Orale toediening van met resveratrol geladen vast lipide nanodeeltje verbetert de insulineresistentie door gerichte expressie van SNARE-eiwitten in vet- en spierweefsel bij ratten met diabetes type 2

Resultaten en discussie

Fysisch-chemische karakterisering van SLN-RES

Zoals te zien is in tabel 1, waren de deeltjesgrootte en PDI-waarde bijna constant toen de verhouding tussen geneesmiddel en lipide toenam, wat te wijten kan zijn aan de vorming van meerdere fosfolipidelagen in SLN [11]. Het groottebereik van het huidige nanodeeltje was ongeveer 250 nm, wat geschikt zou kunnen zijn voor intestinale absorptie en bypass-lever- en miltfiltratiesysteem [20]. Dit groottebereik kan ook leiden tot een verhoogde biologische beschikbaarheid van RES door een langere circulatietijd van SLN-RES en een verlengde afgifte van geneesmiddelen. De ontwikkeling van nanodeeltjes met kleinere afmetingen en PDI-waarde kan hun intestinale absorptie vergemakkelijken. Als suggestie zou de modificatie van SLN met polyethyleenglycol (PEG) onze formulering kunnen verbeteren om hun permeabiliteit en systemische circulatietijd te verbeteren [21].

Zoals weergegeven in tabel 1 wordt aangenomen dat de PDI-waarde van 0,4 heterogeen is verdeeld, wat de aanwezigheid van agglomeraten uitdrukt. In SLN-RES-30 helpt de verhoging van het RES-gehalte om de kans te vergroten om in de SLN te worden ondergebracht, hoewel het EE-percentage duidelijk was afgenomen, gevolgd door een toename van het geneesmiddelgehalte in de SLN-RES-70-formulering. Er werd geconcludeerd dat een verhoogd lipidengehalte in SLN-RES-70 niet voldoende is om alle hoeveelheden RES in de SLN-matrix op te nemen [22]. Dus werd SLN-50 geselecteerd als de geoptimaliseerde formulering voor verder onderzoek.

Zeta-potentiële resultaten toonden een negatieve oppervlaktelading (− 16.5 ± 17.7 mV) voor de huidige formuleringen. Met betrekking tot morfologische observatie werd de oppervlaktelading van SLN-RES voldoende geacht om deeltjesaggregatieverschijnselen en fijne SLN-stabiliteit te voorkomen [21]. Het zeta-potentieel van alle formuleringen met of zonder medicijn was bijna gelijk aan elkaar, wat betekent dat de inkapseling van het medicijn in SLN geen significante invloed had op de oppervlaktelading van de drager. Als gevolg hiervan werd het medicijn aan de binnenkant van de SLN geplaatst vanwege het lipofiele karakter van RES [23].

De in vitro afgifte-assay

Zoals de resultaten worden weergegeven in Fig. 1 werden verschillende afgiftegedragingen gedetecteerd bij pH = 7.4 en pH = 1.2. Na 6 uur en 1 uur kwam ongeveer 70% van de RES vrij uit nanodeeltjes bij respectievelijk neutrale en zure pH-omstandigheden. De initiële burst-afgifte was te wijten aan de afgifte van geneesmiddelen die in de beginfase op het oppervlak van nanodeeltjes waren geadsorbeerd [24]. Daarna kon een manier van aanhoudende afgifte worden toegeschreven aan geneesmiddel-lipide-interactie, concentratiegradiënt en opname van geneesmiddel in de olieachtige dragerkern. Het profiel van aanhoudende afgifte leidt tot een verhoogde geneesmiddelserumconcentratie en helpt bijgevolg de biologische beschikbaarheid en gerichte afgifte van RES te verhogen. Als suggestie kan de intraveneuze toediening van RES de zure toestand van de maag omzeilen [22].

In vitro afgifteprofielen van RES van SLN-RES in zure en natuurlijke omstandigheden

Morfologie-evaluatie

Zoals te zien is in Fig. 2 gaf de TEM-analyse aanleiding tot goede resultaten waarbij de meeste deeltjes een regelmatige bolvorm en grootte bereikten in het bereik van 20-30 nm. Ook werden de staafvormige en amorfe nanodeeltjes waargenomen met minder aggregatie. De deeltjesgrootte van SLN werd geschat tussen 20 en 30 nm, wat niet overeenkomt met de DLS-bevindingen (tabel 1). Deze discrepantie kan het gevolg zijn van de hydratatie van nanodeeltjes door monsterverdunning in DLS-analyse. Er was ook een staafvormig nanodeeltje dat mogelijk te wijten is aan de constante injectie van een emulsie in het koude water door een injectienaald. We hebben geen SLN-aggregaties waargenomen in TEM-observatie, die voldoende oppervlaktelading en stabiliteit vertegenwoordigt voor onze formulering [23].

Transmissie-elektronenmicroscoop van SLN-RES. Bar=100 nm

De laadefficiëntie van RES valideren door middel van infraroodspectroscopie

Zoals weergegeven in Fig. 3, lieten de FTIR-resultaten van het lecithinespectrum een ​​brede piek zien bij 3370-3390 cm ⁻¹ dat verwijst naar NH symmetrische rek van choline functionele groep. Een piek van 1735 cm ⁻¹ vertegenwoordigde C=O dat zich uitstrekt van de esterverbinding in lecithine. Ook de karakteristieke pieken bij 2922, 2853 en 3010 cm ⁻¹ zijn te wijten aan het uitrekken van C-H-groepen. Het SLN-spectrum vertoonde verschillende karakteristieke pieken die vergelijkbaar waren met het lecithinespectrum zonder verschuiving, maar de intensiteit van de pieken die tot lecithine behoorden, was sterk verminderd wanneer ze in SLN werden geplaatst. Dit kan te wijten zijn aan de hydrofiele omgeving en het afschermende effect van de oppervlakteactieve stof. In de huidige studie vertoonde het RES-spectrum een ​​functionele groep inclusief absorptiebanden bij 3290 cm ⁻¹ vanwege O-H stretching behorend tot de alcoholische groep, 965 cm ⁻¹ voor trans C=C binding, 1154 cm ⁻¹ voor C-O stretching, 1445 cm ⁻¹ en 1587 cm ⁻¹ voor C=C rekken in aromatische (AR) ring, en 1606 cm ⁻¹ voor C-C rekken van alkeengroep. Ook vertoonde de RES karakteristieke pieken met een sterke intensiteit van monogesubstitueerde C-H-bocht bij 770 cm ⁻¹ en Ar-C-H strekken zich uit op 3020 cm ⁻¹ . Er waren pieken met intensiteit bij 1175-1263 die de ArO-H-groep van RES vertegenwoordigden. Onze resultaten valideerden de opname van RES in SLN, terwijl de RES-vingerafdruk werd herhaald in SLN-RES, maar het SLN-spectrum was niet geassocieerd met deze vingerafdruk. Ook een piek rond 1735–1740 cm ⁻¹ werd toegeschreven aan C=O stretching (R-C(O)-O-R) dat verwijst naar ester in lecithine fosfolipide in alle spectrum verwacht RES.

FTIR-spectrum van SLN (vast lipide-nanodeeltje), SLN-RES (met resveratrol geladen vast lipide-nanodeeltje), S100 (lecithine) en RES (puur resveratrolpoeder)

FTIR-gegevens valideerden de aanwezigheid van het medicijn in de drager. Er was een brede piek bij 3040–3670 cm ⁻¹ in lecithine, SLN en SLN-RES die het gevolg was van O-H-uitrekking, wat bijdraagt ​​aan de sterke hydrofobe aard van monsters. De brede piekverschuiving tussen SLN en SLN-RES kan worden verwezen naar de vorming van waterstofbruggen wanneer RES in SLN wordt geplaatst. We concludeerden dat het deeltjesoppervlak bedekt was met lecithine vanwege de verbetering van C-H-uitrekking in SLN-RES. Aan de andere kant verwijst de verminderde intensiteit van de RES-vingerafdruk in het SLN-RES-spectrum naar de lipidebedekking van RES in de SLN-structuur. Het verschil tussen karakteristieke pieken van RES en SLN-RES bevestigde dat er een potentiële chemische interactie is tussen RES en andere formuleringscomponenten. Een nieuwe piek die zichtbaar werd op 1000 cm ⁻¹ in SLN-RES werd toegeschreven aan Ar-O-R dat verwees naar de interactie tussen RES en lecithine. Aan de andere kant, in het RES-spectrum, is de absorptieband bij 1106 cm ⁻¹ was gerelateerd aan de Ar-O-H-groep die verdween in SLN-RES. Deze verandering levert een ander bewijs voor interactie tussen RES en SLN. Bovendien werd een verhoogde intensiteit zichtbaar bij 2850-2900 cm ⁻¹ in SLN-RES dan in SLN, wat wijst op de verbetering van CH-uitrekking die mogelijk te wijten is aan toenemende oppervlaktelokalisatie van oppervlakteactieve stof en het plaatsen van RES in het kernnanodeeltje. Over het algemeen valideerden onze resultaten de opname van RES in lipidekern SLN dat wordt gesneden door lecithine [11, 22].

Het effect van RES- en SLN-RES-behandeling op de lichaamsgewichtstoename, nuchtere bloedsuikerspiegel, insuline en HOMA-index

De resultaten in tabel 2 toonden aan dat in de DC-groep de STZ-injectie het lichaamsgewicht aanzienlijk verminderde dan in de HC-groep. RES-toediening voorkwam gewichtsverlies in vergelijking met de DC-groep. SLN-RES dient significanter voor het normale lichaamsgewicht dan RES-behandeling, terwijl het zijn toevlucht nam tot de HC-groep. Op basis van eerdere rapporten had de orale toediening van SLN-RES een vergelijkbaar effect als vrij RES bij intraperitoneale toediening. Gencoglu et al. rapporteerde dat de intraperitoneale behandeling van RES het lichaamsgewicht diende na diabetes-inductie, terwijl het uiteindelijke lichaamsgewicht van diabetische modellen die RES kregen 10% lager was dan dat van de gezonde ratten [25].

Zoals weergegeven in Tabel 2, was FBS significant verhoogd in de DC-groep in vergelijking met de HC-groep. Aan het einde van het onderzoek was de serum-FBS verlaagd door zowel RES- als RES-SLN-behandeling in vergelijking met de DC-groep. Diabetes-inductie verlaagde de serumspiegel van insuline in vergelijking met de HC-groep. Interessant is dat de serumspiegel van insuline bij diabetische ratten werd gecompenseerd door RES-SLN-behandeling. De toediening van RES en SLN-RES verbeterde HOMA opmerkelijk dan de DC-groep. In de SLN-RES-groep was HOMA beter dan RES-behandeling die in de buurt komt van de HC-groep.

Het hypoglycemische effect verkregen met de SLN-RES was significant beter dan RES, wat mogelijk te wijten is aan de verbeterde intestinale absorptie en verhoogde circulatietijd van nano-ingekapselde RES in het bloed. In overeenstemming met ons voorstel, Sadi et al. toonde aan dat de intraperitoneale behandeling van RES samenviel met een diepgaand hypoglycemisch effect en een verbeterde insulineresistentie bij STZ-geïnduceerde diabetes [26].

Het effect van RES- en SLN-RES-behandeling op het serumniveau van oxidatieve stressparameters

Zoals vermeld in tabel 3, leidt diabetes-inductie in de huidige studie tot verminderde antioxidantindicatoren en verhoogde oxidatiemiddelindicatoren in vergelijking met de HC-groep. RES-behandeling verhinderde de uitputting van de serum-TAC-spiegel en remde de verhoging van MDA. Verrassend genoeg kon de SLN-RES-behandeling het serum-TAC- en MDA-niveau volledig herstellen. Waarschijnlijk heeft de verhoogde circulatietijd van RES geleid tot een beter modulerend effect van RES-SLN [27]. In overeenstemming met het huidige resultaat hebben Gokce et al. rapporteerde dat SLN en nanogestructureerde lipidedragers (NLC) die RES bevatten, intracellulaire ROS in celkweekfibroblasten verminderden [28]. Coradini en co-auteurs rapporteerden ook dat de co-inkapseling van RES en curcumine in een lipidedrager de hydroxylradicaal in vitro opmerkelijk verminderde [29]. Bovendien leidde de toediening van RES-SLN tot een significant verlaagde TOS-waarde en een verhoogd -SH-niveau in vergelijking met de DC-groep. RES-behandeling verbeterde echter het TOS- en -SH-niveau niet, wat het zwakke antioxiderende effect van RES aantoonde, wat zou kunnen worden toegeschreven aan de lage biologische beschikbaarheid van RES bij orale toediening.

Het effect van RES- en SLN-RES-behandeling op de genexpressie van Snap23, Stx4 en Vamp2 in vetweefsel

Eerdere pogingen toonden aan dat de verhoging van de genexpressie van Snap23, Stx4 en Vamp2 leidde tot een verbetering van de insulineresistentie. O et al. rapporteerde dat de overexpressie van Stx4 in de pancreascellen van het transgene model de insulineresistentie verbeterde [30]. Hier induceerde de RES-behandeling duidelijk de genexpressie van Snap23, Stx4 en Vamp2 in vet (Fig. 4a-c). Farmani et al. toonde aan dat de RES-behandeling de genexpressie van Stx4 en Vamp2 significant verlaagde in het vetweefsel van het diabetische rattenmodel [31]. Er werden geen significante veranderingen waargenomen tussen RES- en SLN-RES-behandeling in vetweefsel, waarbij waarschijnlijk de halfwaardetijd van serumeliminatie van RES niet voldoende is voor blootstelling aan vetweefselgeneesmiddelen. De genexpressie van Snap23 had geen invloed op RES en SLN-RES, wat mogelijk het gevolg is van de overproductie van SNAP23-eiwit in de adipocyten die kan leiden tot transcriptionele repressie via een feedbackmechanisme. Om deze vraag te beantwoorden, zou de meting van het eiwitniveau van SNAP23 de huidige gegevens in meer detail kunnen verklaren. Ook zou de meting van de hepatische Snap23-expressie met behulp van de tijdsverloopmethode onze waarneming duidelijk verklaren.

Het effect van RES- en SLN-RES-behandeling op het mRNA-niveau van Snap23, Stx4 en Vamp2 in vet (a –c ) en spierweefsel (d –f ). α , vergeleken met de DC-groep; δ , was er een significant verschil tussen de RES- en de SLN-RES-groep (p < 0,05); π , hersteld in de HC-groep (er was geen significant verschil met de HC-groep (p> 0.05)). Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD.*p < 0.05, ⁺ p < 0.01, ^# p < 0,001

Het effect van RES- en SLN-RES-behandeling op de genexpressie van Snap23, Stx4 en Vamp2 in spierweefsel

Zoals geïllustreerd in Fig. 4d-f, was STZ-injectie in de DC-groep geassocieerd met downregulatie van Snap23, Stx4 en Vamp2 in spierweefsel in vergelijking met de HC-groep. SLN-RES induceerde de expressie van Snap23 en Stx4 in spierweefsel beter dan de vrije vorm van RES. We hebben het beste resultaat waargenomen over de genexpressie van Vamp2. De orale toediening van SLN-RES compenseerde de neerwaartse regulatie van Vamp2 tot bijna het normale niveau. Vergelijkbaar met onze resultaten, Mullainadhan et al. toonde aan dat de toediening van bisfenol-A aan volwassen mannelijke albinoratten de eiwitexpressie van Snap23, Stx4 en Vamp2 in de gastrocnemius-spier verhoogde [32]. Waarschijnlijk verhoogde absorptie van RES door toediening van RES-SLN kan de kans vergroten dat RES-SLN het spierweefsel bereikt, wat leidde tot een beter regulerend effect op de genexpressie van Snap23, Stx4 en Vamp2. Op basis van het eerdere bewijs, beïnvloeden het potentiële penetratievermogen en de celopnamecapaciteit van SLN-RES de weefselaccumulatie van RES die verantwoordelijk kan zijn voor de verschillende effecten van SLN-RES op de genexpressie van SNARE-eiwitten in vet- en spierweefsel. Met andere woorden, onze resultaten ondersteunden een verschillend in vivo biodistributiepatroon van RES in intacte vorm binnen de SLN.