Mitochondria-gerichte TiS₂ nanosheets leveren resveratrol voor fotothermisch-getriggerde tumor-chemotherapie

Samenvatting

Een subcellulaire orgaan-gerichte afgifte van anti-kanker medicijnen is een veelbelovende strategie om de anti-kanker effecten te maximaliseren en de bijwerkingen te minimaliseren. Hier bereiden we een mitochondria-gerichte medicijn-afgifte nanoplatform voor gebaseerd op IR780 iodide (IR780) en titaniumdisulfide (TiS₂) nanosheets. Vanwege de grote specifieke oppervlakte van TiS₂ nanosheets, kan het nanoplatform hoog anti-kanker medicijn resveratrol (RV) laden. Het geproduceerde nanocomposiet (IR780-TiS₂/RV) werd gebruikt voor een effectieve fotothermisch-getriggerde tumor-chemotherapie. IR780-TiS₂/RV toonde bevredigende stabiliteit en biocompatibiliteit, en de ladingsverhouding van RV en IR780 was respectievelijk ongeveer 112% en 56%. Bij bestraling met nabij-infrarood (NIR) kon de gegenereerde warmte door IR780-TiS₂/RV de RV-afgifte triggeren. Vanwege de conjugatie met de mitochondria-specifieke IR780, kon IR780-TiS₂/RV mitochondria targeten en accumuleren en RV vrijgeven wanneer getriggerd door NIR om het mitochondriale membraanpotentieel te verlagen, snel de opregulatie van cruciale intrinsieke apoptotische factoren zoals cytochroom c te induceren, en de caspase-cascade te initiëren, waardoor het chemotherapeutische effect bereikt wordt. Het IR780-TiS₂/RV nanocomposiet werd gedemonstreerd om een hoge anti-tumor effectiviteit in vitro en in vivo te hebben alsook geen opvallende weefseltoxiciteit. We geloven dat onze studie aantoont dat het NIR-getriggerde IR780-TiS₂/RV nanoplatform een veelbelovend chemotherapeutisch middel kan zijn in de klinische praktijk.

Inleiding

Kanker blijft een levensbedreigende ziekte en staat verantwoordelijk voor hoge sterftes wereldwijd. Chirurgie, chemotherapie, bestraling en hormoontherapie zijn nog steeds de belangrijkste therapeutische methoden in de klinische praktijk. Van deze methoden is chemotherapie een breed geaccepteerde behandeloptie door clinici en patiënten vanwege de relatief hoge effectiviteit. Chemotherapie is geassocieerd met sommige ernstige problemen, zoals medicijnresistentie, tumorrecidief en non-specificiteit. Het ontwikkelen van nieuwe chemotherapeutische middelen en strategieën om deze obstakels te overwinnen is dus van grote urgentie. In de laatste jaren is het laden van een anti-kanker medicijn op een gefunctionaliseerde drager die gelijktijdig een gerichte afgifte en gecontroleerde vrijgave van het medicijn kan bereiken, een populaire benadering geworden om het therapeutische effect te maximaliseren en de bijwerkingen te verminderen. Een groot specifiek oppervlak dat een betere ladingverhouding kan bieden, is essentieel voor een uitstekende medicijndrager.

Daarnaast, om de specificiteit van het medicijn te verbeteren, wordt de drager meestal gemodificeerd met een cel-targeterend molecuul, zoals foliumzuur en glutathion gerichte celoppervlakte-receptoren. Aangezien veel chemotherapeutische medicijnen op specifieke subcellulaire organellen werken, kan het ontwerpen van een orgaan-specifiek afgifte-systeem het therapeutische effect aanzienlijk vergroten en de nadelige effecten verminderen. Daardoor is de selectie van de getargeteerde locatie binnen de tumorcellen vitaal voor het medicijn-afgifte-systeem. Mitochondria zijn niet alleen een "energiefabriek" van cellen, maar ook een sleuteldoel van chemotherapeutische medicijnen die de mitochondria targeten om de intrinsieke apoptotische pathway te initieren. Het ontwikkelen van een mitochondria-targeterende anti-kanker medicijn-afgifte-systeem kan dus vitaal zijn voor effectievere kanker-chemotherapie. Tot nu toe zijn diverse soorten medicijn-afgifte-systemen ontworpen, zoals mesoporös silica, koolstof-gebaseerde materialen en eiwitten. Hoewel deze dragers gerapporteerd zijn als efficiënt voor medicijnafgifte en tumortherapie, zijn nog steeds meer nieuwe hoge-efficiënte medicijnafgifte-systemen zeer gewenst.

In deze studie construeren we een mitochondria-targeterende en NIR-getriggerde medicijnafgifte-nanoplatform gebaseerd op tweedimensionaal titaniumdisulfide (TiS₂) nanosheets voor gecontroleerde en gerichte tumor-chemotherapie. TiS₂ is een lid van overgangsmetaal-dichalcogeniden, die een groot specifiek oppervlak hebben. Na exfoliatie door eiwit-geassisteerde ultrasonificatie, is het oppervlak van TiS₂ nanosheets modificeerbaar door andere functionele moleculen via covalente of non-covalente interacties. Bovendien werd het tumor-mitochondria-specifieke molecuul IR780 (IR-780 iodide) gekozen om de TiS₂ nanosheets te modificeren. IR780 voorziet de nanosheets van mitochondria-targeterende capaciteit, wat door zowel organisch-anion-transporterende polypeptide-gemedieerde actieve transport als het lipofiele kation-kenmerk. Het werd gerapporteerd dat IR780 als lipofiele kation, meer accumulatie in de mitochondria van tumorcellen toonde vanwege de hoge grootte van het mitochondriale membraanpotentieel in tumorcellen dan in normale cellen. Daarnaast is IR780 ook een nabij-infrarood responsieve fotothermische agent. Het geproduceerde nanoplatform, genaamd IR780-TiS₂, werd bevestigd als biocompatibel en kon het anti-kanker medicijn resveratrol (RV) effectief laden (IR780-TiS₂/RV). Het IR780-TiS₂/RV bezat een mitochondria-targeterende capaciteit en een fotothermisch effect. NIR werd toegepast als externe stimulus om de locale medicijnvrijgave te triggeren bij NIR-bestraaling. In vitro en in vivo experimenten toonden aan dat IR780-TiS₂/RV een hoge chemotherapie-effectiviteit heeft. Verdere mechanistische studies onthulden dat de celdood geïnduceerd door IR780-TiS₂/RV via de mitochondria-gemedieerde intrinsieke apoptose-pathway verliep. Dit mitochondria-gerichte medicijnafgifte-systeem (Schema 1) kan een potentiële chemotherapeutische agent zijn in toekomstige klinische toepassing.

Het voorbereidingsschema van IR780-TiS₂/RV, gebruikt als NIR-getriggerd medicijnafgifte-systeem voor tumor-chemotherapie gemedieerd door intrinsieke apoptose-pathway

Materialen en methoden

Materialen

Sigma-Aldrich leverde IR-780 iodide (IR780), TiS₂ poeder, fluoresceïne-isothiocyanate (FITC) (St. Louis, MO, VS). Bovine serumalbumine (BSA ≥ 98,0%) werd aangeschaft bij BioSharp Co., Ltd. (Korea). Cel-tel-kit-8 (CCK-8) werd verkregen van Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japan). Celkweekreagentia inclusief DMEM-medium en foetaal kalverseerum (FBS) werden geleverd door Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS). Chemicaliën werden verkregen van Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Synthese van IR780-TiS₂/RV

De eerste stap was de bereiding van water-oplosbare TiS₂ nanosheets volgens eerdere rapportage. In detail werd 5 mg bulk TiS₂ gemengd met 5 mL water en 20 min geroerd. De TiS₂-water-suspensie werd vervolgens toegevoegd aan 5 mg BSA en verwerkt onder ijsbad-ultrasoon-dissociatie met een 500 W en 20 kHz tip-sonificatie (Sonics, VCX130, VS) gedurende 6 uur. Daarna werd het bereide mengsel gecentrifugeerd bij 12.000 tpm gedurende 10 min, wat resulteerde in TiS₂ nanosheets in het supernatans.

Tweedens werden TiS₂ nanosheets geconjugeerd met IR780. Triethylamine (TEA) werd toegepast als zuur-bindend agent. Vijf milligram IR780 werd opgelost in 2 mL DMSO en 8 uur geroerd bij 60 °C met toevoeging van TEA. De mengselsuspensie werd 2 dagen gedialyseerd in gedemineraliseerd water en daarna gecentrifugeerd bij 9000 tpm gedurende 8 min om het geaggregeerde product te verwijderen. Het supernatans werd verzameld, wat resulteerde in IR780-TiS₂.

Ten slotte werd RV geladen op IR780-TiS₂. IR780-TiS₂ (1 mg/ml) werd gemengd met RV (2 mg/ml, opgelost in DMSO), wat licht werd geroerd over nacht bij kamertemperatuur. Daarna werden DMSO en vrije RV geëlimineerd via dialyse in gedemineraliseerd water over nacht om IR780-TiS₂/RV te geven. Gebaseerd op literatuur werd de RV-ladingsverhouding gedetecteerd door een UV-vis-spectrofotometer (UV-2550, Shimadzu, Japan) en berekend volgens de volgende vergelijking:

$$ \mathrm{RV}\ \mathrm{ladingsverhouding}\ \left(\%\right)=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

waarbij A_a (mg), A_b (mg), en A_c (mg) de initiële, ongebonden RV en de IR780-TiS₂ respectievelijk vertegenwoordigen.

Bruker TENSOR 27 Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FTIR) spectrometer (Bruker Optics Ltd., Coventry, UK) werd gebruikt om de chemische structuur van TiS₂, IR780-TiS₂ en R780-TiS₂/RV te detecteren. Brunauer-Emmett-Teller (BET) analyse werd uitgevoerd om het specifieke oppervlak van de monsters te bepalen, berekend uit N₂-adsorptieresultaat via een oppervlakte-analyzer (Quantachrome ChemBET-3000) gebaseerd op de BET-vergelijking.

Cellijn en celkweek

De muis darmkankercellen CT26 werden verkregen van de Chinese Academy of Sciences Celbank van Type Culture Collectie (Shanghai, China). De cellen werden gekweekt in complete DMEM-media (10% FBS + 90% DMEM) in een vochtige incubator met 5% CO₂ bij 37 °C.

In vitro localisatie van IR780-TiS₂/RV

FITC werd gebruikt om IR780-TiS₂/RV of TiS₂/RV te labelen. Kortom, FITC werd opgelost in ethanol-oplossing (2,0 mg/mL) en gemengd met IR780-TiS₂/RV of TiS₂/RV waterige oplossing (1,0 mg/mL) onder een 4-uurs roeren in donkere omgeving bij kamertemperatuur. Het mengsel werd over nacht gedialyseerd in gedemineraliseerd water om redundante FITC en ethanol te verwijderen, wat resulteerde in FITC-gelabelde IR780-TiS₂/RV of TiS₂/RV-oplossing. Om de mitochondriale co-localisatie van nanopartikelen in vitro te bevestigen, werden cellen behandeld met FITC-gelabelde IR780-TiS₂/RV of TiS₂/RV gedurende 5 uur en gekleurd met mitochondria-specifieke kleurstof MitoTracker. Daarna werd de cellulaire internalisatie van IR780-TiS₂/RV of TiS₂/RV waargenomen met een CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). Kortom, CT26-cellen werden geïncueerd met FITC-gelabelde TiS₂/RV en IR780-TiS₂/RV (met dezelfde concentratie FITC) gedurende 5 uur. Vervolgens werden de cellen behandeld met MitoTracker Red FM-oplossingen (100 nM) bij 37 °C gedurende 30 min. Na wassen met PBS drie keer, werden de cellen waargenomen door een CLSM. ImageJ-software werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van cellen te analyseren.

In vitro NIR-getriggerde tumor-chemotherapie en apoptose-studie

4 × 10³ cellen/put CT26-cellen in 96-put kweekplaten werden behandeld met vrije RV, IR780-TiS₂, IR780-TiS₂/RV en TiS₂/RV met verschillende RV-concentraties gedurende 5 uur en daarna bestraald met of zonder NIR gedurende 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²). Na verdere 24-uurs incubatie werd de levensvatbaarheid van behandelde cellen geanalyseerd door CCK-8-assay. De behandelde cellen werden ook gekleurd met Rhodamine123 (Sigma) en geanalyseerd door FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, VS). Celdetectie van apoptose werd ook uitgevoerd door FCM-analyse met Annexin V-FITC/PI apoptose-detectie-kit (Bender MedSystems, Wenen, Oostenrijk) zoals eerder beschreven.

Western Blot

CT26-cellen werden behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, en IR780-TiS₂/RV + NIR (equivalent RV, 30 μg/mL; equivalent IR780, 0,5 μg/mL) gedurende een 5-uurs incubatie. Na verdere 24-uurs incubatie werden de cellen respectievelijk verzameld voor Western blot, gebaseerd op het eerder gerapporteerde protocol. Kortom, de cellen werden gelyseerd en geïnhibeerd door een protease en Triton X-100. Natrium-dodecylsulfaat-polyacrylamidgelektroforese werd gebruikt om eiwitten te herstellen en te scheiden, die vervolgens werden overgebracht naar een PVDF-membraan en geblokkeerd met 5% vetvrije melk. Daarna werden de verdunde primaire antilichamen geïncueerd bij 4 °C gedurende 12 uur, inclusief cytochroom c (1/1000, Boster, Wuhan, China), gekleefde caspase-3 (1/1000, CST), gekleefde caspase-9 (1/1000, CST) en actine (1/1000, Muis, Boster, Wuhan, China) en daarna geïncueerd met een secundair antilichaam. Ten slotte werd ECL-reagens gebruikt om de eiwitten te detecteren.

Diermodel

Om het CT26 subcutane tumor-model tot stand te brengen, werden 1 × 10⁷ CT26-cellen (100 μL, in PBS) subcutaan geïnjecteerd in de rug van Balb/c naakte muizen. Tumorvolume = lengte × breedte²/2. Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren van de National Institutes of Health en goedgekeurd door het Dierenethiekcomité van Zhumadian centraal ziekenhuis (Henan, China).

In vivo biodistributie

Biodistributie van IR780-TiS₂/RV in de tumordragende naakte muizen werd gedetecteerd op 24 u na staart-intraveneuze injectie met IR780-TiS₂/RV (150 μL, 6 mg/kg). De belangrijke organen inclusief hart, lever, milt, long, nier en tumor werden geweegd en verteerd door aqua regia-oplossing. Het Ti-elementgehalte in deze weefsels werd gekwantificeerd door ICP-OES.

In vivo NIR-getriggerde tumor-chemotherapie

CT26-tumor-dragende muizen werden willekeurig verdeeld in zes groepen (n = 6), inclusief saline, saline +NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV, en IR780-TiS₂/RV + NIR (equivalent RV, 1 mg/kg; equivalent IR780, 0,5 mg/kg). De NIR-bestraalingsconditie is 808 nm, 0,3 W/cm², en 3 min. Gedurende 30 dagen behandeling werden tumorvolumes en muisgewichten elke 3 dagen geregistreerd. Na de behandeling werden de organen inclusief hart, lever, milt, long en nier in diverse groepen fixatie en gekleurd met H&E.

Statistische analyse

De resultaten werden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie. Student's t-toets werd gebruikt om significante verschillen tussen twee groepen te onderzoeken. P < 0,05 werd beschouwd als significant en P < 0,01 als zeer significant.

Resultaten en discussie

Bereiding en karakterisatie van IR780-TiS₂/RV

Om IR780-TiS₂/RV te prepareren, werden allereerst biocompatibele TiS₂ nanosheets bereid via een bovine serumalbumine (BSA) en ultrasonificatie-geassisteerde exfoliatie-methode zoals eerder gerapporteerd. Vervolgens werd IR780-TiS₂ gesynthetiseerd in een substitutiereactie tussen een chlooratoom van IR780 en aminogroepen van BSA geadsorbeerd op de TiS₂ nanosheets met behulp van een zuur-bindend agent TEA. Ten slotte laadde het IR780-TiS₂ nanoplatform het anti-kanker medicijn RV via fysische adsorptie. Het schematische diagram van IR780-TiS₂/RV wordt getoond in Schema 1. Bijlage 1: Figuur S1 toont de TEM-afbeelding van de eiwit-geassisteerde geëxfollieerde TiS₂, wat een nanosheet-structuur toonde. Het XRD-patroon van de TiS₂ nanosheets werd ook gedetecteerd, wat goede kristalliniteit van de bereide TiS₂ nanosheets aanvoerde, consistent met de waarnemingen uit TEM (Bijlage 1: Figuur S2). Na functionalisatie had het IR780-TiS₂/RV nanocomposiet een vlak-achtige morfologie met een rooster-afstand van 0,25 nm zoals getoond door transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 1a, b) en een gemiddelde diameter van ongeveer 123,6 nm en zeta-potentieel van -37,2 mV gedetecteerd door Nanosizer (Malvern Instruments) (Fig. 1c, d). Na een 2-weken opslag in water, FBS of saline, bleef de gemiddelde grootte van IR780-TiS₂/RV constant op ongeveer 123 nm (Fig. 1e) wat de stabiliteit van IR780-TiS₂/RV aangeeft, mogelijk door adhesie van BSA op het oppervlak van de TiS₂ nanosheets. Figuur 1f toont de absorptiespectra van vrije IR780, vrije RV, TiS₂ nanosheets en IR780-TiS₂/RV. Het absorptiespectrum van IR780-TiS₂/RV toonde de pieken van vrije IR780 en vrije RV, wat aangeeft dat zowel IR780 als RV met succes geconjugeerd waren met de TiS₂ nanosheets. De RV-ladingsverhouding van IR780-TiS₂ was ongeveer 112% (W/W), wat bereikt werd via non-covalente interacties (bijv. π–π-stapeling en hydrofobe interacties). Verder, volgens het BET-resultaat, werden de oppervlaktes berekend als 15,2 m²/g en 122,1 m²/g voor bulk TiS₂ en TiS₂ nanosheets, respectievelijk. De geëxfollieerde TiS₂ nanosheets tonen een veel hoger BET-oppervlak dan bulk TiS₂, wat groot actief oppervlak voor medicijnlading biedt. De lading was hoog waarschijnlijk door het grote specifieke oppervlak en de BSA-adhesie aan de IR780-TiS₂ nanosheets. Om RV en IR780 te bevestigen geladen in TiS₂ nanosheets, werden de FTIR-spectra van TiS₂ nanosheets, IR780-TiS₂ en IR780-TiS₂/RV gemeten. In Bijlage 1: Figuur S6 verschenen alle karakteristieke pieken van TiS₂ nanosheets in FTIR-spectra van IR780-TiS₂/RV. Bovendien verschenen drie nieuwe pieken (~3191 cm⁻¹, ~1510 cm⁻¹, 1230 cm⁻¹) in het spectrum van IR780-TiS₂/RV, wat het bestaan van RV en IR780 aangeeft.

a TEM-afbeelding van IR780-TiS₂/RV. b Hoge-resolutie TEM-afbeelding van IR780-TiS₂/RV. c Grootteverdeling en d zeta-potentieel-verdeling van IR780-TiS₂/RV. e Hydrodynamische deeltjesgrootte-verandering van IR780-TiS₂/RV in water, FBS en saline over 2 weken. f Absorptiespectra van RV, IR780, TiS₂ nanosheets en IR780-TiS₂/RV

Na een 3-minuten lage-vermogen NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²), steeg de temperatuur van de IR780-TiS₂/RV-oplossing evenredig met de concentratie van IR780-TiS₂/RV (0, 5, 10 μg/ml), en bereikte de 10 μg/ml IR780-TiS₂/RV-oplossing de hoogste temperatuur van 47,6 °C (Fig. 2a). Bovendien behield IR780-TiS₂/RV de initiële fotothermische effect zelfs na vijf cycli van NIR-bestraaling, terwijl vrije IR780 een afname van fotothermisch effect toonde (Fig. 2b). Deze resultaten tonen aan dat het IR780-TiS₂/RV nanocomposiet grote fotostabiliteit heeft.

a Fotothermisch effect van IR780-TiS₂/RV onder NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²) gedurende 3 min. b Temperatuurverandering van IR780 en R780-TiS₂/RV na vijf cycli NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm², 3 min). c Schema van fotothermisch-getriggerde RV-vrijgave. d Vrijgavekinetiek van RV uit IR780-TiS₂/RV in PBS-buffer (pH = 7,4 en 6,5) met of zonder NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²). **P < 0,01, vergeleken met pH = 7,4 en pH = 6,5 groep

Vervolgens werd de RV-vrijgaveverhouding gemeten onder diverse condities van pH en NIR-bestraaling (Fig. 2c, d). Na 24 uur was de RV-vrijgaveverhouding 8,56% onder fysiologische condities (pH 7,4), maar steeg significant naar 16,2% bij pH 6,5, wat aangeeft dat het versterkt kan worden door zwak-zure condities. Verder werd de RV-vrijgaveverhouding opnieuw significant verhoogd tot 44,8% bij pH 6,5 en een 3-minuten NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²). Deze resultaten tonen aan dat NIR-bestraaling een controleerbare externe stimulus kan zijn om de vrijgave van RV uit IR780-TiS₂/RV te triggeren. Dit effect is waarschijnlijk te wijten aan de warmte gegenereerd door IR780-TiS₂ onder NIR-bestraaling die de non-covalente adsorptie-interacties tussen RV en het IR780-TiS₂-oppervlak verzwakt. Daarnaast kan in zure omgeving H+ de oppervlaktelading van TiS₂ veranderen wat de hydrofiele/hydrofobe balans van de nanopartikelen wijzigt.

In vitro localisatie van IR780-TiS₂/RV

Om de celopname en intracellulaire distributie van IR780-TiS₂/RV te onderzoeken, werden de IR780-TiS₂/RV nanopartikelen gelabeld met FITC, en een CLSM werd gebruikt om de intracellulaire fluorescentie te visualiseren. Na een 5-uurs incubatie toonden TiS₂/RV en IR780-TiS₂/RV een vergelijkbare fluorescentie-intensiteit in het cytoplasma (Fig. 3a, b), wat aangeeft dat beide nanocomposieten cellen binnen konden komen, waarschijnlijk via endocytose. Echter, het IR780-TiS₂/RV nanocomposiet vertoonde een grotere intensiteit van geel en groen fluorescentie toen het FITC-signaal samengevoegd werd met MitoTracker-labeling (Fig. 3a, c). Deze resultaten tonen aan dat IR780-TiS₂/RV mitochondria kan targeten met hoge efficiëntie. Bovendien werd de distributie van IR780-TiS₂/RV binnen het cytoplasma verder bevestigd met TEM, wat behouden nanopartikelen in sommige mitochondria toonde (Fig. 3d). Samen bevestigen deze resultaten stevig dat IR780-TiS₂/RV een goede mitochondriale targeting bereikt, wat de mitochondriale medicijn-accumulatie verder bevordert, wat directe celtoxiciteit veroorzaakt. De mitochondriale targeting werd waarschijnlijk gemedieerd door zowel de organisch-anion-transporterende polypeptide-gemedieerde actieve transport als het lipofiele kation-kenmerk, wat de nanopartikelen hoog liet accumuleren in de mitochondria van tumorcellen.

a Fluorescentie-afbeeldingen van CT26-cellen geïncueerd met FITC-gelabelde TiS₂/RV of IR780-TiS₂/RV gedurende 5 uur. Groene fluorescentie is FITC-signaal, rode fluorescentie is MitoTracker-signaal. b De corresponderende gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) analyse van FITC-gelabelde TiS₂/RV of IR780-TiS₂/RV in cellen in Fig. 3a. c De corresponderende co-localisatiecoëfficiënt van FITC-gelabelde TiS₂/RV of IR780-TiS₂/RV en mitochondria in cellen in Fig. 3a. M betekent mitochondria. **P < 0,01, vergeleken met TiS₂/RV groep alleen

In vitro NIR-getriggerde tumor-chemotherapie

Allereerst werd het fotothermische effect in vitro geëvalueerd. Na een 5-uurs incubatie toonde IR780-TiS₂/RV een temperatuurstijging van ongeveer 17 °C, terwijl TiS₂/RV een temperatuurstijging van ongeveer 10 °C toonde (Fig. 4a). Het fotothermische effect werd toegeschreven aan IR780 en TiS₂ nanosheets. Aannemend biocompatibiliteit als nanoplatform voor medicijnlading, toonde IR780-TiS₂ geen uitgesproken cytotoxiciteit onder de concentratie van 300 μg/ml (Fig. 4b). Verder had RV met of zonder NIR-bestraaling een vergelijkbare concentratie-afhankelijke celdodende effect (Fig. 4c). Bij dezelfde RV-concentratie bereikte RV het beste celdodende effect wanneer geladen door IR780-TiS₂ en bestraald met NIR vergeleken met alle andere condities, namelijk vrije RV, vrije IR780-TiS₂ en RV geladen door TiS₂ (Fig. 4d). Interessant genoeg toonde het ongeladen IR780-TiS₂-platform geen opmerkelijk anti-kankereffect wanneer blootgesteld aan NIR-bestraaling vergeleken met dat zonder NIR-bestraaling (Fig. 4d), wat aangeeft dat de warmte gegenereerd door IR780-TiS₂ bij de NIR-bestraaling-stimulus voornamelijk gebruikt werd om de medicijnvrijgave te triggeren wat dan de cellen doodde. Deze resultaten suggereren dat IR780-TiS₂/RV RV in de mitochondria kan vrijgeven wanneer getriggerd door NIR-bestraaling en dus de locale concentratie van RV binnen de mitochondria aanzienlijk verhoogt en een groter tumor-inhibiterend effect bereikt.

a Temperatuurverandercurves van PBS (controle), TiS₂/RV of IR780-TiS₂/RV-behandelde cellen onder 3-minuten NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²). b In vitro cytotoxiciteit tegen CT26-cellen behandeld met verschillende concentraties van IR780-TiS₂. c Cellevensvatbaarheid van cellen behandeld met RV met of zonder NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²) gedurende 3 min. d Cellevensvatbaarheid van cellen behandeld met IR780-TiS₂, RV, TiS₂/RV of IR780-TiS₂/RV met of zonder NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²) gedurende 3 min. **P < 0,01, vergeleken met IR780-TiS₂/RV zonder NIR groep alleen

Het celdood-mechanisme

Om het onderliggende mechanisme van NIR-getriggerde chemotherapie van IR780-TiS₂/RV te illustreren, analyseerden we het celdood-type, mitochondriale membraanpotentieel (Ψm), en expressieniveaus van cruciale apoptose-gerelateerde eiwitten. Allereerst werd FCM gebruikt om het celdood-type te detecteren met Annexin V-FITC/PI-kleuring (Fig. 5a). Bij dezelfde RV-concentratie konden vrije RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV en IR780-TiS₂/RV + NIR allemaal apoptose induceren, voornamelijk door de aanwezigheid van RV. Inderdaad, RV is gerapporteerd om de capaciteit te hebben om apoptose te induceren. Van deze behandelingen toonde IR780-TiS₂/RV + NIR de hoogste apoptose-ratio van 90,8%. Apoptose-signaleringspathways werden daarna onderzocht. Een afname van Ψm is gerapporteerd als de sleutelgebeurtenis in de mitochondriale (intrinsieke) apoptotische pathway. Bij dezelfde RV-concentratie verlaagde IR780-TiS₂/RV + NIR Ψm met ongeveer 85%, wat significanter was dan een Ψm-afname geïnduceerd door IR780-TiS₂, TiS₂/RV met of zonder NIR en vrije RV (Fig. 5b). Dit experiment geeft aan dat IR780-TiS₂/RV + NIR geïnduceerde celdood gemedieerd werd via de mitochondriale (intrinsieke) apoptotische pathway. Vervolgens werd de expressie van eiwitten kritiek voor apoptose, specifiek cytochroom c (cyto c), caspase 9 en caspase 3, gedetecteerd via een Western blot-assay. De cellen behandeld met IR780-TiS₂/RV + NIR exprimeerden meer cytosool cyto c dan die behandeld met RV, IR780-TiS₂/RV of IR780-TiS₂/RV (Fig. 5c). De translocatie van cyto c is de belangrijkste initiatior van de caspase-cascade. Gevolgd werd de expressie van gekleefde caspase 9 en gekleefde caspase 3 aanzienlijk verhoogd in de IR780-TiS₂/RV + NIR-behandelde cellen. Samen duiden deze gegevens duidelijk op dat apoptose gemedieerd werd door de mitochondriale (intrinsieke) pathway.

a Cel-apoptose van CT26-cellen behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV en IR780-TiS₂/RV + NIR door FCM. b Verandering in mitochondriale membraanpotentieel van CT26-cellen behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV en IR780-TiS₂/RV met of zonder NIR-bestraaling door FCM. c Expressie van apoptose-gerelateerde eiwitten in CT26-cellen behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV en IR780-TiS₂/RV + NIR. Cytochroom c, gekleefde caspase-3 en gekleefde caspase-9 getest door Western blot. **P < 0,01, vergeleken met IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR en IR780-TiS₂ groepen

In vivo NIR-getriggerde tumor-chemotherapie

Om de effectiviteit van de NIR-getriggerde chemotherapie in vivo te evalueren, werden CT26-tumor-dragende muizen behandeld met saline, saline + NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR en IR780-TiS₂/RV + NIR. De tumor-grootte in de IR780-TiS₂/RV + NIR groep daalde significant en de tumor verdween bijna na 30 dagen behandeling, terwijl in de overige groepen het tumorvolume een stijgende trend vertoonde (Fig. 6a). Gedurende de behandeling was er geen significant verschil in lichaamsgewicht tussen de groepen (Fig. 6b). Uiteindelijk onthulde H&E-beeldvorming geen opvallende weefseltoxiciteit of abnormaliteit in alle geteste groepen (Fig. 6c). Deze resultaten tonen aan dat het IR780-TiS₂/RV nanocomposiet een uitstekende NIR-getriggerde anti-tumor effectiviteit en een lage systemische toxiciteit heeft. Bovendien werd de biodistributie van IR780-TiS₂/RV in vivo geëvalueerd. Zoals getoond in Bijlage 1: Figuur S4, gingen de nanopartikelen meestal naar het leversysteem en werden misschien gemetaboliseerd door het systeem.

a Groeiprofiel van CT26-xenograft-tumor na intraveneuze injectie van saline (controle), RV, TiS₂/RV en IR780-TiS₂/RV met of zonder 3-minuten NIR-bestraaling (808 nm, 0,3 W/cm²). b Lichaamsgewicht van tumor-dragende muizen na diverse behandelingen. c H&E-afbeeldingen van belangrijke organen van alle behandelde muizen na 30 dagen behandeling. **P < 0,01, vergeleken met saline, saline + NIR, RV, TiS₂/RV + NIR en IR780-TiS₂/RV groepen

Conclusie

Samengevat hebben we een mitochondria-gerichte en RV-geladen nanoplatform ontwikkeld op basis van TiS₂ nanosheets voor een NIR-getriggerde medicijnvrijgave en verbeterde tumor-chemotherapie. Het geproduceerde IR780-TiS₂/RV met vlak-achtige morfologie toonde goede stabiliteit en biocompatibiliteit. Vanwege de mitochondria-targeterende capaciteit van IR780, kon IR780-TiS₂/RV selectief accumuleren in tumorcel-mitochondria en waar het RV kon vrijgeven wanneer getriggerd door NIR-bestraaling. Het vrijgegeven RV faciliteerde de afname van het mitochondriale membraanpotentieel, cyto c-vrijgave, en initieerde vervolgens een cascades van caspase-reacties om tumorcel-apoptose te bevorderen via de mitochondriale signaleringspathway. In vitro en in vivo resultaten toonden aan dat IR780-TiS₂/RV een effectieve NIR-getriggerde tumor-chemotherapie vertoonde zonder significante weefseltoxiciteit. Deze resultaten suggereren dat IR780-TiS₂/RV een veelbelovend chemotherapeutisch middel kan zijn in de klinische praktijk.