Het bedenken van een hyperthermie-dosis van met NIR bestraalde Cs0.33WO3-nanodeeltjes voor HepG2-leverkankercellen

Methoden

In dit onderzoek werd de 102e generatie HepG2-leverkankercellijn afgeleid van menselijke primaire tumor gekweekt als een experimenteel model om de cytotoxiciteit te evalueren die wordt opgelegd door de NIR-bestraalde zelfgemaakte Cs_0.33 WO₃ NP's en beoordeel de therapeutische werkzaamheid van verschillende thermische doses ruim binnen de veiligheidslimiet voor blootstelling aan huidweefsel en bij een niet-toxische NP-concentratie.

Synthese van Cs _0.33 WO ₃ NP's

Het linkerpaneel van Fig. 1 illustreert het schematische stroomschema van de syntheseprocedure voor cesiumwolfraamoxide (Cs_0.33 WO₃ ) NP-materiaal. Kortom, de voorloperchemicaliën, ((NH₄ )₂ WO₄ ) (Alfa Aesar, 99,9% zuiverheid) en CsCl (Alfa Aesar, 99,9% zuiverheid) werden afzonderlijk opgelost in 100 ml gedeïoniseerd water en vervolgens gemengd bij 25°C onder constant roeren met 250 toeren per minuut (rpm) met behulp van een magnetisch aangedreven spinner gedurende één uur (uur). Nadat het roeren is voltooid, werd de temperatuur van de beker die de oplossing bevatte, op 180°C gebracht en gebakken totdat het watergehalte van de oplossing volledig was verdampt. Het resulterende gedroogde witte poeder was de uiteindelijke voorloper van Cs_0.33 WO3-materiaal. Terwijl de koelmachine was ingeschakeld, werd de kwartsboot die poeder bevatte, in het midden van een hoge-temperatuurovenbuis geladen en werd de druk in de ovenbuis op 0,08 torr gebracht. Daarna wordt de voorloper verwarmd tot een temperatuur van 500 °C naast de introductie van een instroom van een combinatie van gassen, H₂ en N₂ , in een verhouding van 90 tot 10 standaard kubieke centimeter per minuut (SCCM) om de redoxreactie te vergemakkelijken. Na 1 uur wordt de inlaat van H₂ gas is uitgeschakeld, de stroom van N₂ gas wordt ingesteld op 100 SCCM en de temperatuur van de oven wordt verhoogd tot 800 ° C voor thermisch gloeien gedurende één uur. Nadat de processen waren voltooid, werden de koelmachine en de temperatuurgeregelde oven uitgeschakeld en werd de kwartsboot afgekoeld totdat deze omgevingstemperatuur bereikte en uit de ovenbuis werd verwijderd. Het resulterende donkerblauwe poeder dat uit de kwartsboot wordt verkregen, is de micron (µ)-grootte Cs_0.33 WO₃ poeder. Om de kenmerkende grootte van de poederkorrels verder te verkleinen, 150 g van een mengseloplossing bestaande uit 15 g van het poeder, 3,8 g van een op copolymeer gebaseerd dispergeermiddel om aggregatie van deeltjes te voorkomen, 10 μl antischuimmiddel en DI water werd bereid, in een monsterkom gegoten die 600 g zirkonia-kralen bevatte en werd gemonteerd in de kamer van een nanogrinder-apparatuur (Justnanotech Co., Taiwan). Met de snelheid en temperatuur ingesteld op 2400 toeren per minuut (RPM) en 15 °C, worden de NP's geproduceerd door het µpoeder te malen met 0,1 mm ZrO₂ kralen gedurende 4 uur, en met 0,05 mm ZrO₂ kralen voor nog eens 4 uur. De totale duur van elk maalproces is niet meer dan 4 uur om overmatige vloeistofviscositeit en onregelmatige verandering van de fysieke afmetingen van het materiaal te voorkomen. De uiteindelijke oplossing na het maalproces werd gezeefd door een poriënfilter van 0,22 m voor alle daaropvolgende karakterisering en experimenten. De fluorescentieversie van Cs_0.33 WO₃ NP's (fNP's) werden gemaakt met behulp van het volgende protocol. Een oplossing gemaakt van 2 ml fluoresceïne met een concentratie van 28 mg/ml en 2 ml Cs_0.33 WO₃ NP-oplossing van 1, 5 mg / ml werd bereid in een beker en gedurende 15 minuten in de kom van een ultrasone shaker geplaatst. Vervolgens werden de NP-oplossing en het dispergeermiddel gemengd in een verhouding van 1:1,25 en 15 minuten ultrasoon geschud. De resulterende oplossing werd vervolgens gewassen met D.I. water en 15 minuten bij 10.000 tpm gecentrifugeerd. en tweemaal herhaald voor elk gebruik.

Schematische illustratie van experimentele procedures voor materiaalsynthese, cellulaire incubatie met NP's en fotothermische test op de kankercellen. BCL, TEn en PD zijn de afkortingen die respectievelijk stonden voor bi-concave lens, thermische omhulling en petrischaal; de rode pijl geeft de locatie aan voor de meting van het straalprofiel

Materiaalkarakterisering

Daarna, de karakterisering van Cs_0.33 WO₃ NP's, waaronder de statistische kenmerken van NP's, kristalstructuur, structurele morfologie, contourvorm, VIS-NIR-fotoabsorptie, werden uitgevoerd met behulp van zeta-potentiaalanalyse (ZS90, Malvern, VK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Duitsland), SEM (SU-5000, Hitachi, Japan) in combinatie met ingebouwde energie-dispersieve spectrometrie (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan), dynamische lichtverstrooiing (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, VS) , UV-VIS-NIR-spectrometer (V-750, Jasco, Japan), respectievelijk. De XRD-spectra werden verkregen door de röntgenstraling op de monsters te scannen binnen een hoekbereik van 20 ° tot 80 ° met een scansnelheid van 4 ° per minuut. Het signaal van scanhoekafhankelijke diffractie van het monster werd bepaald en vergeleken met het standaard XRD-spectrum van Cs_0.32 WO₃ van de Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) kaart nr. 83-1334. Om de tijdelijke afhankelijkheid van de fotothermische eigenschap van de NP te bevestigen, werd een eenvoudig experimenteel apparaat bestaande uit een NIR-laser met een golflengte van 980 nm en een temperatuurmeetsonde opgesteld om de temperatuurtoestand te onderzoeken die wordt veroorzaakt door de NIR-bestraalde oplossing. De onderzoeksoplossingen omvatten de D.I. met water verdunde NP's-oplossing en het mengsel van NP's-oplossing in celkweekmedia. De diameter van de optische straal voor monsters in de petrischaaltjes werd vergroot om het hele oppervlak van de petrischaal te bedekken, waardoor 0,05 W/cm ² werd geproduceerd. in geschatte optische vermogensdichtheid, anders intact gebleven bij 2 W/cm ² . Een optische opstelling getoond op het rechterpaneel van Fig. 1 wordt gebruikt om NIR-bestraling uit te voeren. In het hart van het optische systeem bevindt zich een NIR-laserstraal die is gericht op een bi-concave lens die de straaldiameter vergroot van 4 mm tot 5,2 cm, wat overeenkomt met de oppervlaktediameter van een petrischaal die op een hete plaat is ingesteld op 36,8 ° C, wat een fysiologische temperatuur is voor celgroei; ook is de petrischaal omgeven door een plastic cilindrische behuizing om de temperatuur van de omgeving en het medium in evenwicht te brengen. Aanvullend bestand 1:Fig. S1 illustreert het in kaart brengen van de optische intensiteit van de NIR-laserstraal gemeten bij de uitgang van de straalopening die wordt aangegeven door een rode pijl naast de laserstraal in Fig. 1. Het straalprofiel geeft de 3D-verdeling van optische intensiteit en verifieert de uniformiteit van het lichtveld over de gehele opening van de petrischaal.

Cytotoxiciteit en fotothermische tests

Om de celkweekcyclus te beginnen, 500 ml mediumoplossing bestaande uit 440 ml Ham's voedingsmengsel F-12 en Dulbecco's gemodificeerd Eagle's essential medium (HDMEM), 50 ml foetaal runderserum (FBS), 5 ml L-glutamine en 5 ml P/S (penicilline-streptomycine), die werd gesteriliseerd door een gaasfilter met een poriegrootte van 0,22 m, werd bereid. De celbevattende petrischalen met een diameter van 10 cm of 5,2 cm, dienovereenkomstig gevuld met 8 ml en 2 ml van het medium, werden gebruikt voor primaire en subkweek en geïncubeerd in een incubator geconditioneerd met 5% CO₂ en bij een temperatuur van 37 °C. De observatie van de celgroei en een vernieuwing van het kweekmedium werden eens in de twee dagen gedaan.

Om de overlevingspercentages te verkrijgen voor de gevallen van celassays die (1) controle zonder externe input, (2) enige NIR-bestraling, (3) incubatie met NP's en (4) incubatie met NP's naast een nasleep NIR-bestraling, de het kweekmedium in de kweekschaal werd eruit gezogen en 0,4 ml trypsine werd aan de kweekschaal toegevoegd en gedurende ongeveer 10 minuten in de incubator geplaatst. Nadat het losraken van cellen van de wanden van de schaal is bevestigd, werd 10 μl van het celbevattende medium uit de kweekschaal gehaald en toegevoegd aan 10 μl trypaanblauwe oplossing in een microcentrifugebuis, en een verwijdering van de resterende drijvende NP's werd gedaan door verschillende keer wassen met fosfaatbufferoplossing (PBS). Daarna werd het tellen van cellen uitgevoerd door een telplaat te vullen met 10 μl van de gekleurde celoplossing door een injectiegat, en de cellen kunnen worden waargenomen in het brandpuntsvlak van een stereomicroscoop en geteld door een handmatige teller; elk gegevenspunt dat in alle cijfers met betrekking tot celoverlevingspercentage werd gepresenteerd, was een gemiddelde van drie experimentele onderzoeken (N = 3) plus de marge van de standaarddeviatie.

Ter voorbereiding op de beoordeling van de cytotoxiciteit van de NP en de fotothermische effecten ervan op de cellulaire overlevingskans, werd het medium in de schaal van 5,2 cm verwijderd, opnieuw gevuld met de juiste hoeveelheid NP-oplossing in het nieuwe medium om een ​​reeks testconcentraties te maken, 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml en 0,5 mg/ml, en vervolgens een dag voor het experiment geïncubeerd.

Voorafgaand aan de fotothermische test werd de beoordeling van de cytotoxiciteit uitgevoerd om de respons van de cellen op een reeks NP-concentraties te onderzoeken, en dit gebeurde als volgt. Het medium met de cellen en NP's werd uit de incubator gehaald en afgezogen. Een milliliter voorverwarmde PBS werd gebruikt om de kankercellen te wassen en de resterende drijvende CsWO₃ eruit te zuigen NP's die geen endocytose hebben ondergaan, waarvan de procedure verschillende keren wordt herhaald om ervoor te zorgen dat eventuele cellulaire sterfte niet wordt veroorzaakt door de NP-geïnduceerde temperatuurstijging in het nieuwe medium. Na de fotothermische behandeling werd vervolgens de telprocedure geïmplementeerd voor de cytotoxiciteit en fotothermische test op de cellen.

Resultaten

De optische absorptie en fotothermische eigenschappen van Cs_0.33 WO₃ nanomaterialen zijn in hoge mate afhankelijk van de kristallijne structuur, de temperatuur na het uitgloeien, atomaire stoichiometrie en deeltjesgrootten [28, 29].

Om de oppervlaktemorfologie van de Cs_0.33 . te karakteriseren WO₃ µpowder, SEM-afbeeldingen met een vergroting van 10.000X werden verkregen voor visuele bevestiging van de iconische structuur van de zuilvormige zeshoek aangegeven door een rode pijl in Fig. 2a. Bovendien vertonen de TEM-afbeeldingen de contourvorm en kenmerkgroottes van de poederkorrel in figuur 2b, waar de kenmerkgrootte ongeveer 1 m of minder is. De staafachtige geometrie van de NP's en het DLS-distributiehistogram van de grootte van nanoschaalkenmerken gecentreerd rond 120 nm werden ook geverifieerd en worden weergegeven in figuur 2c en het bijbehorende inzet TEM-beeld. Ook wordt de kristallijne karakterisering van het µpoeder en NP's met XRD weergegeven in figuur 2d. Zoals kan worden waargenomen aan de hand van het XRD-spectrum van µpowder op het bovenpaneel, zijn de iconische kristallisatievlakken langs (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220 ), (222), (204), (400) en (224) vallen goed samen met het standaardspectrum van Cs_0.32 WO₃ van de Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) kaart nr. 83-1334. Wanneer de kenmerkgrootte van µpowder tot 120 nm afneemt, worden de intensiteiten van alle diffractiepieken monotoon verminderd, en sommige karakteristieke pieken die wijzen op sterke NIR-absorptie, zoals vlakken (102) en (220), worden onzichtbaar in het spectrum verkleind. Evenzo bevestigt de identificatie van de atomaire bestanddelen, cesium (Cs), wolfraam (W) en zuurstof (O), getoond in figuur 2e, niet alleen de atomaire aanwezigheid ervan, maar authenticeert ook de verhouding van atomaire percentages van Cs tot W, 0,315 , die sterk lijkt op de oorspronkelijk ontworpen stoichiometrie.

Fysieke en materiële karakterisering. een SEM en b TEM-afbeeldingen van de µpowder, c DLS-distributiehistogram van NP-kenmerkgrootte, d XRD-spectra van µpoeder en 120 nm NP's, en e EDS-spectrum met percentage atomaire samenstelling wordt gepresenteerd. De schaalbalken in a , b , c zijn respectievelijk 1,5 μm, 200 nm en 100 nm

Bovenop de materiaalkarakterisering werden de optische absorptiespectra van de NP's en de fotothermische temperatuurmodulatie in de tijd gemeten en weergegeven in Fig. 3. In (a, b), de afhankelijkheid van NIR-absorptie en de profielen van temperatuurstijging geïnduceerd door NIR -bestraalde NP-oplossing als functie van de NP-concentratie worden afgebeeld, waarbij de temperatuurgrafiek in de tijd van bijvoorbeeld 1 mg/ml hoger is dan 40 °C en gedurende ten minste 1 uur stabiel blijft, wat de fotothermische stabiliteit en duurzaamheid van de materialen bevestigt . Evenzo illustreert het tijdsverloop temperatuurprofiel in figuur 3c 5 repetitieve cycli binnen 190 minuten, waarmee de fotothermische respons van het NP-materiaal wordt geverifieerd. In figuur 3d stabiliseren de tijdelijke temperatuurprofielen van het kweekmedium en het NP-opgenomen kweekmedium, uit de incubator gehaald, op de kookplaat geplaatst en NIR-bestraling ondergaan, bij ongeveer 37 ° C in de loop van 10 min., en de temperatuur van de NIR-bestraalde zuivere NP-oplossing stijgt van 24,6 °C tot 33,6 °C na 10 min. Daarbij werd, rekening houdend met de fotothermische functionaliteit van de NP, de NIR-bestraling voor het volgende experiment uitgevoerd gedurende 10 minuten, 30 minuten en 60 minuten, waarbij de robuustheid van de NP's tijdens de experimentele sessie behouden bleef en mogelijk toepasbaar is op preklinische studies.

Optische en fotothermische eigenschappen. een Optische absorptiespectra en de profielen van tijdsverlooptemperatuur van NIR-bestraalde NP-oplossing in b , c een cuvet en in d een petrischaal zijn afgebeeld. Ex symboliseert de profielen van balkvergrote koffers; NP-concentratie van 1,5 mg/ml en optische vermogensdichtheid van 50 mW/cm ² werden gebruikt in (d ); de duur van de NIR-bestraling per cyclus in c duurt 15 min

Vervolgens werd de niet-toxische dosis van experimentele parameters, waaronder de duur van de NIR-bestraling en de NP-concentratie, bepaald door de cellen 1 uur en 2 uur te bestralen bij 50 mW/cm ² en door directe interactie met de NP's van 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml en 2 mg/ml in concentratie, die respectievelijk zijn weergegeven in Fig. 4a, b. Het overlevingspercentage van de cellen blijft ruim boven 95% gedurende 2 uur NIR-bestraling, wat bevestigt dat de cellen niet giftig zijn voor een langdurige blootstelling aan het 980 nm-foton, en ook dat de niet-toxische NP-concentratie lager is dan 1,5 mg /ml werd bepaald.

Cytotoxiciteitstest van experimentele parameters. Het overlevingspercentage van HepG2-cellen bij toediening van a de duur van de NIR-bestraling, b 120-nm NP's met verschillende concentraties worden gepresenteerd. De duur van de incubatie van NP was één dag; de standaarddeviatie van drie experimentele onderzoeken (N = 3) voor elk datapunt wordt aangegeven

Het doel van het doseren van de kankercellen van 1,5 mg/ml of lager, wat nauwelijks schadelijk is voor HepG2-cellen, is om de effecten van fotothermische doses op de kankercellen te onderzoeken zonder de implicatie van de inherente toxiciteit van de NP. Om te onderzoeken of de NIR-bestraalde NP's een levensvatbare oplossing kunnen zijn voor het elimineren van kankercellen, werden de cellen een dag met NP's van 1, 5 mg / ml geïncubeerd en vervolgens gedurende 1 uur aan de NIR-straling opgelegd. Zoals te zien is aan de optische helderveld-afbeeldingen (BF) van figuur 5d-f, wordt het aantal cellen duidelijk verminderd wanneer de belichtingstijd 1 uur (e) of 2 uur (f) duurt. Kwantitatief neemt het overlevingspercentage monotoon af van 84,2% tot 58,4% naarmate de bestralingsduur toeneemt van 10 min. tot 1 uur, en een lineaire trendy lijn past goed tussen de verspreide datapunten, die 20% van het overlevingspercentage voorspelt wanneer de bestraling 2 uur duurt. Bovendien geeft figuur 5h aan dat voor 1 uur bestraling de overlevingskans afneemt van 73 tot 58% naarmate de optische vermogensdichtheid toeneemt van 12,5 tot 50 mW/cm ² , het vaststellen van de functionaliteit van de NIR-bestraalde NP's als een fotothermische trigger bij de vernietiging van kankercellen.

Fotothermische test. Het overlevingspercentage van HepG2-cellen bij toediening van de NP-concentratie van 1,5 mg/ml naast NIR-bestraling. De respectieve schaalbalken op de a –c top en d –f onderste rijen BF optische beelden zijn 200 m en 100 m. De standaarddeviatie van drie experimentele onderzoeken (N = 3) voor elk datapunt wordt aangegeven

Bovendien werd de onzekerheid over de vraag of een dergelijke fotothermische actie op een intracellulaire of extracellulaire manier plaatsvond, aangepakt door de fNP's voor te bereiden, dezelfde was- en incubatieprocedure uit te voeren en eventuele intracellulaire aanwezigheid van de fNP's te observeren. Figuur 6 illustreert confocale BF (b, e) en fluorescentie (a, d) beelden en hun gesuperponeerde composieten (c, f) van de cellen die met en zonder de fNP's zijn geïncubeerd. Het is duidelijk dat de cellen zonder incubatie van fNP's als controle een verwaarloosbare groene fluorescentie vertonen, die voornamelijk wordt toegeschreven aan de cellulaire autofluorescentie, wat in schril contrast staat met het experiment waarbij de verdeling van groene fluorescentie alomtegenwoordig is in al het cytoplasma dat in de afbeelding wordt gevonden. De gemiddelde fluorescentie-intensiteiten in de afbeeldingen van controle- en experimentele monsters werden ook gekwantificeerd en worden weergegeven in het histogram van Fig. 6g, waar de fluorescentie van fNP's die endocytose hebben ondergaan, ten minste negen keer zo sterk is als de controle.

Optische confocale beelden. De een , d fluorescentie, b , e BF en c , v samengestelde optische beelden van de HepG2-cellen die met en zonder de fNP's zijn geïncubeerd, als de overeenkomstige experimentele en controlegroepen, worden gepresenteerd in de a –c top en d –f onderste rijen naast g een histogram van de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten. Schaalbalken vertegenwoordigen 20 m; de laserexcitatiegolflengte is 488 nm

Discussie

Het concept van therapeutische hyperthermie met behulp van elektromagnetische golven bij het genezen van kankerziekten dateert al van het begin van de twintigste eeuw en was erin geslaagd om sommige vormen van maligniteiten terug te dringen, maar werd echter afgezwakt vanwege het nut van koortsopwekkende antibacteriële middelen en het ontbreken van nauwkeurige toegankelijkheid tot lokale tumor van belangen in situ [30]. Pas in de jaren tachtig werd de interesse nieuw leven ingeblazen met verschillende in vitro-onderzoeken die vele aspecten van metabole veranderingen, verandering van de microcirculatie van tumoren en acidolyse na hyperthermiebehandeling ontdekten, wat dodelijke effecten op de kankercellen veroorzaakte [31]. Mechanistisch gezien, naast directe cytotoxiciteit waarbij kankercellen necrose ondergaan met een afnemende apoptose wanneer de toegepaste temperatuur  > -42 ° C is, maakt de verminderde bloedstroomsnelheid in combinatie met een lager koelvermogen en een lage pH (<-6.8) de kankercellen vatbaarder voor verwarming en bijgevolg een hogere celdodende snelheid [32, 33]. Vanwege het eeuwenoude nadeel van onnauwkeurige niet-specifieke lokalisatie, vond de hyperthermie echter klinisch alleen verbeterde therapeutische werkzaamheid bij gelijktijdige toepassing met chemo- of bestralingstherapieën [34, 35].

De op NP gebaseerde materialen die nauwkeurige targeting en monitoring mogelijk maken, en een breed scala aan fysieke eigenschappen hebben, zoals oppervlaktelading, fluorescentie, fotothermische conversie, passen mooi in de niche van dergelijke onnauwkeurigheid bij hyperthermie-toepassing. Ondanks het bewezen nut van veel NIR-bestraalde NP-materialen in kankercelonderzoeken, wordt de veiligheidslimiet van fotoblootstelling echter vaak niet goed onderzocht, zoals in het geval van CsWO₃ NP's. CsWO₃ NP's hebben echter, zoals weergegeven in figuur 4b, een relatief lage cytotoxiciteit van 1,5 mg/ml in vergelijking met een handvol populaire NP-materialen, zoals Ag, Au, grafeen, waarvan de drempels op de schaal van 1 μg/ml lagen [ 18, 36, 37], vereist nog steeds 0,7 W/cm ² voor een effectieve vernietiging van Hela-cellen ondanks de sterke NIR-absorptie in het golflengtebereik van 800 nm tot 2400 nm [15, 25, 26].

Deze onderzoeksstudie is bedoeld om een ​​effectieve door NIR-bestraling geactiveerde, Cs_0.33 WO₃ NP-gebaseerde thermische doseringsformule voor in vitro HepG2-kankercellen als een functie van NP-concentratie, duur van bestraling en optische vermogensdichtheid ruim binnen de NIR-blootstellingslimiet voor huidweefsel.

Het experiment begint met de synthese van de NP's, waar een stapsgewijze synthetische procedure inclusief redoxreactie, gloeiproces en natslijpmethode wordt beschreven in Fig. 1. De redoxreactie omvat grote ternaire elementen, in dit geval Cs, in ringen van octaëdrische structuur van WO₆ in een goede fysieke omgeving, waardoor de vorming van een eigenaardige kristallijne structuur en opname van vrije elektronen in de metallische moleculaire verbinding mogelijk wordt, wat de intrinsieke reden is voor sterke fotothermische conversie bij NIR-absorptie [26, 27]. Ook hielpen de daaropvolgende gloei- en natslijpprocessen de kristalvorming te verfijnen en de deeltjesgrootte te verkleinen die de NIR-fotothermische conversie verder verbeteren. Daarna ging de gesynthetiseerde NP-oplossing verder met een reeks fysieke en materiële karakteriseringen die een gemiddelde kenmerkgrootte van 120 nm verifiëren, een kritische optimalisatie van NIR-absorptie, en de atomaire samenstelling authenticeren (Fig. 2). Bovendien is de overeenkomstige meting van zeta-potentiaal voor 0,5 mg/ml, 1 mg/ml en 1,5 mg/ml − 53,2 mV, − 54,3 mV, − 60,1 mV. Over het algemeen is het proces van endocytose het belangrijkste toegangspad voor de meeste NP-typen, en de opnamesnelheid van zowel kationische als ionische NP's voor niet-fagocytische cellen is hoger dan neutrale entiteiten, hoewel de eerste beter presteert dan de latere [38]. Ook vonden veel eerdere rapporten negatief geladen NP's die minder toxisch waren voor niet-fagocytische cellen [39, 40], wat een gunstige verdienste is wanneer een overmatige intracellulaire NP-accumulatie voor fotothermische dosis gepaard gaat met een lage toxiciteit.

To set up a tone for the photothermal assay upon the HepG2 cells, the assessment of the NPs' robustness as a photothermal heater, its long-term stability at saturated temperature in equilibrium with the ambient environment over an hour and the repeatability for 5 consecutive cycles within 3 h were demonstrated (Fig. 3b, c). Also, to quantify the effectiveness of the NP's hyperthermia per se in dosing the cancer cells by ruling out the influence of ambient temperature (nominally at 25 °C), a calibration of the experimental apparatus was implemented by setting a hotplate to 37 °C, atop which all cell assays were carried out, and the temporally photothermal characteristics of the pure culture medium and NP-incorporated culture medium remained at 37.1 °C (Fig. 3d). Thereafter, the dependence of cytotoxicity on the duration of irradiation and NP concentration was examined separately and is presented in Fig. 4 indicating less than 5% of cell killing for over 2 h of NIR-irradiation and 1.5 mg/ml as the pivotal point toward lethal concentration. By fixing the NP concentration at 1.5 mg/ml, which was used throughout the rest of photothermal assay, the thermal dose for medical hyperthermia was defined as functions of variable dosing duration and optical power density. Figure 5 illustrates the action of cell killing with low (a–c) and high (d–f) magnification when NIR-irradiation for 0 h, 1 h and 2 h was implemented, the seemingly reduced number in the cells reflects well the quantitative analysis of cell survival rate as shown in (g), and the linear trend line predicts 80% of cell death for 2 h of irradiation. Likewise, the decrease in cell survival rate upon the incremental optical power density is also demonstrated in (h). Lastly, as clearly depicted by the BF, fluorescence and superimposed composite images in Fig. 6, in which a histogram of fluorescence analysis was presented, the endocytosis of the fNPs was verified.

Conclusie

In summary, this study presents material synthesis and characterization of Cs_0.33 WO₃ NPs, examines in vitro cytotoxicity assays of the direct NPs interaction, and separately, with NIR irradiation, and proves the endocytosis of the NPs as well as effectiveness of the NIR-irradiated NPs upon destructing the HepG2 cancer cells. Moreover, this study suggests a combinative dose of the NIR-irradiated Cs_0.33 WO₃ NPs solution for the HepG2 cancer cells, 1.5 mg/ml of NP concentration, the duration of irradiation between 30 min. to 1 h, and optical power densities of NIR irradiation under 50 mW/cm ² which is well below the safety NIR exposure limit for skin tissue while allowing cancer cell mortality rate close to 40% and may be potentially applicable to the development of patient-friendly and personalized medicine. Such studies in a clinical setting will require additional measures like surface modification with molecules that recognize surface receptors of specific cancer cell types.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

All data are fully available without any restriction.

Afkortingen

NP's:

Nanodeeltjes

fNPs:

Fluorescence version of Cs_0.33 WO₃ nanodeeltjes

NIR:

Nabij-infrarood

UV–VIS–NIR:

Ultraviolet–visible–near-infrared

REDOX:

Oxidation-reduction

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

XRD:

Röntgendiffractie

SEM:

Scanning elektronenmicroscopie

EDS:

Energie-dispersieve röntgenspectroscopie

RF:

Radiofrequentie

ICNRP:

International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection

MIN:

Minutes

SCCM:

Standaard kubieke centimeter per minuut

μ:

Micron

RPM:

Round per minute

JCPDS:

Joint Committee on Powder Diffraction Standards

DI:

Gedeïoniseerd

BF:

Bright field