Laminarine-gebaseerde nanodeeltjes leveren protoporfyrine IX voor verbeterde fotodynamische therapie: cellulaire opname, ROS-generatie en in vivo effectiviteit

Samenvatting

Amfifiele micellen afgeleid van laminarine-conjugaten (HLDM) werden ontworpen om de hydrofobe fotosensitizer protoporfyrine IX (Pp IX) te encapsuleren voor borstkanker-fotodynamische therapie (PDT). De resulterende micellen, ~149 nm in diameter, vertoonden dubbele pH- en redox-responsieve vrijgave, wat de wateroplosbaarheid en biocompatibiliteit verbeterde. In vitro studies met MCF-7 cellen onthulden efficiënte cellulaire opname, licht-geïnduceerde reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie en apoptose gemarkeerd door kernschade. In een naakt-muis-xenograftmodel produceerden Pp IX-geladen HLDM-micellen gecombineerd met 630 nm bestraling een duidelijke tumorgroei-inhibitie zonder observeerbare systemische toxiciteit. Deze bevindingen tonen aan dat een laminarine-gebaseerd nanoplatform de Pp IX-afgifte en PDT-effectiviteit aanzienlijk kan verbeteren in vitro en in vivo.

Inleiding

Fotodynamische therapie (PDT) gebruikt een fotosensitizer, licht en moleculaire zuurstof om ROS te produceren die selectief tumorcellen doden terwijl gezond weefde wordt gespaard. Het is uitgegroeid tot een minimaal invasieve optie voor diverse maligniteiten—waaronder borst-, lever-, long-, melanoma- en huidkanker—maar de klinische adoptie is beperkt door de beperkte tumoraccumulator van conventionele fotosensitizers.

Protoporfyrine IX (Pp IX) is een krachtige maar hydrofobe fotosensitizer die vaak aggregeert in aqueuze media, wat het therapeutische venster verkleint. Maritieme polysacchariden laminarine, bekend om zijn biocompatibiliteit en intrinsieke antitumoractiviteit, biedt een hydrofiele schil die hydrofobe geneesmiddelen kan stabiliseren en tumor-targetende eigenschappen kan verlenen door pH- en redox-responsiviteit.

We rapporteren de synthese van een dubbele pH/redox-responsief hematine-lamine-dithiodipropionzuur-MGK (HLDM) micelsysteem dat Pp IX encapsuleert, met als doel de oplosbaarheid te verbeteren, de tumoraccumulator te vergroten en de ROS-gemedieerde cytotoxiciteit te maximaliseren.

Methoden

Materialen

Laminarine (Sigma-Aldrich), DMSO, L-glutathion, Hoechst 33342, DMEM, FBS, ROS-assaykit (Beyotime), H&E-reagentia, Pp IX (Aladdin) en alle overige reagenties waren van analytische graad. Humane borstkankercellen MCF-7 werden verkregen van de Yantai Universiteit, en vrouwelijke naakte muizen (14–18 g) afkomstig van Beijing Vital River.

Synthese en karakterisatie van HLDM

HLDM werd gesynthetiseerd via opeenvolgende acylatie van dithiodipropionzuur met MGK, gevolgd door EDC/DMAP-gemedieerde esterificatie met laminarine. Het product werd geverifieerd door ¹H-NMR, IR en UV-vis spectroscopie.

Bereiding van Pp IX-geladen HLDM-micellen

HLDM en Pp IX werden samen opgelost in organisch oplosmiddel, daarna gedialyseerd tegen gedemineraliseerd water (MWCO 2000 Da) onder roeren (600 toer/min). Micellen werden bij kamertemperatuur verzameld.

Karakterisatie

Deeltjesgrootte en zetapotentiaal werden gemeten met een Beckman Coulter analyzer; morfologie werd onderzocht met TEM (Hitachi H-600). Encapsulatie-efficiëntie (EE) en geneesmiddellading (DL) werden berekend uit UV-vis absorbantie bij 630 nm.

Celkweek en opnamestudies

MCF-7 cellen werden gekweekt in DMEM/FBS. Voor opname werden cellen geïncubeerd met vrij Pp IX, LH-micellen of HLDM-micellen (20 µg mL⁻¹) gedurende 1–4 uur. Fluorescentie werd waargenomen door omgekeerde microscopie (Nikon Eclipse E400).

Subcellulaire localisatie

Na 4 uur incubatie werden cellen gefixeerd, tegengekleurd met Hoechst 33342 en gebeeld om de Pp IX-distributie te bepalen.

ROS-detectie

MCF-7 cellen werden behandeld met formuleringen (20 µg mL⁻¹) gedurende 2 uur, bestraald met 630 nm gedurende 30 min, daarna geïncubeerd met DCFH-DA (10 µmol L⁻¹). Fluorescentie (ex 488 nm, em 525 nm) gaf ROS-productie aan.

Fototoxiciteit en levensvatbaarheidsassay

Cellen werden gezaaid in 96-gatenplaten, blootgesteld aan variërende concentraties (1–10 µg mL⁻¹) van elke formulering, bestraald (630 nm, 30 min) en 24 uur geïncubeerd. MTT (5 mg mL⁻¹) werd toegevoegd en absorbantie bij 490 nm gemeten om levensvatbaarheid te berekenen.

Kernmorfologie

Na 4 uur behandeling werden cellen gefixeerd, gekleurd met kernverf en gebeeld om chromatine-condensatie te beoordelen.

In vivo effectiviteit en veiligheid

MCF-7 cellen (1,5 × 10⁶) werden subcutaan geïnjecteerd in naakte muizen. Zodra tumoren 70–100 mm³ bereikten, kregen muizen een van vijf behandelingen: fysiologische zoutoplossing, vrij Pp IX (5 mg kg⁻¹), HLDM-micellen (5 mg kg⁻¹ Pp IX-equivalenten), vrij Pp IX + 630 nm licht, of HLDM-micellen + 630 nm licht. Tumorvolume en lichaamsgewicht werden om de dag gemonitord; muizen werden op dag 20 geëuthanaseerd voor histologie (H&E).

Statistische analyse

Data worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3). Verschillen werden beoordeeld met eenrichtingsvariantieanalyse, met *P < 0,05 als significant.

Resultaten en discussie

HLDM-karakterisatie

¹H-NMR bevestigde de succesvolle conjugatie van MGK, dithiodipropionzuur, hematine en laminarine, met karakteristieke pieken bij δ 0,8, 2,8, 6,5 en 3–4 ppm. IR-spectra toonden de verwachte ester-carbonylband, en UV-vis toonde een duidelijke 580 nm absorptie overeenkomend met hematine in HLDM.

Miceleigenschappen

Dynamische lichtverstrooiing onthulde een gemiddelde diameter van 149,3 ± 35 nm en een nabij-neutraal zetapotentieel. TEM-beelden bevestigden sferische morfologie met incidentele aggregatie bij hogere concentraties. EE en DL waren respectievelijk 68 % en 12 %, wat efficiënte lading aangeeft.

Cellulaire opname

Fluorescentie-imaging toonde tijd- en dosis-afhankelijke accumulatie van Pp IX in MCF-7 cellen, met HLDM-micellen die aanzienlijk hogere opname vertoonden dan vrij Pp IX of LH-micellen. De verbeterde opname wordt toegeschreven aan het pH/redox-gevoelige vrijgavemechanisme.

Subcellulaire distributie

Co-localisatiestudies onthulden voornamelijk cytoplasmatische en mitochondriale accumulatie van Pp IX afgeleverd door HLDM-micellen, consistent met de bekende organel-targetering van Pp IX.

ROS-generatie

DCFH-DA-fluorescentie was significant hoger in cellen behandeld met HLDM-micellen plus licht vergeleken met vrij Pp IX, wat robuuste ROS-productie alleen onder illuminatie bevestigt.

Fototoxiciteit

Onder lichtbestraaling bereikten HLDM-micellen >80 % celdood bij 5 µg mL⁻¹, terwijl vrij Pp IX >10 µg mL⁻¹ vereiste voor vergelijkbaar effect. In het donker vertoonden alle formuleringen minimale cytotoxiciteit.

Kernmorfologie

Pp IX-geladen HLDM-micellen induceerden dosis-afhankelijke chromatine-condensatie en kernfragmentatie, indicatief voor apoptose.

In vivo effectiviteit

Alleen de HLDM-micelgroep die 630 nm licht ontving, toonde significante tumorgroei-inhibitie (≈ 70 % reductie op dag 20). Vrij Pp IX met licht produceerde matige suppressie, terwijl fysiologische zoutoplossing en niet-bestraalde groepen doorgroeiden. Lichaamsgewicht bleef stabiel in alle groepen, en H&E-kleuring onthulde uitgebreide necrose in de HLDM + licht cohort.

Conclusies

We hebben een laminarine-gebaseerde, dubbele pH/redox-responsieve micel ontworpen die Pp IX efficiënt encapsuleert, de oplosbaarheid verbetert en tumor-specifieke vrijgave vergemakkelijkt. Het systeem levert krachtige ROS-gemedieerde fototoxiciteit in vitro en bereikt duidelijke antitumoractiviteit in vivo zonder systemische toxiciteit. Deze resultaten positioneren HLDM-micellen als een veelbelovend platform voor toekomstige fotodynamische therapie van borst- en andere solide tumoren.