Optimalisatie van voorbehandeling voor sp-ICP-MS: Onthulling van zilvernano deeltjesdistributie in biologische weefsels

Samenvatting

De snelle proliferatie van ingenieurde nanopartikelen (ENPs) heeft de menselijke blootstelling verhoogd, maar huidige analytische tools kunnen ENPs niet gelijktijdig kwantificeren en karakteriseren binnen biologische matrices. Enkel-deeltje geïnductief gekoppeld plasma-massa spectrometrie (sp-ICP-MS) biedt gelijktijdige kwantificatie en fysieke-eigenschapsbeoordeling, maar de toepassing op weefsels wordt beperkt door onvoldoende voorbehandelingsprotocollen die de deeltjesintegriteit kunnen wijzigen of de herwinning verminderen. In deze studie evalueerden we systematisch vijf oplosmiddelen—natriumhydroxide (NaOH), tetramethylammoniumhydroxide (TMAH), salpeterzuur (HNO₃), zoutzuur (HCl) en proteinase K—met zilvernano deeltjes (nAg) als modelsysteem. NaOH-behandeling bereikte >90% weefselontleding terwijl de deeltjesgrootte behouden bleef en ionisatie geminimaliseerd werd, wat de andere reagenten overtrof. Uitbreiding van het NaOH-protocol naar hart, long, milt en nier homogenisaten bevestigde de brede toepasbaarheid. Ten slotte pasten we de geoptimaliseerde voorbehandeling toe om het lot van intraveneus toegediende nAg versus Ag⁺ in muisbloed en lever te beoordelen. sp-ICP-MS onthulde dat nAg grotendeels deeltjesmatig (~80%) in de lever bleef, maar geïoniseerd (~95%) in de bloedstroom, terwijl Ag⁺ ionisch bleef in beide compartimenten. Deze bevindingen tonen aan dat NaOH-voorbehandeling accurate sp-ICP-MS analyse van ENPs in vivo mogelijk maakt en benadrukken het belang van deeltjes-tot-ion conversie bij het bepalen van biodistributie en kinetiek.

Inleiding

Voortgang in nanotechnologie heeft de productie van ingenieurde nanopartikelen (ENPs) kleiner dan 100 nm versneld, met unieke voordelen zoals verbeterde weefselpenetratie en reactieve oppervlakken. Zilvernano deeltjes (nAg) worden breed ingezet in consumentengoederen en farmaceutica, gewaardeerd om hun duurzame Ag⁺ afgifte en geleidende eigenschappen. De dezelfde nanoschaal kenmerken die functionaliteit geven, kunnen echter ook gezondheidsrisico's poseren, waaronder ontwrichting van de bloed-hersenbarrière en inflammatoire reacties. Gegeven de alomtegenwoordigheid van ENPs, blijft een rigoureuze beoordeling van zowel gevaar als blootstelling—samen de ENP-risico definierend—essentieel.

Hoewel uitgebreid onderzoek zich heeft gericht op ENP-toxiciteit, hebben minder studies de daadwerkelijke blootstellingsscenario's gekwantificeerd. Recent werk heeft afwijkende intracellulaire distributies voor nAg versus Ag⁺ in gekweekte cellen getoond, wat de noodzaak benadrukt om deeltjes van ionen in weefsels te differentiëren. Conventionele ICP-MS kwantificeert het totale metaalgehalte, maar kan deeltjes versus ionische soorten niet resoleren, terwijl TEM grootte-informatie geeft maar kwantitatieve mogelijkheden mist. Dus is een methode die nauwkeurige kwantificatie koppelt aan fysieke-eigenschapsanalyse cruciaal voor het ontrafelen van ENP-biotransformatie.

Enkel-deeltje ICP-MS (sp-ICP-MS) kan individuele deeltjes detecteren, wat grootteschatpingen geeft uit piekintensiteit en concentratie uit piekfrequentie, terwijl ionen onderscheiden worden via achtergrondsignaalanalyse. Eerdere studies hebben sp-ICP-MS toegepast op milieue en commerciële monsters, maar het gebruik in biologische weefsels was beperkt, grotendeels door onvoldoende voorbehandeling die ENPs kan degraderen of wijzigen. Verschillende oplosmiddelen variëren in hun vermogen om weefsels te lyseren, ENPs te herwinnen en deeltjesintegriteit te behouden. Deze studie evalueert en optimaliseert daarom voorbehandelingsstrategieën voor sp-ICP-MS analyse van nAg in muisweefsels, met als doel een betrouwbare workflow te vestigen voor gelijktijdige kwantificatie en fysieke-eigenschapsbeoordeling van ENPs in vivo.

Materialen en Methodes

ENPs

De 30, 70 en 100 nm Biopure nAg (nAg30, nAg70, nAg100) werden verkregen van nanoComposix (San Diego, CA, VS). RM8013, een standaard voor transport-efficiëntie kalibratie, werd verkregen van het National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, VS). Alle ENP suspensies werden 10 min gesonicerd vóór gebruik.

Reagentia

Oplossingen van 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl en proteinase K werden gekocht van Wako (Osaka, Japan). Een 70% HNO₃ oplossing werd verkregen van Kanto Kagaku (Tokio, Japan).

Dieren

Vrouwelijke BALB/c muizen (6 weken oud) werden verkregen van Japan SLC (Shizuoka, Japan). Muizen werden gehuisvest onder een 12-uur licht/donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle procedures voldeden aan de ethische richtlijnen van Osaka Universiteit, Japan.

Meting van deeltjesgrootteverdelingen door dynamische lichtverstrooiing

nAg werd gedilueerd in MilliQ water tot 10 µg mL⁻¹ Ag. Een 1 mL aliquot werd in een zeta-capillair cel geplaatst (Malvern Instruments) en geanalyseerd op een Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments) om gemiddelde diameter en zeta-potentiaal te bepalen.

Meting van totale Ag massa

Totale Ag concentraties werden gemeten op een Agilent 7700x ICP-MS (Agilent Technologies). Bedrijfscondities: RF vermogen 1550 W, Ar stroom 1,05 L min⁻¹, verblijftijd 100 ms. Rhodium diende als interne standaard. Metingen werden in drievoud uitgevoerd.

Analyse van sp-ICP-MS en berekening

sp-ICP-MS analyse gebruikte hetzelfde instrument met RF vermogen 1550 W, Ar stroom 1,05 L min⁻¹, verblijftijd 10 ms, en een totale looptijd van 30 s. Deeltjesgrootte berekeningen gebruikten het enkel-deeltje tool ontwikkeld door RIKILT.

Kritische deeltjesconcentratie voor sp-ICP-MS

Voorraad nAg oplossingen (1,0 mg mL⁻¹) werden serieel gedilueerd om 2000, 800, 700 en 600 pg mL⁻¹ oplossingen te produceren, die verder tienvoudig werden gedilueerd om 40 verschillende concentraties te genereren voor sp-ICP-MS evaluatie.

Optimalisatie van voorbehandelingsmethoden voor muislever

Leverhomogenisaten werden bereid door weefsel te mengen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, g/v = 1:10) en te homogeniseren. Elk homogenisaat werd gespiked met 100 ng mL⁻¹ nAg en vervolgens behandeld met een van de volgende reagentia in een 1:1 v/v verhouding: 0,1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl, of proteinase K (10 U mL⁻¹ in 0,01 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,5% SDS). Monsters werden 3 u geïncubeerd bij 37 °C, residu verzameld, gewogen, en supernatant 500-voudig gedilueerd voor sp-ICP-MS.

Evaluatie van veelzijdigheid van NaOH voorbehandeling in diverse organen

Hart, long, milt en nier weefsels werden gehomogeniseerd in PBS (g/v = 1:10) en gespiked met 100 ng mL⁻¹ nAg. Een 1 mol L⁻¹ NaOH oplossing werd in een 1:1 v/v verhouding toegevoegd, en monsters werden 3 u geïncubeerd bij 37 °C. Residuen werden gewogen, en supernatanten 500-voudig gedilueerd voor sp-ICP-MS.

Evaluatie van hoeveelheid en fysieke eigenschappen van nAg₁₀₀ en Ag⁺ in muizen na enkelvoudige intraveneuze toediening

nAg₁₀₀ en AgNO₃ werden gedilueerd tot 0,25 mg mL⁻¹ (Ag⁺) in 5% glucose. Muizen ontvingen intraveneuze injecties van nAg₁₀₀ (1,5 of 0,75 mg kg⁻¹), AgNO₃ (1,5 of 0,75 mg kg⁻¹ als Ag⁺), of 5% glucose (controle). Vierentwintig uur na injectie werden bloed en lever monsters verzameld. Leverhomogenisaten werden bereid in PBS (g/v = 1:10) en vervolgens behandeld met TMAH of NaOH (1:1 v/v) voor ICP-MS en sp-ICP-MS analyse.

Resultaten en Discussie

Optimalisatie van deeltjesdetectie door sp-ICP-MS

Accurate sp-ICP-MS vereist dat niet meer dan één deeltje het plasma binnenkomt tijdens elke verblijftijd; anders worden meerdere deeltjes foutief opgeteld als een enkele gebeurtenis, wat grootteschatpingen opblaast. We dilueerden nAg₁₀₀ serieel en plotte gedetecteerde versus theoretische deeltjestellingen. Terwijl lage concentraties een lineaire relatie produceerden, leverden hogere concentraties minder gedetecteerde gebeurtenissen dan verwacht, wat multi-deeltje interferentie aangeeft. Het aftrekken van gedetecteerde van theoretische telling onthulde dat afwijkingen significant werden wanneer gedetecteerde gebeurtenissen 500 overschreden, wat een praktische drempel voor betrouwbare analyse vestigt.

Validatie met nAg van variërende diameters bevestigde dat de sp-ICP-MS instellingen accurate grootteschatpingen gaven: gemeten diameters van 30,0 ± 1,2 nm, 65,1 ± 0,6 nm en 97,4 ± 0,6 nm voor nAg30, nAg70 en nAg100 respectievelijk. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) metingen (36,4 ± 1,6 nm, 70,6 ± 1,7 nm, 101 ± 1,0 nm) matchten de sp-ICP-MS resultaten nauw, wat het analytische protocol valideerde.

Optimalisatie van voorbehandelingsmethoden voor detectie van nAg in muisleefweefsel

Effectieve voorbehandeling moet weefsel lyseren, ENPs herwinnen zonder hun fysieke of chemische toestand te wijzigen, en ionisatie of aggregatie voorkomen. We verglichen vijf oplosmiddelen—NaOH, TMAH, HNO₃, HCl en proteinase K—met leverhomogenisaten gespiked met 100 ng mL⁻¹ nAg.

Residuanalyse onthulde dat NaOH, TMAH en proteinase K >90% van de levermatrix ontleden, terwijl HNO₃ en HCl slechts ~75% ontleden. Aangezien ~80% van weefsel water is, duidt de lagere ontleding door zure reagentia op onvolledige matrixverwijdering.

sp-ICP-MS herwinningsdata toonden dat zure behandelingen nAg volledig ioniseerden, terwijl proteinase K het deeltjes deeltjesmatig ioniseerde. In tegenstelling behielden NaOH en TMAH nAg als intacte deeltjes met verwaarloosbare iondetectie. Grootteverdelingsanalyse toonde aan dat TMAH-behandeling een verschuiving veroorzaakte van 100 nm naar 120 nm en de verdeling verbreedde, wat aggregatie suggereert. NaOH-behandeling behield de oorspronkelijke 100 nm grootte, wat de geschiktheid bevestigt.

TMAH's neiging om de dielektrische constante te verhogen door ontbinding in trimethylamine en methanol kan het zeta-potentiaal van nAg verminderen, wat aggregatie bevordert. Korte (1 min) TMAH blootstelling behield echter de deeltjesgrootte (~100 nm), wat bevestigt dat verlengde behandeling verantwoordelijk is voor aggregatie.

Evaluatie van veelzijdigheid van NaOH voorbehandeling in diverse organen

Om NaOH's brede toepasbaarheid te bevestigen, pasten we het protocol toe op hart, long, milt en nier homogenisaten gespiked met nAg. Residuanalyse toonde >95% ontleding. sp-ICP-MS detecteerde het toegevoegde Ag als deeltjes in alle weefsels, met herwinningspercentages binnen de 80–120% range acceptabel volgens FDA standaarden. Deeltjesdiameters bleven dicht bij 100 nm over alle organen, wat de consistentie van de methode onderstreept.

Evaluatie van sp-ICP-MS voor kwantitatieve en fysieke eigenschapsanalyses van nAg en Ag⁺ in biologische weefsels

Om praktische relevantie te demonstreren, vergelijken we het lot van intraveneus toegediende nAg₁₀₀ versus Ag⁺ in muisbloed en lever. ICP-MS bevestigde Ag aanwezigheid in beide compartimenten voor beide behandelingen. Echter, sp-ICP-MS onthulde duidelijke speciatie: in bloed bestond Ag overwegend als ionen (>95%) ongeacht de toegediende vorm, terwijl in lever ~80% van Ag uit nAg₁₀₀ deeltjesmatig bleef, met minimale deeltjesaanwezigheid na Ag⁺ toediening. Deeltjesgrootteanalyse van lever nAg₁₀₀ toonde een gemiddelde diameter van ~80 nm, kleiner dan de toegediende 100 nm, wat partiële ionisatie en mogelijke transformatie in hepatisch weefsel reflecteert.

Conclusies

We hebben een geoptimaliseerd NaOH-voorbehandelingsprotocol vastgelegd dat accurate sp-ICP-MS analyse van zilvernano deeltjes in muisweefsels mogelijk maakt, met gelijktijdige kwantificatie en deeltjesgrootte-karakterisering. Toepassing van deze workflow op intraveneus toegediende nAg₁₀₀ en Ag⁺ onthulde dat nAg deeltjesmatig ioniseert in vivo, met ~80% deeltjesmatig in de lever en ~95% geïoniseerd in de bloedstroom. Deze bevindingen benadrukken het belang van rekening te houden met deeltjes-tot-ion conversie bij het beoordelen van ENP-biodistributie en kinetiek. De methode is breed toepasbaar op diverse weefsels en kan gebruikt worden in risicobeoordelingsstudies om ENP-blootstellingsdynamiek en biologische responsen te verhelderen.

Afkortingen

Ag

Zilver

Ag⁺

Zilverion

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

ENPs

Ingenieurde nanopartikelen

HCl

Zoutzuur

HNO₃

Salpeterzuur

ICP-MS

Geïnductief gekoppeld plasma-massa spectrometrie

nAg

Zilvernano deeltjes

nAg₁₀₀

100 nm nAg

nAg₃₀

30 nm nAg

nAg₇₀

70 nm nAg

NaOH

Natriumhydroxide

PBS

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

sp-ICP-MS

Enkel-deeltje ICP-MS

TEM

Transmissie-elektronenmicroscoop

TMAH

Tetramethylammoniumhydroxide