Laser-geassisteerde MAPLE-afzetting van antistof-gefunctionaliseerde upconversie nanodeeltjes verbetert celcultuurprestaties

Samenvatting

Een hoogpresterend celcultuursubstraat berust op een optimaal oppervlak dat celfunctie en communicatie ondersteunt. Recent werk toont aan dat genanostructureerde coatings celadhesie kunnen verbeteren, doch conventionele oplossingsgebaseerde methoden introduceren vaak verontreinigingen. Matrix-geassisteerde gepulste laserverdamping (MAPLE) biedt een schone, non-destructieve route om biopolymeren op diverse substraten af te zetten. In deze studie synthetiseerden we NaGdF4:Yb3+,Er3+ upconversie nanodeeltjes (UCNPs) en hun immunoglobuline-G (IgG) gefunctionaliseerde tegenhangers via een single-pot methode. De UCNPs vertonen een gemiddelde diameter van 50 ± 8 nm, en TEM-afbeeldingen bevestigen de aanwezigheid van IgG op hun oppervlakken. Met een 532 nm Nd:YAG laser (10 Hz) deponeerden we UCNPs—met en zonder IgG—op glasbodem cultuurschalen via MAPLE. Humane navelstreng endotheelcellen (HUVECs) werden vervolgens gezaaid op deze substraten en vergeleken met gelatine-gecoate glascontroles. Cellevensvatbaarheidstoetsen onthulden geen cytotoxiciteit, terwijl morfologische analyse verbeterde adhesie en proliferatie op beide UCNP-gecoate oppervlakken toonde. Deze bevindingen tonen aan dat MAPLE-gedeponeerde, antistof-gefunctionaliseerde UCNPs kunnen dienen als bio-compatibele, hoogpresterende coatings voor celcultuuraanwendingen.

Inleiding

Epitheele cellen bekleden de interne en externe oppervlakken van het menselijk lichaam, speelend een dubbele rol als fysieke barrière en actieve deelnemer in fysiologische processen zoals barrière-functie, signalering, en immuunverdediging [1]. In weefseltechniek is de interactie tussen cellen en substraatoppervlakken een cruciale determinant van celadhesie, morfologie, en functie. Traditionele eiwitcoatings—collageen, gelatine, fibronectine—zijn lang gebruikt om celhechting op glas of plastic oppervlakken te verbeteren. Recente vooruitgang toont aan dat genanostructureerde coatings celgedrag kunnen moduleren door topografische cues te bieden en de effectieve oppervlakte te vergroten, wat adhesie en proliferatie verbetert [2–4].

Upconversie nanodeeltjes (UCNPs) gedoopt met lanthanide-ionen, zoals NaGdF4:Yb3+,Er3+, vertonen efficiënte nabij-infrarood (NIR) excitatie en zichtbare of NIR-emissie, wat voordelen biedt voor diep-weefsel imaging en biosensing door lage fototoxiciteit en hoge fotostabiliteit [5–9]. Oppervlakte-functionalizatie van UCNPs met biomoleculen—avidine, DNA, antistoffen—heeft gerichte imaging, sensing, en cellabeling mogelijk gemaakt [19–21]. Echter, beperkt werk heeft antistof-gefunctionaliseerde UCNPs als oppervlaktecoatings voor celcultuur verkend.

Conventionele afzettingstechnieken (sol-gel, spindoop, dipcoating) lijden oncontroleerbare dikte, oplosmiddelresten, en potentiële denaturering van biomoleculen. Matrix-geassisteerde gepulste laserverdamping (MAPLE) omzeilt deze problemen door het doelmateriaal in een bevroren oplosmiddelmatrix in te sluiten; laserenergie wordt geabsorbeerd door de matrix, wat zachte overdracht van het materiaal op het substraat mogelijk maakt zonder directe ablatie van het biomolecuul [24,25]. MAPLE is toegepast in geneesmiddelafgifte, organische elektronica, en biomedische coatings [31–35], doch de impact op celcultuursubstraten blijft onderbelicht.

In dit werk rapporteren we de synthese van NaGdF4:Yb3+,Er3+ UCNPs en hun IgG-gefunctionaliseerde anlogen, gevolgd door MAPLE-afzetting op glasbodem cultuurschalen. Vervolgens evalueren we de biocompatibiliteit en invloed op humane navelstreng endotheelcel (HUVEC) gedrag, wat een fundament vormt voor toekomstige weefseltechniekaanwendingen.

Methoden/Experimenteel

Materialen

Alle reagentia waren analytische graad: Gd(NO3)3·6H2O (99,9%), Yb(NO3)3·5H2O (99,9%), Er(NO3)3·5H2O (99,9%), NaF (≥ 99%), vertakte polyethylenimine (PEI, Mw ≈ 800), anti-humaan IgG (Fab-specifiek, FITC-gelabeld), DAPI, Phalloidine-TRITC, en oplosmiddelen (ethyleenglycol, isopropanol). De materialen werden gekocht van Sigma-Aldrich, Fisher Scientific, en Caledon.

Synthese van UCNPs Met en Zonder IgG door een One-Pot Proces

UCNPs (NaGdF4:Yb3+,Er3+) werden gesynthetiseerd via een gemodificeerde hydrothermale route. In het kort, 720 mg Gd(NO3)3·6H2O, 170 mg Er(NO3)3·5H2O, 160 mg Yb(NO3)3·5H2O, en 20 mL ethyleenglycol werden gemengd in een drie-hals fles. 0,7 g PEI werd toegevoegd, gevolgd door druppelgewijze toevoeging van 336 mg NaF opgelost in 10 mL ethyleenglycol. Het mengsel werd verwarmd tot 200 °C onder stikstof en 6 uur teruggekoken. Het product werd verzameld door centrifugatie, gewassen met ethanol en water, en gedroogd bij 60 °C.

Voor IgG-functionalizatie werd 15 mg UCNP-poeder gedispergeerd in 15 mL gedestilleerd water, daarna 5 mL borate-gebufferde zoutoplossing (pH 8) en 20 µg IgG toegevoegd. Het mengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, daarna gewassen en gepelleteerd door centrifugatie. Het conjugaat, UCNPs-IgG, werd opgeslagen in waterige buffer.

Schematisch overzicht van one-pot synthese van UCNPs en UCNPs-IgG

Afzetting van UCNPs Met/Zonder IgG door MAPLE

MAPLE-afzetting werd uitgevoerd met een MAPLE 2000 systeem (PVD Products, Inc.) met een 532-nm Nd:YAG laser. De nanodeeltjesoplossing (1 gew.% in isopropanol) werd bevroren in een vloeistof-stikstof-gekoelde targethouder. Laserparameters: 10 Hz, 200 µs pulsbreedte, 150 mJ cm–2 fluence, 0,63 cm2 spotoppervlak. Glas substraten, voorbehandeld met 2 gew.% gelatine, werden op 4,5 cm van de target geplaatst en gehouden bij 25 °C onder 1 × 10–6 Torr. De target- en substraathouders roteerden met 10 rpm en 25 rpm, respectievelijk, tijdens een 2-uurs afzetting. De resulterende films werden gekarakteriseerd door EDX, FTIR, en fotoluminescentie (PL) spectroscopie.

Schematisch overzicht van MAPLE-afzetting van UCNPs en UCNPs-IgG

Materialen Karakterisering

Pre-afzetting UCNPs en UCNPs-IgG werden onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie (TEM, Philips CM-10, 80 kV). Fourier-transformatie infrarood (FTIR) spectren werden opgenomen op een Bruker Vector 22 (600–4500 cm–1, 4 cm–1 resolutie, 64 scans). PL-spectra werden gemeten met een QuantaMaster 40 spectrofluorometer (Horiba). Post-afzetting films werden geïnspecteerd door EDX (Hitachi S-3400 N met INCA PentaFET-x3) en confocal microscopie (Zeiss LSM 5 Duo). Cytocompatibiliteit werd geëvalueerd via MTT-toets op HUVECs gecultureerd gedurende 24 uur.

Celgedrag Studie

HUVECs (ATCC) werden gezaaid met ~1 × 10⁵ cellen per schaal op glas substraten (controle gelatine, UCNPs, UCNPs-IgG). Na 24 uur incubatie bij 37 °C, werden cellen gefixeerd met 4% formaline, gekleurd met Phalloidine-TRITC (actine) en DAPI (kernen), en gebeeld door confocal microscopie. Celoppervlakte, verbindingslengte, cellengte, en celtelling werden gekwantificeerd met ImageJ.

Cytotoxiciteitstoets

MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromide) werd toegevoegd aan het culturemedium na 24 uur, 3 uur geïncubeerd, en absorbantie gemeten bij 490 nm met een Bio-Tek EL340I lezer. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Resultaten en Discussie

Karakterisering van UCNPs en UCNPs-IgG Voor MAPLE-afzetting

TEM-afbeeldingen bevestigen de kubische morfologie van UCNPs met een gemiddelde diameter van 50 ± 8 nm. Hoog-resolutie TEM onthult een roosterruimte van 0,312 nm, corresponderend met het (111) vlak van kubische NaGdF4 (JCPDS 27-0697). Na IgG-conjugatie neemt de deeltjesgrootte toe tot 54 ± 8 nm, en het antistof-laagje (~10 ± 5 nm) is zichtbaar als een perifeer halo (Fig. 3b).

TEM-micrografiën van a UCNPs en b UCNPs-IgG voor MAPLE-afzetting

Poeder XRD toont karakteristieke pieken bij 32°, 37°, 54°, en 65° (111, 200, 220, 311), wat de kubische fase bevestigt (Fig. 4).

XRD-profiel van NaGdF4:Yb3+,Er3+ upconversie nanodeeltjes

FTIR-spectra onthullen aminepieken (1515 cm–1, 1511 cm–1) van PEI en IgG, –CH2–/C-C strekkingen (2987, 2900, 1400 cm–1), en carboxyl- en amidebanden (1249, 1650 cm–1) die IgG-hechting bevestigen (Fig. 5).

FTIR-spectra van UCNPs-IgG en UCNPs, respectievelijk, gemaakt door one-pot proces

Karakterisering van UCNPs Na MAPLE-afzetting

EDX-mapping van glas substraten gecoate met UCNPs en UCNPs-IgG bevestigt de aanwezigheid van Gd, Er, Yb, en F (Fig. 6a,b). PL-metingen tonen behouden groene (540 nm) en rode (650 nm) emissies onder 980 nm excitatie, met slechts kleine intensiteitsvariaties toeschrijfbaar aan oppervlaktedefecten of meetfouten.

EDX-spectra van a monsters na MAPLE-behandeling en b monsters zonder MAPLE-behandeling (kaal glas)

FTIR van de gecoate oppervlakken bevestigt verder de behoud van functionele groepen: de –OH-band bij 3648 cm–1 (IgG) verschijnt alleen in UCNPs-IgG (Fig. 7a), terwijl de amineband bij 1575 cm–1 zichtbaar is in UCNPs (Fig. 7b). De afwezigheid van deze banden in kaal glas (Fig. 7c) onderstreept de succesvolle afzetting van de nanodeeltjeslagen.

FTIR-spectra van kaal glas en glas gecoate met UCNPs-IgG en UCNPs, respectievelijk

Celgedrag op de Verschillende Coatings

Confocale afbeeldingen na 24 uur cultuur onthullen vergelijkbare celtellingen over alle oppervlakken, maar UCNPs-IgG oppervlakken vertonen grotere celspreiding, langere cytoplasmatische uitsteeksels, en verhoogde inter-cellulaire connectiviteit (Fig. 8). Kwantitatieve analyse toont 11,2% en 22,2% toename in celoppervlakte voor UCNPs en UCNPs-IgG, respectievelijk, ten opzichte van gelatine-controles; verbindingslengtes nemen toe met 12,5% en 17,5%; cellengtes groeien met 8,2% en 17,3%; en celtellingen stijgen met ~8% op nanodeeltjes-gecoate oppervlakken (Fig. 9). Deze metrics bevestigen dat zowel UCNPs als UCNPs-IgG endotheliale adhesie en spreiding verbeteren zonder cytotoxiciteit te induceren.

Confocale micrografiën van HUVECs op a controle, b UCNPs, en c IgG-gemodificeerde UCNPs

HUVECs gecultureerd op verschillende coatings: a celoppervlakte, b verbindingslengte, c cellengte, d celtelling

Effect van de Coating op Cellevensvatbaarheid

MTT-toetsen tonen >99% relatieve levensvatbaarheid op kaal glas, UCNPs, en UCNPs-IgG, wat de >85% norm voor biocompatibele materialen overschrijdt. De lichte toename in levensvatbaarheid (105% voor UCNPs, 104% voor UCNPs-IgG) suggereert een milde stimulerend effect van de nanodeeltjescoatings, waarschijnlijk door verbeterde oppervlakteruuwheid en eiwitadsorptie.

Cellevensvatbaarheid van HUVECs op kaal glas, UCNPs, UCNPs-IgG, en gelatine-gecoate controle

Conclusies

We hebben gedemonstreerd dat NaGdF4:Yb3+,Er3+ UCNPs en hun IgG-gefunctionaliseerde tegenhangers in een single-pot hydrothermaal proces gesynthetiseerd en op glas cultuurschalen gedeponeerd kunnen worden door MAPLE zonder hun structurele of fotoluminescente integriteit te compromitteren. TEM, FTIR, XRD, en EDX bevestigen succesvolle synthese, conjugatie, en afzetting. Biocompatibiliteitstoetsen onthullen geen cytotoxiciteit, terwijl confocal microscopie verbeterde adhesie, spreiding, en inter-cellulair netwerken van HUVECs op nanodeeltjes-gecoate oppervlakken toont. Deze bevindingen positioneren MAPLE-gedeponeerde, antistof-gefunctionaliseerde UCNPs als veelbelovende, lage-verontreinigingscoatings voor geavanceerde weefseltechniek en regeneratieve geneeskunde platforms.

Afkortingen

DAPI:

4′,6-Diamidine-2′-fenylindole dihydrochloride

EG:

Ethyleenglycol

HUVEC:

Humane navelstreng endotheelcellen

IgG:

Immunoglobuline G

MAPLE:

Matrix-geassisteerde gepulste laserverdamping

PEI:

Polyethylenimine

Phalloidine-TRITC:

Phalloidine-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate

UCNPs:

Upconversie nanodeeltjes