pH-Getriggerde Ferritine Nanodrager Laat Gecontroleerde Resveratrol-Afgifte Toe voor Gerichte Tumorchemotherapie

Samenvatting

In dit rapport presenteren we een pH-geïnduceerd reversibel assembliesysteem (PIRAS) gebaseerd op ferritine (Ft) voor gerichte tumortherapie. Het is ontwikkeld om de anticancerdrug resveratrol (RV) gemakkelijk te laden en vrij te geven, gebaseerd op de natuurlijke pH-gevoeligheid en unieke holle holte van Ft. Een tumor-specifiek target-peptide Arg-Gly-Asp (RGD) geconjugeerd op het oppervlak van RV-geladen Ft (RV@Ft), om biokompatibele nanopartikelen (RV@Ft-RGD) te vormen. De pH-gevoeligheid van Ft stelt het in staat om onder zuure omstandigheden te denatureren in een holle porieuze nanosphère en onder neutrale omstandigheden te hernatureren in een afgedichte holle nanosphère. Met pH-manipulatie toonde RV@Ft-RGD, met een diameter van ~21 nm, een hoge RV-ladingsratio van 79,6%. pH-getriggerde RV-vrijgave werd vervolgens gemeten op een ratio van 50,3% bij pH 5,0 over 24 uur. Onder neutrale condities toonde RV@Ft-RGD uitstekende stabiliteit over 20 dagen. Confocal-fluorescentie-imaging toonde aan dat RV@Ft-RGD een hoge celopname had en co-lokalisatie met de lysosoom, voornamelijk door het RGD-gemedieerde target-effect. Gebaseerd op de hoge medicijnlading, pH-getriggerde vrijgave en tumorcel-targeteffect, toonde RV@Ft-RGD geweldige cel-dodende capaciteit in vitro en in vivo. De biokompatibiliteit in vitro en in vivo werd ook aangetoond als uitstekend, zonder systemische toxiciteit. Het ontwerpconcept van PIRAS gebaseerd op Ft remt tumorgroei significant en verbreekt tegelijkertijd de toepassing van Ft in nanomedicine verder.

Inleiding

Longkanker is een van de dodelijkste solide maligniteiten bij mensen. Met de verergering van het milieu en andere factoren, neemt de incidentie van longkanker jaarlijks toe, en de 5-jaar-overlevingscijfer is slechts 17,4%. Op dit moment, hoewel traditionele klinische behandelingen zoals chirurgische resectie, stralingstherapie en standaard eerste-lijn chemotherapie beschikbaar zijn, moet de mediaan algemene overleving van longkankerpatiënten nog verbeterd worden. Daarom moeten effectievere en veiligere behandelingen dringend worden ontwikkeld om deze dodelijke ziekte te genezen. Momenteel, hoewel lage target-effecten en hoge bijwerkingen van veel chemotherapeutische middelen hun nut in chemotherapie hebben beperkt, worden nieuwe chemotherapeutische middelen constant ontwikkeld, vooral in het opkomende veld van nanodrugs. Resveratrol (RV) is een extract van natuurlijke planten zoals druiven en sojabonen, die breed klinisch worden gebruikt om trombocytenaggregatie te bevorderen, vasodilatatie te remmen, bloedviscositeit te verminderen, enz. In de afgelopen jaren is ook ontdekt dat het een sterke antikankereffect heeft. Echter, als potentieel kleinmoleculaire drug, heeft RV ook nadelen als andere eerste-lijn chemotherapeutische middelen — zoals slechte oplosbaarheid, korte halfwaardetijd van bloedsomloop en gebrek aan tumorselectiviteit. RV-gebaseerde nanodrugs zijn in de afgelopen jaren ontwikkeld om deze tekortkomingen te overwinnen en de therapeutische effecten te verbeteren. Verschillende soorten nanodragers zijn gebruikt om RV te laden, waaronder liposomen, serumalbumine, koolstofmaterialen, tweedimensionale overgangsmetaaldichalcogeniden (2D-TMDs) en anderen. Hoewel deze nanodragers gerapporteerd zijn om de therapeutische effecten van RV efficiënt te verbeteren, tonen ze nog steeds tekortkomingen — zoals hoge-efficiënte actieve trigger-vrijgave capaciteit voor liposomen en serumalbumine, en potentiële langdurige systemische toxiciteit voor koolstofmaterialen en 2D-TMDs. Er is dus nog steeds vraag naar meer gekwalificeerde nanodragers.

Ferritine is een natuurlijk nanokaagje-eiwit met een lumen van ongeveer 8 nm, gevormd door de interactie en assemblage van 24 subeenheden van zware en lichte ketens. Omdat het een endogeen eiwit is, heeft ferritine uitstekende biokompatibiliteit en veiligheid. Bovendien is er een rapport dat ferritine een natuurlijk pH-gevoelig eiwit is dat reversibel gedeneatureerd en herassembleerd kan worden naarmate de omgeving verandert van zuur naar alkalische condities. Toen de pH zuur was, herstelden de gedissocieerde staart-achtige oligomeren alleen tot de koptelefoon-vormige structuur, en de gedissocieerde koptelefoon-vormige intermediairen herstelden alleen tot de holle spherische structuur. Dit unieke pH-getriggerde assemblage- en dissociatiegedrag maakt ferritine een ideaal medicijnafgifte-systeem. Onlangs rapporteerden Zhang et al. dat doxorubicinen (DOX) moleculen in ferritine geencapsuleerd kunnen worden en succesvol vrijgegeven door pH-regulatie voor tumortherapie.

In deze studie wilden we een ferritine-gebaseerd pH-geïnduceerd reversibel assembliesysteem (PIRAS) ontwikkelen om RV-lading en -vrijgave te controleren voor verbeterde tumor-targetende chemotherapie. Het oppervlak van de ferritine-sfeer werd gekoppeld met het tumor-targeterende peptide RGD. De resulterende nanodrug RV@Ft-RGD werd aangetoond stabiel in neutrale en alkalische omgevingen (pH > 7,4), en RV alleen vrij te geven in zuure omgevingen (pH < 7,4). Bij nader karakterisering toonde RV@Ft-RGD de volgende voordelen in vitro en in vivo: (1) RV@Ft-RGD targette tumorcellen en accumuleerde in de lysosoom (zure omgeving), wat de vrijgave van meer RV in het cytoplasma vergemakkelijkte; (2) de ferritine-drager verlengde de bloedhalfwertetijd van vrij RV significant, wat de medicijnretentie in de systemische circulatie verbeterde om de accumulatie van medicijnen in tumorplaatsen te faciliteren; (3) de architecturale stabiliteit van ferritine verhinderde RV-burstlek tijdens het leveringsproces; (4) RV@Ft-RGD toonde geweldige in vitro en in vivo biokompatibiliteit. Daarom, dankzij deze merieten, vertoonde RV@Ft-RGD voortreffelijke antitumor-therapeutische eigenschappen, wat groot potentieel toont voor toekomstige klinische vertalingen.

Materialen en Methodes

Materialen

Ferritine, resveratrol (RV, ≥99%) waren van Sigma-Aldrich. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) en fluoresceïne-isothiocyaanate (FITC) werden gekocht van Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD (Shanghai, China). NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD werd gekocht van Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Hunan, China). DMEM-celmedia, foetaal kalvesserum (FBS) en fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) werden verkregen van Invitrogen (Carlsbad, CA, VS). Cel-telkit-8 (CCK-8) werd geleverd door Dojindo Laboratories (Japan).

Synthese van RV@Ft-RGD

De RV-lading werd bereid zoals beschreven volgens eerdere rapporten met wijzigingen. Ten eerste werd NH₂-PEG₂₀₀₀-RGD (10 mg) verdeeld in de Ft-oplossing (1,5 mg/mL) in de aanwezigheid van 20 μL EDC (5 mg/mL) en 20 μL NHS (20 mg/mL). Het mengsel werd 2 uur bij 4 °C gereageerd met licht roeren, en gezuiverd door dialyse tegen gedestilleerd water (MW afsnij = 5 kDa) overnachten, resulterend in Ft-RGD-nanopartikelen. Vervolgens werd water-onoplosbaar RV opgelost in DMSO tot 2 mg/mL en toegevoegd aan de Ft-RGD-oplossing met een finale concentratie van 1,5 mg/mL. De pH van het mengsel werd ingesteld op pH = 5 om de polypeptiedsubeenheden te dissociëren. Daarna werd de pH van het mengsel langzaam aangepast tot 7,4 met natriumhydroxide (1 M) om de polypeptiedsubeenheden te herassembleren. De resulterende oplossing werd overnachten gedialyseerd in gedestilleerd water om vrije RV-moleculen te verwijderen om het eindproduct (RV@Ft-RGD) te zijn. De hoeveelheid geladen RV werd gedetecteerd door UV-vis-spectrofotometer (UV3100, Shimadzu, Japan) door de absorptiepiek bij 306 nm te monitoren. RV-ladingsratio was (A_a − A_b)/A_c, waar A_a, A_b en A_c het gewicht van de initiële, niet-geladen RV en Ft-RGD respectievelijk vertegenwoordigen.

Karakterisaties

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) methode (BI-9000AT, Brookhaven, VS) werd gebruikt om de grootte en zetapotentiaal van de nanopartikelen te detecteren. De morfologie van de nanopartikelen werd waargenomen door een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM, JEM-100S, JEOL, Japan). Fluorescentiespectra werden gedetecteerd door een Perkin-Elmer LS50B luminescentiespectrofotometer. Cellulaire fluorescentiesignalen werden geregistreerd door de commerciële laserscannermicroscoop (LSM 510, Zeiss, Duitsland) en Stroomcytometrie (FCM, EPICS XL, Beckman, VS).

RV-Vrijgave Studie

Vijfhonderd microliter RV@Ft-RGD-oplossing werd in een D-buiskje (MWCO 6–8 kDa, Novagen) geplaatst, en de oplossing werd aangepast tot verschillende pH-waarden via verschillende buffers. De oplossing werd vervolgens gedialyseerd bij 37 °C. Na verschillende incubatietijden werden 1 mL aliquoten van dialysaat verwijderd en vervangen door 1 mL vers medium. De RV die op verschillende incubatietijden vrijgekomen was, werd bepaald door een UV-vis-spectrofotometer. Daarnaast werd RV@Ft-RGD opgelost in een spoeloplossing met verschillende pH-condities, waaronder pH 5, 6,5, 7,4 en 8,5. Na incubatie bij 37 °C gedurende 24 uur, werd de grootte van de nanopartikelen gekarakteriseerd door DLS.

Celcultuur

Humane longkankercellen A549 en NCI-H358 werden verkregen van Celverzameling van Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China), en gecultiveerd in DMEM-medium met 10% foetaal kalvesserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS) in een verzadigde atmosfeer met 5% CO₂ bij 37 °C.

Cellulaire Opname en Localisatie van RV@Ft-RGD

Als veelgebruikte methode werd FITC toegepast om de nanopartikelen te labelen. FITC werd opgelost in ethanoloplossing (2,0 mg/mL) en gemengd met RV@Ft en RV@Ft-RGD waterige oplossing (1,0 mg/mL) onder 4-uurs roeren in donkere omgeving bij kamertemperatuur. Het mengsel werd overnachten gedialyseerd in gedestilleerd water om overbodige FITC en ethanol te verwijderen, resulterend in FITC-gelabelde RV@Ft en RV@Ft-RGD-oplossing. Om de organellocalisatie van nanopartikelen in vitro te bevestigen, werden cellen behandeld met FITC-gelabelde RV@Ft en RV@Ft-RGD gedurende 5 uur en gekleurd door lysosoom-specifieke kleurstof Lyso Tracker Red (Invitrogen). Daarna werd de cellulaire internalisatie van RV@Ft en RV@Ft-RGD waargenomen door een CLSM. In het kort, A549-cellen werden geïncubeerd met FITC-gelabelde RV@Ft en RV@Ft-RGD (met dezelfde concentratie FITC) gedurende 5 uur. Vervolgens werden de cellen behandeld met Lyso Tracker Red-oplossingen (100 nM) bij 37 °C gedurende 30 min. Na wassen met PBS drie keer, werden de cellen waargenomen door een commerciële laserscannermicroscoop. ImageJ-software werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van cellen te analyseren.

In Vitro Tumorchemotherapie en Apoptose Studie

Allereerst werd de cytotoxiciteit van de drager Ft-RGD geëvalueerd door een standaard CCK-8-assay (Bestbio, China). A549- en NCI-H358-cellen (1 × 10⁵ cellen/mL, 0,5 mL) werden gezaaid in 96-putplaat en gecultiveerd gedurende 24 uur. Na het weggooien van de oude media, werden verse media met 0, 0,01, 0,1, 0,5 en 1 mg/mL Ft-RGD geïncubeerd met A549- en NCI-H358-cellen gedurende 24 uur. De cellen werden zachtjes drie keer gewassen met PBS. Honderd microliter CCK-8-werkoplossing (10% CCK-8 + 90% DMEM) werd toen aan elke put toegevoegd en 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Absorptiewaarden bij 450 nm werden gemeten met een microplaatspectrofotometer (Multiskan FC, Thermo Scientific). Foto's van elke groep cellen werden waargenomen met een optische microscoop (Olympus).

Verschillende concentraties van vrij RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD en RV@Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30 en 40 μg/mL RV-equivalenten) werden behandeld met A549-cellen. Na 24 uur incubatie werd de levensvatbaarheid van behandelde cellen geanalyseerd door CCK-8-assay. Tegelijkertijd werden deze behandelde cellen dubbel gekleurd door apoptose-detectiekit (Annexin V-FITC/PI) en geanalyseerd door FCM.

Circulatie Tijd van RV@Ft-RGD in Bloed

Vrij RV of RV@Ft-RGD (6 mg/kg RV-equivalent) werd intraveneus geïnjecteerd in gezonde Balb/c naakte muizen (n = 5 per groep). Na de injectie werd het veneuze bloed van de muizen op verschillende tijdstippen verzameld en in een bloedverzamelbuis met heparine geplaatst, en vervolgens het plasma gescheiden. De RV-concentratie in plasma werd geëxtraheerd door gezuurde isopropanol-reagens, en vervolgens de absorbantie bij 306 nm excitatie gemeten om de concentratie van RV te bepalen.

Diermodel en In Vivo Tumorchemotherapie

Balb/c-muizen (4–6 weken oud) gebruikt in dit werk werden gekocht van Charles River Laboratories (Peking, China). Alle operaties met dierproeven zijn strikt in overeenstemming met de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. De richtlijn was goedgekeurd door het Dierenzorg- en Gebruikscomité van Zhengzhou Universiteit. Om een subcutaan tumormodel van A549 te vestigen, werden 2 × 10⁶ A549-cellen subcutaan in de rug van de muizen geïnjecteerd. Ze werden vervolgens 7 tot 9 dagen in de dierenopvang geplaatst. De tumorvolume-berekeningsformule is lengte × breedte²/2.

Muizen met A459-tumoreren werden willekeurig verdeeld in vijf groepen. Elke groep bestond uit vijf muizen. De specifieke groeperingen zijn controle (fysiologische zoutoplossing), RV, RV@Ft en RV@Ft-RGD. Aan het begin van de behandeling werd het monster eenmaal per dag door staartvleugel geïnjecteerd gedurende drie opeenvolgende dagen. Tumorvolume en muizenlijfsgewicht werden elke 5 dagen vastgelegd. Na 45 dagen behandeling werden tumoren van elke groep verzameld. Tumorweefsels werden vastgelegd in 10% formalineoplossing, gesneden en vervolgens onderworpen aan hematoxyline-eosine (H&E)-kleuring.

In Vivo Biokompatibiliteit

Tweehonderd microliter RV@Ft-RGD werd geïnjecteerd in gezonde Balb/c-muizen via staartvleugel (RV-dosis was 15 mg/kg). Gezonde muizen geïnjecteerd met fysiologische zoutoplossing op dezelfde manier werden gebruikt als blanco-controlegroep. Op dagen 0, 10 en 45 na injectie werd muizenbloed verzameld voor evaluatie van celtellingen inclusief witte bloedcellen (WBC), rode bloedcellen (RBC), hemoglobine (HGB) en gemiddeld bloedplaatje-volume (MPV), gemiddeld rodebloedcel-hemoglobine (MCH), hematocriet (HCT), gemiddeld rodebloedcel-hemoglobineconcentratie (MCHC), gemiddeld rodebloedcel-volume (MCV) en bloedplaatjes (PLT). Daarnaast werden hart, lever, milt, long en nier weefsels van elke groep verzameld voor H&E-kleuring op de 45e dag.

Statistische Analyse

Data werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (s.d.). Statistische analyse van de monsters werd uitgevoerd met Student's t-toets, en p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisaties van RV@Ft-RGD

RV-lading en -vrijgave van RV@Ft-RGD werd uitgevoerd via de pH-geïnduceerde reversibele dissociatie en herassemblage van Ft (Fig. 1). Ten eerste werd ferritine geconjugeerd met het tumor-targeterende peptide RGD om Ft-RGD te vormen. Dit werd vervolgens heropgelost in een acetaatbuffer (pH = 5) om de polypeptiedsubeenheden te dissociëren en een holle porieuze sfeer te vormen. RV-moleculen werden toen toegevoegd en toegelaten in de holte te binnendringen, waarna de oplossing langzaam werd aangepast tot pH ≈ 7,4 om Ft te herassembleren, de RV-moleculen in de afgedichte Ft-holte te vangen. Wanneer de pH van de buffer vervolgens werd verlaagd tot ~5, openden de nanopartikelporiën reversibel en gaven ze hun RV-moleculen vrij. Figuur 2a en Bijlage 1: Figuur S1 tonen de SEM- en TEM-afbeeldingen van de geassembleerde RV@Ft-RGD, die een sferische structuur vertoonden. Volgens DLS-analyse hadden RV@Ft-RGD-deeltjes grotere diameters (~22,5 nm) vergeleken met rauwe Ft-nanopartikelen (~11,8 nm) (Fig. 2b) en hadden vergelijkbare zetapotentialen als rauwe Ft-nanopartikelen (−29,6 mV) (Fig. 2c). Na 20 dagen toonde de polyverspreidingsindex (PDI) van RV@Ft-RGD in water, FBS, celmedia en PBS geen significante verandering (Fig. 2d), wat aangeeft dat RV@Ft-RGD opmerkelijke colloïdale stabiliteit had. Figuur 2e toont de absorptiespectra van vrij RV, Ft-RGD en RV@Ft-RGD. Zoals te zien is, vertoonde het absorptiespectrum van RV@Ft-RGD een nieuwe piek bij 306 nm (afkomstig van RV) in vergelijking met die van RV en Ft-RGD, wat de succesvolle lading van RV aangeeft. Bovendien toonde RV@Ft-RGD een vergelijkbare significante emissiefluorescentie als vrij RV bij 400 nm, wanneer geëxciteerd door een 325 nm laser (Fig. 2f).

Medicijnlading en -vrijgave

De maximale laadcapaciteit van Ft-RGD werd gevonden op 252,6%, waarschijnlijk door de grote holte binnen de holle Ft-RGD. Aangezien Ft pH-gevoelig is, konden we de RV-laadcapaciteit onder verschillende pH-condities karakteriseren. Zoals getoond in Fig. 3a, met de toename van pH van 5,0 tot 8,5, daalde de RV-laadefficiëntie dramatisch. RV-vrijgave uit het complex werd ook gekarakteriseerd onder verschillende pH-waarden van 5,0 tot 8,5. Een pH-waarde- en tijd-afhankelijk RV-vrijgaveprofiel werd opgebouwd uit deze data en getoond in Fig. 3b. De maximale medicijnvrijgaveratio (51,6%) gebeurde bij pH = 5,0 gedurende 24 uur, wat hoger was dan bij pH = 6,5, 7,4 en 8,5. Volgens gerelateerde rapporten zijn pH-waarden van 5,0, 6,5 en 7,4 die typisch in cellysosomen, tumorweefsels, bloed en de normale fysiologische omgeving respectievelijk. Onder fysiologische conditie (pH 7,4) bleef de RV-medicijninhoud van RV@Ft-RGD hoog zelfs na 50 uur (Fig. 3c), wat suggereert dat de RV in RV@Ft-RGD stabiel is en niet gemakkelijk lekt. Daarnaast onderzochten we de verandering in diameter van RV@Ft-RGD onder verschillende pH-condities. Na incubatie bij 37 °C gedurende 12 uur toonde DLS-analyse dat de diameter van RV@Ft-RGD bijna constant was, rond 23 nm bij pH 8,5 en 7,4. Toen de pH-waarde daalde tot 6,5 en 5,0, nam de diameter van RV@Ft-RGD toe tot 25 nm en 28,6 nm respectievelijk (Fig. 3d). Deze resultaten bevestigen het gedrag van pH-geïnduceerde reversibele dissociatie en herassemblage van RV@Ft-RGD, wat gunstig is voor controleerbare medicijnlading in vitro en medicijnvrijgave in tumorweefsel.

In Vitro Cellulaire Opname en Localisatie

In vitro cellulaire opname en localisatie van RV@Ft-RGD werd vervolgens geëvalueerd. Ten eerste werden RV@Ft en RV@Ft-RGD gelabeld door FITC via waterstofbinding-interactie en fysische adsorptie. Zoals getoond in Fig. 4a, toonden vrij FITC-behandelde cellen verwaarloosbare cytoplasmatische fluorescentiesignalen. RV@Ft-RGD-behandelde cellen, in tegenstelling, vertoonden intense FITC-groene fluorescentie, die hoger was dan die van RV@Ft-behandelde cellen. Opvallend toonden RV@Ft-RGD-behandelde en RGD-vooraf-behandelde cellen beide lage groene fluorescentie. Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat RV@Ft-RGD in hoge hoeveelheden door cellen werd opgenomen, waarschijnlijk door een RGD-gemedieerd actief target-effect. Deze behandelde cellen werden ook geanalyseerd door FCM, de resultaten waarvan in Fig. 4b getoond worden. Cellulaire fluorescentie-intensiteit statistische resultaten suggereren een vergelijkbare conclusie.

Om de organellocalisatie van RV@Ft-RGD te bestuderen, werd een lysosoom-specifieke kleurstof (Lyso Tracker Red) gebruikt om de cellen geïncubeerd met de nanopartikelen te kleuren. Zoals te zien in Fig. 4a, toonde het cytoplasma sterke rode fluorescentie in alle groepen. Na samenvoegen met FITC-groene fluorescentie, vertoonde RV@Ft-RGD de meest intense gele (groen + rode) fluorescentie in het cytoplasma onder deze groepen. Op basis van statistische analyse had de RV@Ft-RGD-behandelde groep de hoogste co-lokalisatiecoëfficiënt tussen FITC- en Lyso Tracker Red-fluorescentie (Fig. 4c). Deze resultaten geven aan dat RV@Ft-RGD actief in cellen kan binnendringen en vervolgens worden overgebracht in de zuur omgeving van de lysosoom (pH ≈ 5,0). Deze merieten, samen met de pH-responsieve medicijnvrijgave, voorzien RV@Ft-RGD van veel potentiële toepassingen voor in vivo tumortherapie.

In Vitro Biokompatibiliteit en Tumortherapie

Voordat de antitumor-eigenschappen van RV@Ft-RGD bestudeerd werden, werd de cytotoxiciteit van de Ft-RGD-drager onderzocht. Zoals getoond in Fig. 5a en Bijlage 1: Figuren S2 en S3, toonde Ft-RGD geen duidelijke levensvatbaarheidsonderdrukking van longkanker A549-cellen en NCI-H358-cellen bij concentraties tot 1 mg/mL. Celmorfologie vertoonde ook geen significante verandering toen de 1 mg/mL behandelde cellen vergeleken werden met de controlegroepen (Fig. 5b), wat duidelijk suggereert dat Ft-RGD als drager uitstekende biokompatibiliteit had. Zoals getoond in Fig. 6a, b, doden vrij RV, RV@Ft en RV@Ft-RGD allemaal de cellen op een concentratie-afhankelijke manier. RV@Ft-RGD-behandelde cellen toonden meer levensvatbaarheidsafname en hadden slechts 11,2% cellevensvatbaarheid in 40 μg/mL groepen, wat lager was dan RV@Ft en RV@Ft-RGD + RGD vooraf-behandelde groepen. Een voorlopige studie met FCM onthulde verder dat met RV alleen, RV@Ft of RV@Ft-RGD, de meerderheid van de celdoden gemedieerd werd via apoptose (Fig. 6c). Deze resultaten tonen aan dat het tumorcel-dodende effect van RV aanzienlijk werd verbeterd door laden in Ft-RGD, voornamelijk door de verhoogde accumulatie van RV@Ft-RGD in de lysosoom, waar zuur pH-conditie een verhoogde vrijgave van apoptose-bevorderende RV in het cytoplasma triggerde.

Bloed Halfwaardetijd van RV@Ft-RGD

RV-concentratie in bloedplasma op verschillende tijden na injectie werd bestudeerd in vrij RV en RV@Ft-RGD-behandelde groepen respectievelijk. Zoals getoond in Fig. 7a, was de bloedhalfwaardetijd van RV@Ft-RGD 5,1 ± 0,23 uur. Vrij RV had een snellere uitwassing uit de circulatie, met een bloedhalfwaardetijd van slechts 0,43 ± 0,11 uur. De significant verlengde halfwaardetijd van RV@Ft-RGD in het bloed is gunstig voor het verbeteren van medicijnretentie in de systemische circulatie en vergemakkelijkt de accumulatie van medicijnen op tumorplaatsen.

In Vivo Antitumor Effect en Systemische Toxiciteit van RV@Ft-RGD

Figuur 7b toont de tumor groeiprofiel van tumor-dragende muizen met verschillende behandeling, uitgedrukt als relatief tumorvolume. Tumor groei werd tot enige mate geremd bij behandeling met RV@Ft, waarschijnlijk door de lage opname van RV@Ft. Echter, in de groep behandeld met RV@Ft-RGD, werd tumor groei significant onderdrukt vergeleken met de andere groepen (controle, RV, RV@Ft en RV@Ft-RGD + RGD). Tijdens de behandeling was er geen opvallende verlies van lichaamsgewicht in enige experimentele groep (Fig. 7c), wat de hoge bio-veiligheid van RV@Ft-RGD aangeeft. Na het einde van de behandelingsperiode werd H&E-kleuring van tumorweefsel in deze groepen uitgevoerd om de chemotherapeutische effecten te onderzoeken. Zoals getoond in Fig. 7d, werd een groot gebied van apoptose waargenomen in tumoren behandeld met RV@Ft-RGD, wat in significant contrast is met slechts een klein gebied van apoptose in tumoren behandeld met vrij RV, RV@Ft en RV@Ft-RGD + RGD. Daarnaast werd de systemische toxiciteit van RV@Ft-RGD ook geëvalueerd in normale muizen. Hele bloedmonsters van fysiologische zoutoplossing en RV@Ft-RGD-behandelde gezonde muizen werden verzameld op 0, 10 en 45 dagen na injectie voor bloedanalyse. Zoals getoond in Fig. 8a, b, toonden de complete bloedtellingen (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT en MCHC) van RV@Ft-RGD-geïnjecteerde muizen geen significante verschillen van dag 0 tot 45 dagen. De hooforganen van gezonde muizen behandeld met fysiologische zoutoplossing en RV@Ft-RGD werden ook verzameld op 45 dagen voor H&E-kleuring. Geen duidelijke bijwerkingen werden gevonden in deze weefsels (Fig. 8c), wat verwaarloosbare langdurige nadelige toxiciteit suggereert. Al deze resultaten tonen de veelbelovende potentie van RV@Ft-RGD voor verbeterde kankerchemotherapie in vivo.

Conclusie

Samengevat, hebben we met succes een pH-geïnduceerd reversibel assembliesysteem (PIRAS) ontwikkeld met pH-controleerbare lading en vrijgave van het antitumor RV-medicijn voor verbeterde tumor-targetende chemotherapie. Onder zuure conditie (pH = 5,0) kan het systeem dissociëren en RV laden of vrijgeven, terwijl onder neutrale conditie (pH = 7,4) RV@Ft-RGD hoogstabiel is en verwaarloosbare medicijnlek vertoont. Door het RGD-gemedieerde target-effect kan RV@Ft-RGD in hoge concentraties door A549-cellen worden opgenomen en accumuleren in de lysosoom, wat gunstig is voor RV-vrijgave zowel in vitro als in vivo. Vanwege de accumulatie van RV@Ft-RGD in de lysosoom, en zuur lysosoom's pH-triggerende vrijgave van RV in het cytoplasma, toonde RV@Ft-RGD uitstekende tumorcel-dodende en apoptose-bevorderende effecten vergeleken met vrij RV. Daarnaast, na de lading van RV in Ft-RGD, toonde RV@Ft-RGD een veel langere bloedhalfwaardetijd dan die van vrij RV. In vivo resultaten tonen aan dat RV@Ft-RGD opmerkelijke tumoronderdrukking toont en geen opvallende systemische toxiciteit. Deze studie suggereert dat Ft-gebaseerd PIRAS hoogst efficiënt is in medicijnlading en -vrijgave voor verbeterde antikankertherapie.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De conclusies in dit manuscript zijn gebaseerd op de data die allemaal gepresenteerd en getoond worden in dit papier.

Afkortingen

BSA:

Bovine serumalbumine

CCK-8:

Cel-telkit-8

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

FBS:

Foetaal kalvesserum

FITC:

Fluoresceïne-isothiocyaanate

Ft:

Ferritine

HCT:

Hematocriet

HGB:

Hemoglobine

MCH:

Gemiddeld korpuskel-hemoglobine

MCHC:

Gemiddeld korpuskel-hemoglobineconcentratie

MCV:

Gemiddeld korpuskel-volume

MPV:

Gemiddeld bloedplaatje-volume

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PIRAS:

pH-geïnduceerd reversibel assembliesysteem

PLT:

Bloedplaatje

RBC:

Rode bloedcellen

RGD:

Arg-Gly-Asp

RV:

Resveratrol

WBC:

Witte bloedcel