Protoporfyrine IX-geladen laminarine-nanodeeltjes voor de behandeling van kanker, hun cellulaire gedrag, ROS-detectie en dierstudies

Resultaten en discussie

Karakterisering van HLDM-materialen

¹ H-NMR-spectra voor de HLDM-materialen werden getoond in eerdere rapporten [51]. De methylpiek voor MGK werd waargenomen bij ongeveer A:0,8 (Fig. 2h). ¹ H-NMR-spectra onthulden een absorptiepiek bij ongeveer δ:2,8 (Fig. 2g), wat CH₂ was in 3,3-dithiodipropionzuur. Het verschijnen van de signaalpiek bij δ:6.5 (Fig. 2j) verifieerde de aanwezigheid van hematine. De karakteristieke piek voor laminarine in amfifiele polymeermaterialen werd gevonden in het gebied tussen 3 en 4 ppm, wat aangeeft dat het nieuwe product van HLDM met succes was gesynthetiseerd.

De ¹ H-NMR-spectra van HLDM

IR-spectra voor HLDM

IR-spectra van HLDM-materialen werden getoond in eerdere rapporten [51]. De dubbele piek op de foto getuigde van de aansluiting van de MCK. Bovendien werd de gekarakteriseerde piek van de estercarbonylgroep waargenomen in IR-spectra.

UV-zichtbare absorptiespectra van HLDM

In figuur 3a had hematine een ultraviolette absorptiegolflengte (ongeveer 580 nm) en in figuur 3b had laminarin-dithiodipropionzuur-MGK geen absorptie in dezelfde positie. De UV-zichtbare absorptiespectra werden tot stand gebracht om de link van hematine op basis hiervan te verifiëren. De uitkomst gaf aan dat de gekarakteriseerde absorptiegolflengte in 580 nm werd waargenomen in HLDM-materialen (figuur 3c). Hematine was succesvol verbonden met HLDM-materialen.

UV-zichtbare absorptiespectra van hematine (a ), Laminarin-S-S-MGK (b ), en HLDM (c )

Karakterisering van met Pp IX geladen micellen

De grootte en zeta-potentiaal van met Pp IX geladen HLDM-micellen worden getoond in Fig. 4a, b. Er werd aangetoond dat de micellen beter waren opgenomen door de kankercellen, om de efficiëntie te verhogen en bijwerkingen te verminderen (verbeterde permeabiliteit en retentie-effect, EPR). De micellen werden met het blote oog gezien na Millipore-membraanfilter in Fig. 4c. Op basis hiervan werd het beeld van met Pp IX geladen HLDM-micellen gescand met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) zoals weergegeven in figuur 4d. De morfologie bestond uit niet-uniforme deeltjes, wat kwam omdat de tijd voor echografie ontoereikend was. Aan de andere kant werd de agglomeratie van deeltjes waargenomen op de foto, waarschijnlijk vanwege de hogere concentratie (Fig. 5).

een , b De grootte en het zeta-potentieel van met Pp IX geladen HLDM-micellen. c De met Pp IX geladen HLDM-micellen in water. d Het TEM-beeld van met Pp IX geladen HLDM-micellen

Opname van vrije Pp IX, Pp IX-geladen LH en Pp IX-geladen HLDM-micellen in CT-26 (links) en A549 (rechts)

De beknellingsefficiëntie (EE) en de inhoud van de geneesmiddelbelading (DL) werden berekend met de formule (tabel 1). Na vele experimenten werd ontdekt dat de fluctuatie van EE en DL onstabiel was, omdat we hadden gespeculeerd dat de met Pp IX geladen HLDM-micellen zouden kunnen aggregeren in een waterige oplossing.

Cellulaire opname

In deze studie werd de fluorescentie van Pp IX gedetecteerd om de tijd- en concentratieafhankelijkheid te onderzoeken. Zoals te zien is in het diagram, werden de met Pp IX geladen HLDM-micellen geabsorbeerd in MCF-7-cellen en hun fluorescentie-intensiteit nam toe met de tijd en concentratie. Door de drie micellen in Fig. 6a te vergelijken, hadden de kankercellen die Pp IX-geladen HLDM-micellen kregen, meer fluorescentie. Dit kwam omdat pH/redox-resten waren gekoppeld aan de materialen om te reageren op de micro-omgeving van de tumor. De kankercellen die gratis Pp IX kregen, hadden een zwakkere fluorescentie vanwege de aggregatie in DMEM.

een Opname van vrije Pp IX, Pp IX-geladen LH en Pp IX-geladen HLDM-micellen. b Cellocatie van met Pp IX geladen HLDM-micellen

Uit wat hierboven is besproken, kunnen we veilig de conclusie trekken dat HLDM-materialen, inclusief pH- en reductiegevoelige groepen, de agglomeratie van Pp IX kunnen verbeteren en hun absorptie en afgifte in tumorcellen kunnen verbeteren.

Onderzoek naar cellocatie

Zoals getoond in Fig. 6b, werd de kern gekleurd door fluorescerende kleurstof en toen konden we het fenomeen rode fluorescentie zien dat buiten de blauwe fluorescentie werd gepresenteerd. We hadden gespeculeerd dat de celopname gerelateerd zou kunnen zijn aan cytoplasma, dus deze hypothese werd geverifieerd door de vorige studie dat Pp IX was geaccumuleerd en gelokaliseerd in de mitochondriën en cytoplasma van tumorcellen [54].

Meting van de vorming van reactieve zuurstofsoorten

Zoals getoond in Fig. 7, werd de reactieve zuurstofsoort (ROS) in MCF-7-cellen gevolgd door DCFH-DA als indicator te gebruiken, waarvan was waargenomen dat deze groene fluorescentie had in fluorescentiemicroscopie. Met Pp IX geladen HLDM-micellen hadden een sterkere intensiteit van groene fluorescentie onder het licht, terwijl vrije Pp IX nauwelijks fluorescentie had. We hadden gespeculeerd dat vrij Pp IX zou kunnen agglomereren om een ​​zelfdovend effect in DMEM te veroorzaken. De groene fluorescentie van drie groepen was verwaarloosbaar zonder licht (zoals de controlegroep). Deze resultaten bevestigden dat Pp IX zuurstof zou kunnen stimuleren om ROS te genereren als een fotosensibilisator onder de conditie van licht.

Generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) onder lichte omstandigheden

Fototoxiciteit en levensvatbaarheidstest

Celcytotoxiciteit en levensvatbaarheidstest werden uitgevoerd met de MCF-7-kankercellen van de menselijke borst onder twee verschillende externe omgevingen, met behulp van de MTT-test. Zoals getoond in Fig. 8a, was het significante verschil in celbeschadiging verwaarloosbaar in alle monsters onder duisternis. Toen de Pp IX-concentratie werd verhoogd tot 50 g / ml, bleef de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen die we detecteerden op een hoog niveau. Het fenomeen toonde aan dat de cytotoxiciteit voor cellen of organen niet significant werd verhoogd met een verhoogde concentratie van Pp IX.

een Levensvatbaarheid van MCF-7-cellen van vrije Pp IX, Pp IX-geladen LH-micellen of Pp IX-geladen HLDM-micellen onder lichte omstandigheden. b Relatieve lichttoxiciteit van vrije Pp IX, Pp IX-geladen LH-micellen of Pp IX-geladen HLDM-micellen na bestraling. n =3; * geeft P < . aan 0,05

Zoals afgebeeld in Fig. 8b, 5 μg/ml Pp IX had een significant verschil in groepen met vrije geneesmiddelen en micellen. De cytotoxiciteit voor cellen of organen was significant verhoogd in de micellengroep, aangezien de concentratie van Pp IX onder het licht toenam, terwijl de vrije Pp IX-groepen weinig verandering vertoonden tot een concentratie van 10 μg/ml. Deze gegevens toonden aan dat de fototoxische efficiëntie van met Pp IX geladen micellen duidelijk hoger was dan die van vrij Pp IX. Nogmaals, het experiment toonde aan dat vrije fotosensitizer zich zou kunnen ophopen om een ​​zelfdovend effect te veroorzaken. Daarom kunnen we concluderen dat de met Pp IX geladen HLDM-micellen een enorm potentieel hebben voor het doden van kankercellen met lichte bestraling.

Nucleaire morfologische observatie

In cellocatiestudie ontdekten we onbewust dat de gekleurde kern witte vlekken vertoonde, en de hogere concentratie van Pp IX was duidelijker bij dit fenomeen. Misschien kwam dit door DNA-schade in de kern. Zoals getoond in Fig. 8, zouden 20 μg/ml Pp IX-geladen HLDM-micellen DNA-schade kunnen veroorzaken in vergelijking met de overeenkomstige controle in MCF-7. Wanneer de concentratie 50 g/ml bereikt, zou de schade ernstig zijn in kankercellen. De nucleaire morfologische observatiestudie suggereerde dat DNA-schade een vroege marker was voor de dood van MCF-7-cellen die werd geïnduceerd door Pp IX [26] (Fig. 9).

DNA-schade van MCF-7-cellen na Pp IX-behandeling

In vivo evaluatie van werkzaamheid en veiligheid

Zoals getoond in Fig. 10a, b, werd de tumorgroei van vijf groepen gemeten om de werkzaamheid in vivo te evalueren. De met zoutoplossing behandelde groep vertoonde een continue groei met een relatief hoge snelheid. Er was geen significant verschil tussen de groepen behandeld met vrije Pp IX en Pp IX-geladen HLDM-micellen en de zoutoplossinggroep. Deze gegevens gaven aan dat het tumorvolume zonder bestraling minder werd beïnvloed door Pp IX. Ondertussen produceerde de groep die werd behandeld met vrij Pp IX plus licht een kleine verandering in tumorvolume. Wat dit fenomeen veroorzaakte, was dat het vrije medicijn in vivo onstabiel was en dus gemakkelijk in het bloed te verzamelen was. Daarom kan het zijn geëlimineerd voordat het in het tumorweefsel kwam. Daarentegen werd de tumorgroei behandeld met Pp IX-geladen HLDM-micellen significant geremd in Fig. 10a. Dit fenomeen bewees dat de micellen een significant antitumoreffect vertoonden na het geven van een bepaalde golflengte van licht om te stimuleren. Samenvattend toonde dit experiment aan dat de antitumoreffecten van met Pp IX geladen HLDM-micellen duidelijk waren verbeterd onder de lichtomstandigheden.

In vivo antitumoractiviteit en veiligheidsevaluatie. een Tumorvolume verandert in de loop van de behandelingstijden. b Tumorvolume van vijf groepen:(a ) normale zoutoplossing, (b ) vrij Pp IX (5 mg/kg), (c ) Pp IX-geladen HLDM-micellen (5 mg/kg vrije Pp IX-equivalenten), (d ) vrije Pp IX (5 mg/kg) plus bestraling met licht, en (e ) Pp IX-geladen HLDM-micellen (5 mg/kg vrije Pp IX-equivalenten) plus bestraling met licht. c De lichaamsverandering van tumordragende naakte muizen

Aan de andere kant werd het relatieve lichaamsgewicht gemeten om de veiligheid van met Pp IX geladen HLDM-micellen te evalueren (Fig. 10c). Er was geen duidelijk gewichtsverlies en verwaarloosbare veranderingen in alle groepen, wat wijst op de goede biologische veiligheid van deze behandelingen voor de muizen.

Verder vertoonde het histopathologische glaasje een duidelijk nucleair polymorfisme in de zoutoplossinggroep in Fig. 11. De pathologische veranderingen in het tumorweefsel gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) hadden een significant verschil in vijf groepen. De resultaten toonden een lichte nucleaire condensatie in de met Pp IX beladen HLDM-micellen en vrije Pp IX-groepen. De tumorweefsels van de groep met Pp IX-geladen HLDM-micellen (plus licht) vertoonden een duidelijke nucleaire schade. Daarom concludeerden we dat deze resultaten consistent waren met de bovenstaande resultaten voor in vivo evaluatie van de werkzaamheid en veiligheid.

H&E tumorkleuring met verschillende formuleringen. Alle gegevens worden gerapporteerd als een gemiddelde ± SD. n =3; * geeft P < . aan 0,05

Tot op heden is er een verscheidenheid aan materialen bestudeerd voor medicijnafgifte [55]. In de vorige studie hebben we met succes dubbele pH / redox-gevoelige [56] mariene polysaccharide laminarine-conjugaten gesynthetiseerd, en in dit onderzoek werden de conjugaten gebruikt als afgiftesysteem voor Pp IX, om antitumoreffecten te bereiken. In vivo experimenten toonden aan dat met Pp IX geladen HLDM-micellen Pp IX effectief in kankercellen konden afleveren en ROS-gemedieerde directe dodelijke effecten op kankercellen konden genereren. De cytotoxiciteitsexperimenten toonden aan dat de micellen een lichte cytotoxiciteit hadden zonder bestraling met licht, terwijl oplossingen van micellen met een lage concentratie een merkbare invloed hadden op de levensvatbaarheid van de cellen binnen een bepaalde belichting. Op dierniveau oefenden met Pp IX geladen HLDM-micellen een fototoxisch effect uit om een ​​relevant antitumoreffect te produceren. Daarom werden de activiteiten van met Pp IX geladen HLDM-micellen overtuigend gecertificeerd in vitro en in vivo.