Optimalisatie en evaluatie van de voorbehandelingsmethode voor sp-ICP-MS om de distributie van zilveren nanodeeltjes in het lichaam te onthullen

Resultaten en discussies

Optimalisatie van deeltjesdetectie door sp-ICP-MS

Bij sp-ICP-MS-analyse is het belangrijk om per verblijftijd één of geen deeltje in de detector te introduceren. Als er meerdere deeltjes in de detector worden geïntroduceerd gedurende de verblijftijd, wordt de bruto massa van meerdere deeltjes beschouwd als de massa van een enkel deeltje [13]. Daarom moeten monsters voldoende worden verdund voor sp-ICP-MS-analyse. Daarentegen leidt sp-ICP-MS-analyse van een monster met een zeer lage concentratie ENP's tot onnauwkeurige deeltjesverdeling en gegevens over de grootte.

Om de relaties tussen de concentratie van nAg100 en het aantal gedetecteerde deeltjes te bepalen, hebben we de nAg100-voorraadoplossingen serieel verdund voor evaluatie door sp-ICP-MS. Het resultaat toonde aan dat het aantal gedetecteerde deeltjes theoretisch en lineair toenam in het relatief lagere Ag-concentratiegebied. Daarentegen was bij relatief hogere Ag-concentraties het aantal gedetecteerde deeltjes lager dan de theoretische waarde (figuur 1a). Deze gegevens gaven aan dat bij hogere Ag-concentraties meerdere deeltjes de neiging hebben om tijdens elke verblijftijd in de detector te worden geïntroduceerd, wat resulteert in een overschatting van de deeltjesgrootte. Het is dus noodzakelijk om het grootste aantal gedetecteerde deeltjes te bepalen dat niet verschilt van de theoretische waarde om de deeltjesgrootte nauwkeurig te beoordelen. Vervolgens hebben we het aantal gedetecteerde deeltjes afgetrokken van de theoretische waarde en het verschil uitgezet als de verticale as. De resultaten gaven aan dat er discrepanties in de schatting van de grootte optraden wanneer het aantal gedetecteerde deeltjes>   500 was. Dit suggereert dat het nodig is om ≤  500 deeltjes te detecteren tijdens de analysetijd (figuur 1b). Hoewel deze gegevens in een enkele proef werden verkregen, leverde het herhalen van het experiment dezelfde resultaten op (gegevens niet getoond).

Bepaling van het optimale aantal deeltjes per verblijftijd voor nauwkeurige sp-ICP-MS analyse. Een reeks nAg-oplossingen (600 fg/mL tot 2500  pg/mL) werd geanalyseerd door sp-ICP-MS. een Om de relatie tussen de concentratie van nAg100 en het aantal gedetecteerde deeltjes te bepalen, werden een curve voor de gedetecteerde deeltjes (ononderbroken lijn) en de theoretische waarden (stippellijn) uitgezet. b Het aantal gedetecteerde deeltjes dat van de theoretische waarde werd afgetrokken, werd op de verticale as uitgezet om het optimale deeltjesaantal te bepalen. Elk punt is het resultaat van een enkele proef (n = 1)

Om de analyseomstandigheden te valideren, hebben we nAg verdund met verschillende diameters (nAg30, nAg70, nAg100) om < 500 deeltjes per analysetijd te detecteren en hun diameters te evalueren. De sp-ICP-MS-analyse gaf aan dat de primaire diameters van nAg30, nAg70 en nAg100 respectievelijk 30,0 ± 1,2, 65,1 ± 0,6 en 97,4 ± 0,6 waren. Bovendien waren de hydrodynamische diameters bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS) respectievelijk 36,4 ± 1.6, 70,6 ± 1.7 en 101 ± 1.0, deze waarden zijn vergelijkbaar met die geschat door sp-ICP-MS. Deze bevindingen suggereren dat de sp-ICP-MS-omstandigheden geschikt waren voor het meten van de diameters van nanodeeltjes van verschillende groottes.

Optimalisatie van voorbehandelingsmethoden voor het detecteren van nAg in leverweefsel van muizen

Om de fysieke eigenschappen van ENP's in het lichaam te kwantificeren en te bepalen, is het noodzakelijk om de weefsels volledig te lyseren. Verder is het essentieel om de deeltjes en ionen die in het lichaam zijn verdeeld efficiënt terug te winnen zonder fysieke of chemische veranderingen in de deeltjes teweeg te brengen. We hebben vijf solubiliserende reagentia getest, NaOH, TMAH, HNO₃ , HCl of proteïnase K, en analyseerde de hoeveelheid en fysische eigenschappen door sp-ICP-MS om de voorbehandelingsstrategieën te optimaliseren met behulp van de lever als model [14,15,16,17,18].

Het leverhomogenaat werd gemengd met nAg100 om een ​​uiteindelijke Ag-concentratie van 100  ng/ml te verkrijgen, gevolgd door behandeling met elk solubiliserend reagens bij 37°C. Eerst evalueerden we de hoeveelheid weefselresidu als een indicator van weefseloplosbaarheid. Meer dan 90% van het weefsel werd opgelost door behandeling met NaOH, TMAH en proteïnase K, terwijl slechts 75% van het weefsel werd opgelost door HNO₃ en HCl-behandelingen (Fig. 2a). Aangezien bijna 80% van het weefsel uit water bestaat [19], HNO₃ , HCl- en PBS-behandelingen waren inefficiënt voor het oplossen van de onoplosbare weefselmatrix. Daarentegen loste behandeling met NaOH, TMAH en proteïnase K de onoplosbare matrix van weefsels efficiënt op, wat aangeeft dat ze geschikt zijn voor het nauwkeurig kwantificeren van nAg in het weefsel. Vervolgens analyseerden we de herstelsnelheid van elk deeltje en ion om de verandering in fysieke eigenschappen bij elke behandeling te evalueren. Sp-ICP-MS-analyse toonde aan dat nAg100 bijna volledig geïoniseerd was door behandeling met zure reagentia (HNO₃ en HCl) en gedeeltelijk geïoniseerd bij behandeling met proteïnase K. Dit suggereerde dat zure reagentia en proteïnase K de deeltjes oplosten en ze in ionen omzet. Daarentegen werd 100 ng/mL Ag, overeenkomend met de aanvankelijk toegevoegde hoeveelheid, gedetecteerd als deeltjes wanneer het weefsel werd behandeld met alkalische reagentia (NaOH en TMAH). Na alkalische behandelingen werden bijna geen ionen gedetecteerd (Fig. 2b), wat aangeeft dat NaOH en TMAH de fysieke eigenschappen van nAg behielden. Ten slotte evalueerden we de verdeling van de deeltjesdiameter in weefsels die met de verschillende reagentia waren behandeld, om de fysische eigenschappen in detail te analyseren. De gemiddelde deeltjesdiameter veranderde in 120 van 100 nm na TMAH-behandeling (Fig. 2c). Bovendien waren de deeltjes breder na TMAH-behandeling (figuur 2d), wat wijst op deeltjesaggregatie. Wanneer de weefsels daarentegen werden behandeld met NaOH, was de gemiddelde deeltjesdiameter bijna 100 nm, wat overeenkomt met de aanvankelijke deeltjesgrootte. Dit suggereert dat voorbehandeling met NaOH de optimale conditie is voor het detecteren van nAg100 in leverweefsels van muizen.

NaOH-voorbehandeling is de optimale methode voor het detecteren van nAg100 in muizenlever. Vijf solubiliserende reagentia werden gescreend als oplosmiddelen voor de voorbehandeling om de weefsels te lyseren (NaOH, TMAH, HNO₃ , HCl en proteïnase K). Het leverhomogenaat werd gemengd met nAg100-oplossing om een ​​uiteindelijke Ag-concentratie van 100  ng/ml te verkrijgen en behandeld met elk solubiliserend reagens bij 37°C. Na 3 u, a residupercentages in elke groep als indicator van weefseloplosbaarheid, b herstelpercentages (zwarte en witte balken vertegenwoordigen de snelheid van zilver gedetecteerd als respectievelijk deeltjes en als ionen), c gemiddelde deeltjesdiameters weergegeven in een staafdiagram, en d deeltjesgrootteverdeling getoond in een bijenwarmkaart werden geanalyseerd door sp-ICP-MS-analyse. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3)

TMAH-voorbehandeling is in verschillende onderzoeken op grote schaal gebruikt voor sp-ICP-MS-analyse. TMAH kan aggregatie van nAg100 induceren op basis van verschillende fysische eigenschappen zoals viscositeit en pH. Verder kan de diëlektrische constante verband houden met aggregatie. TMAH-behandeling gedurende 3 h kan de diëlektrische constante verhogen die wordt veroorzaakt door TMAH-ontleding in trimethylamine (TMA) en methanol [20]. Een toename van de diëlektrische constante brengt de zeta-potentiaal van nAg100, die omgekeerd evenredig is met de diëlektrische constante, tot bijna nul, wat resulteert in het verlies van elektrostatische afstoting tussen nAg en inductie van aggregatie. Behandeling van nAg100 met TMAH gedurende een korte tijd (1 min) resulteerde in een gemiddelde deeltjesgrootte van ongeveer 100 nm (gegevens niet getoond).

Evaluatie van de veelzijdigheid van NaOH-voorbehandeling in verschillende organen

Om de veelzijdigheid van NaOH-voorbehandeling voor het detecteren van nAg te evalueren, hebben we verschillende muisorganen (hart, long, nier en milt) behandeld met NaOH en sp-ICP-MS uitgevoerd voor deeltjesdetectie. Eerst evalueerden we de hoeveelheid weefselresidu als een indicator van weefseloplosbaarheid. Meer dan 95% weefseloplosbaarheid werd bereikt door NaOH-behandeling (figuur 3a). Bovendien werd Ag dat overeenkomt met de additieve hoeveelheden gedetecteerd als deeltjes (figuur 3b). Hoewel sommige herstelpercentages de 100% overschrijden, stellen de criteria van de Amerikaanse Food and Drug Administration dat een herstelpercentage van 80-120% voldoende betrouwbaar is [21]. Onze analyse is daarom betrouwbaar. Bovendien was de gemiddelde deeltjesdiameter van nAg die in elk orgaan werd gedetecteerd, bijna 100 nm, wat overeenkomt met de deeltjesgrootte van het toegevoegde nAg (figuur 3c, d). Deze onderzoeken suggereren dat voorbehandeling met NaOH ideaal is voor het detecteren van nAg, niet alleen in de lever van de muis, maar ook in het hart, de longen, de nieren en de milt van de muis.

NaOH-voorbehandeling is de optimale methode voor het detecteren van nAg100 in verschillende organen. Zoals in Fig. 2 werden de hart-, nier-, long- en milthomogenaten gemengd met nAg100 en geïncubeerd met NaOH-oplossing. Na 3 u, a residupercentages (zwarte en witte balken vertegenwoordigen de residupercentages in respectievelijk NaOH- of PBS-behandeling), b herstelpercentages (zwarte en witte balken vertegenwoordigen de snelheid van Ag gedetecteerd als respectievelijk deeltjes en als ionen), c gemiddelde deeltjesdiameters weergegeven in een bijenwarmdiagram, en d deeltjesgrootteverdeling getoond in een bijenwarmkaart werden geanalyseerd door sp-ICP-MS-analyse in elk weefselmonster. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3)

Alles bij elkaar genomen tonen onze resultaten aan dat voorbehandeling met NaOH de optimale voorbehandelingsstrategie is voor de kwantificering en analyse van fysische eigenschappen van nAg in dierlijke weefsels door sp-ICP-MS.

Evaluatie van sp-ICP-MS voor kwantitatieve en fysische eigenschappenanalyses van nAg en Ag ⁺ in biologische weefsels

nAg ioniseert in het lichaam of dat Ag ⁺ deeltjes in muisweefsel, hoewel de details van dit proces onduidelijk zijn. Daarom hebben we de praktische toepassing van de sp-ICP-MS geëvalueerd door zowel de hoeveelheid als de fysieke eigenschappen van Ag in het bloed en de lever van muizen te analyseren na een enkele intraveneuze toediening van nAg100 of Ag ⁺ . ICP-MS-analyse toonde aan dat Ag werd gedetecteerd in het bloed van zowel Ag ⁺ - en met nAg100 behandelde muizen (Fig. 4a). Bovendien werd Ag gedetecteerd in de lever van beide groepen (figuur 4b). Vervolgens analyseerden we de fysieke eigenschappen van Ag in elk monster. Omdat kleine hoeveelheden nAg werden gedetecteerd in het bloed van beide Ag ⁺ - en met nAg100 behandelde muizen, het meeste gedetecteerde Ag was in de ionvorm (Fig. 4c). In de levermonsters werd ongeveer 80% van Ag gedetecteerd als deeltjes in met nAg100 behandelde muizen, terwijl een kleine hoeveelheid nAg werd gedetecteerd in Ag ⁺ -behandelde muizen (Fig. 4d). Ten slotte evalueerden we de deeltjesgrootte in de lever van met nAg100 behandelde muizen met sp-ICP-MS, waaruit bleek dat de deeltjesgrootte ongeveer 80 nm was (figuur 4e). Deze gegevens suggereren dat Ag ⁺ toegediend in het bloed veranderde nauwelijks in deeltjes, en de fysieke eigenschappen van Ag ⁺ in het bloed en de lever zijn niet veranderd. Daarentegen was nAg100 toegediend aan het bloed gedeeltelijk geïoniseerd; 20% van Ag in de lever en het meeste Ag in het bloed waren in de ionvorm. Als gevolg van gedeeltelijke ionisatie was de gemiddelde diameter van de nAg in de leverweefsels kleiner dan die van de aanvankelijk toegediende deeltjes (80 vs 100 nm). Bijgevolg onthulde onze sp-ICP-MS-strategie voor het biologische monster dat in het bloed toegediende nAg100 werd verdeeld als deeltjes (ongeveer 80%) in de lever en als ionen (ongeveer 95%) in het bloed, terwijl de ICP-MS-methode kon evalueer alleen Ag-hoeveelheden en niet fysieke of chemische veranderingen in de deeltjes.

Gelijktijdige kwantificering en analyse van fysieke eigenschappen van intraveneus toegediende nAg100 en Ag ⁺ . nAg100 en Ag ⁺ werden intraveneus toegediend aan muizen (0,75 of 1,5 mg/kg). Na 24  uur werden hun levers en bloed verzameld. Alle monsters werden voorbehandeld met NaOH-oplossing. Ag-concentratie in a bloed en b lever werden gemeten met ICP-MS. nAg in c bloed en d lever werden gemeten met sp-ICP-MS. De gemiddelde diameter van de deeltjes die in de lever worden gedetecteerd, wordt weergegeven in e . De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SE (n = 3)