Thiacalix[4]arenen tegenwerken zink-geïnduceerde remming van uteriene myosine ATPase-activiteit

Samenvatting

Zink is essentieel voor cel-functie, maar concentraties boven 5 mM onderdrukken merkbaar de ATPase-activiteit van uteriene myosine S1, wat gladde-spiercontractiliteit beeinträchtigt. We kwantificeerden deze remming, wat een 1,6-voudige daling in V_max (38 ± 7 → 22 ± 6 nmol Pi min⁻¹ mg⁻¹) toonde terwijl K_m onveranderd bleef (0,49 ± 0,15 → 0,38 ± 0,12 mM). Twee wateroplosbare thiacalix[4]arenen – tetrahydroxy-thiacalix[4]areen-tetrasulfonate (C-798) en tetrahydroxy-thiacalix[4]areen-tetrafosfonate (C-800) – keerden deze remming om toen ze bij 100 µM werden toegevoegd, wat de activiteit herstelde tot controle-niveaus. Computationele docking onthulde dat beide liganden Zn²⁺ cheleren op de ATPase-actieve plaats, wat de interactie met myosine verzwakt en de enzymatische functie redt. Deze bevindingen suggereren dat C-798 en C-800 kunnen dienen als therapeutische middelen tegen zink-geïnduceerde uteriene dysfunctie.

Achtergrond

Omgevingsblootstelling aan zware metalen, met name zink, vormt significante gezondheidsrisico's. Terwijl zink een vitale cofactor is voor meer dan 300 metallo-enzymen, kan chronische hoge inname fysiologische processen storen, inclusief uteriene gladde-spiercontractie, wat leidt tot reproductieve complicaties zoals onvruchtbaarheid en voortijdige geboorte. Zinks impact op myosine ATPase – een sleutelaangedreven van gladde-spiercontractiliteit – is gedocumenteerd, doch effectieve tegenmaatregelen zijn beperkt. Calixarenen, met name thiacalix[4]arenen, zijn veelbelovende chelerende agenten naar voren gekomen vanwege hun lage cytotoxiciteit en sterke metaalbindende capaciteiten. Eerder werk demonstreerde dat C-798 myosine S1 beschermt tegen Pb²⁺, Cd²⁺ en Ni²⁺ remming. Deze studie breidt die inzichten uit naar zink-toxiciteit in uteriene myosine.

Resultaten

Effect van Zn²⁺ op myosine S1 ATPase

Incrementele Zn²⁺ (0,5–5 mM) verlaagde ATPase-activiteit, met maximale remming (43 ± 8 %) waargenomen bij 5 mM. Opvolgende kinetische analyse (Lineweaver-Burk) bevestigde een significante 1,6-voudige afname in V_max,ATP zonder statistisch betekenisvolle verandering in K_m,ATP.

ATP-concentratie-afhankelijkheid onder 5 mM Zn²⁺

ATPase-activiteit piekte bij 3 mM ATP in zowel controle als zink-behandelde monsters. Onder zink was de piekactiviteit 30 % lager, wat de remmende invloed op katalytische omzet bevestigt.

Mg²⁺-afhankelijkheid in aanwezigheid van 5 mM Zn²⁺

In tegenstelling tot de controle, veranderde varierende Mg²⁺ (0,5–5 mM) de ATPase-activiteit niet wanneer 5 mM Zn²⁺ aanwezig was, wat aangeeft dat zink de Mg²⁺-bindingsplaatsen bezet en het enzym ongevoelig maakt voor Mg²⁺-concentratie.

Zink-bindingsplaatsen op myosine S1

Docking-studies identificeerden meerdere Zn-bindingslocaties binnen het ATPase-domein – met name nabij de P-lus en schakel 1/2 regio's – gestabiliseerd door residuen Glu, Asp en Arg. Deze plaatsen zijn integraal voor ATP-binding en hydrolyse.

Thiacalix[4]arenen herstellen ATPase-activiteit

Toevoeging van 100 µM C-798 of C-800 aan het 5 mM Zn-medium herstelde de ATPase-activiteit volledig tot controle-niveaus. C-798 vertoonde een matige, omkeerbare remming (waarschijnlijk door Mg²⁺-sequestratie), terwijl C-800 geen effect had op het enzym in afwezigheid van zink.

Mechanistische inzichten uit docking

Simulaties onthulden dat C-798 en C-800 Zn²⁺ binden via hun onderrand-zuurstof- en zwavelatomen, het metaal verplaatsend van cruciale katalytische residuen. Deze chelatie verzwakt Zn-myosine-interacties, wat het remmende effect oplost. Energie-minimalisatie gaf gunstige gast-heer-interacties aan (totale energiëen: 64,5 kcal/mol voor C-798, 83 kcal/mol voor C-798-Zn-complex).

Discussie

De 5 mM zinkconcentratie die gebruikt werd, nabootst pathologische blootstelling en demonstreert een uitgesproken, omkeerbare onderdrukking van uteriene myosine ATPase. Het gebrek aan Mg²⁺-responsiviteit in zink-behandelde monsters ondersteunt de hypothese dat Zn²⁺ competitief Mg²⁺-plaatsen binnen het ATPase-domein bezet. Docking-resultaten sluiten hierbij aan, door Zn-coördinatie aan residuen cruciaal voor nucleotide-binding en hydrolyse te identificeren.

Thiacalix[4]arenen, met hun anionische sulfonaat- of fosfonaatgroepen, bieden robuuste chelatie van Zn²⁺ zonder Mg²⁺-homeostase op fysiologische niveaus te verstoren. Hun vermogen om ATPase-activiteit te herstellen suggereert een haalbare therapeutische strategie voor zink-geïnduceerde uteriene dysfunctie en potentieel voor andere zink-gerelateerde toxiciteiten.

Conclusies

Hoog-niveau zink (5 mM) verstoort uteriene myosine S1 ATPase door V_max te verlagen zonder K_m te veranderen. Wateroplosbare thiacalix[4]arenen C-798 en C-800 neutraliseren deze remming effectief door zink te cheleren op de ATPase-actieve plaats, wat de enzymatische activiteit herstelt tot basislijnniveau. Deze bevindingen rechtvaardigen verder onderzoek naar C-798 en C-800 als antidotes voor zink-toxiciteit.