd en de suspensie nog 1 uur geïncubeerd. De resultaten werden bepaald door een microplaatlezer (Thermo Scientific, VS) bij 450 nm.

Contrast-versterkte Ultrasone Imaging

Ultrasone imaging van nanodeeltjes werd uitgevoerd met behulp van een Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canada) ultrasone systeem. De RGD-gerichte en niet-gerichte NP's werden aan het agarose-model toegevoegd, en PBS werd als controle gebruikt. Afbeeldingen werden vastgelegd in B-modus en CEUS-modus met verschillende pH-buffers van 7,2 en 6,8. Het belangrijkheidsgebied werd getekend en de gemiddelde grijswaarde werd gemeten in B-modus afbeeldingen.

Voor in vivo ultrasone imaging, werden muizen geanesthetiseerd met 2% isofluraan (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China), en de lichaamstemperatuur werd gehandhaafd bij 37 °C met een verwarmde kussen. Totaal 200 μl RGD-gerichte NP's werd via de staartvijin geïnjecteerd. Controledieren ontvingen een subcutane injectie met dezelfde hoeveelheid NP's. Ultrasonische afbeeldingen werden vastgelegd met een 7-MHz transducer om continu ultrasone afbeeldingen van de tumoren, levers en subcutane gebieden te verkrijgen. De akoestische focuszone werd geplaatst in het centrum van de tumor met de grootste doorsnede, en een zichtveld met de tumor en haar angrenzende weefsel werd verkregen.

Magnetische Resonantie Imaging

MRI-onderzoeken van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's werden uitgevoerd met een 3,0 T MR (GE Healthcare, VS) en een dierenspoel (RF TECH LIMITED, China). NP's met verschillende Fe-concentraties van 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 mM werden gescand in 1 ml Eppendorf-buisjes, en PBS werd als controle gebruikt. T2 MRI werd uitgevoerd voor elke buis met een T2-gewogen FSE-sequentie (snededikte 3 mm, TR/TE 2000/74,4 ms, 8 × 8 cm FOV en 320 × 256 matrix). De relaxiviteiten (r2) werden berekend door een lineaire fitting van de inverse relaxatietijd als functie van de Fe-concentratie.

Voor in vivo MRI, werden muizen willekeurig verdeeld in twee groepen (n = 3) voor MR-scanning die ofwel (1) locale injectie van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's binnen subcutane spier- en tumorweefsels of (2) staartvijin-injectie van Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP's ontvingen. Baseline-afbeeldingen van de muizen werden gemaakt vóór injectie van de nanodeeltjes. Voor groep een werd dezelfde hoeveelheid NP's geïnjecteerd in de subcutane en tumorweefsels, en MRI-scanning werd elke 30 min uitgevoerd om de signaalovergang van de weefsels te registreren. Voor groep twee werd tumorimaging uitgevoerd in de axiale en coronale posities, en de MR-parameters waren dezelfde als die gebruikt voor in vitro imaging. De signaalintensiteit (SI) in het gebied van interesse (ROI) werd gemeten en vergeleken met weefselsignalen op verschillende tijden vóór en na injectie.

Tumor Fluorescentie-imaging

Voor fluorescentie-imaging in vivo, werd een in vivo fluorescentie-imaging systeem (FX PRO, Bruker, Zwitserland) gebruikt voor scanning, en de muizen werden willekeurig verdeeld in twee groepen (n = 3): (1) RGD-gerichte NP's en (2) niet-gerichte NP's. Afbeeldingen werden elke 30 min vastgelegd voor een periode van 4 uur na de injectie. Vervolgens werden belangrijke organen en tumoren geoogst en geïmageerd, en de distributie van fluorescentie in de organen van het lichaam werd waargenomen. Kwantitatieve analyse van fluorescentie-intensiteit werd uitgevoerd met moleculaire imagingsoftware (Bruker, Zwitserland). Deze belangrijke organen ondergingen vervolgens H&E-kleuring om de weefseltoxiciteit te evalueren. Bevroren tumorsecties werden ook onderworpen aan fluorescentie-immunokleuring met antilichamen tegen αv-integrine en β3-integrine.