Geremde MicroRNA-301 remt angiogenese en celgroei bij slokdarm-plaveiselcelcarcinoom door verhoging van PTEN

Abstract

Doelstelling

Esophageal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) wordt gekenmerkt door vroege metastase en late diagnose. Van MicroRNA-301 (miR-301) is bekend dat het deelneemt aan verschillende kankers. Desalniettemin blijven de effecten van miR-301 op ESCC onontgonnen. Daarom willen we de rol van miR-301 in ESCC-progressie onderzoeken.

Methoden

Expressie van miR-301 en fosfatase en tensine-homoloog (PTEN) in ESCC-weefsels en cellijnen werd beoordeeld. Vervolgens werden de gescreende cellen behandeld met gewijzigd miR-301 of PTEN-oligonucleotide en plasmide, en vervolgens werden het vermogen tot kolonievorming, cellevensvatbaarheid, migratie, invasie, celcyclusdistributie en apoptose van ESCC-cellen beoordeeld. Bovendien werden ook tumorgroei en microvatdichtheid (MVD) beoordeeld en werd de targetingrelatie tussen miR-301 en PTEN bevestigd.

Resultaten

MiR-301 werd opgereguleerd en PTEN werd neerwaarts gereguleerd in ESCC-weefsels en -cellen. KYSE30-cellen en Eca109-cellen werden geselecteerd voor functionele testen. In KYSE30-cellen onderdrukte remming van miR-301 of tot overexpressie gebracht PTEN kwaadaardig gedrag van cellen, en onderdrukte PTEN elimineerde de impact van miR-301-remming op ESCC-progressie. In Eca109-cellen bevorderde miR-301-overexpressie of PTEN-remming celmaligne gedragingen, en PTEN-overexpressie keerde de effecten van miR-301-verhoging op ESCC-progressie om. De in vivo-test onthulde dat miR-301-remming of PTEN-overexpressie ESCC-tumorgroei en MVD onderdrukte, en miR-301-elevatie of PTEN-reductie hadden tegengestelde effecten. Bovendien was PTEN het doelwit van miR-301.

Conclusie

Al met al onthulden de resultaten in onze studie dat miR-301 de celgroei, metastase en angiogenese beïnvloedde via het reguleren van PTEN-expressie in ESCC.

Inleiding

Slokdarmkanker (EC), de 8e meest voorkomende kanker over de hele wereld, is een kritieke maligniteit met een hoge mortaliteit en een slechte prognose [1]. Goed voor ongeveer 90% van de totale EC-gevallen, is oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) de belangrijkste vorm van EC in China [2]. Meerdere oorzaken, waaronder een lage sociaaleconomische status, roken, alcoholgebruik, slechte voedingsinname, nitrosaminerijk of met mycotoxine besmet voedsel leiden tot het optreden van ESCC [3]. Ondanks de bevorderde klinische uitkomsten en toediening, is er nog steeds een slechte prognose bij de ESCC-patiënten, wat gepaard gaat met een 5-jaarsoverleving van 15-25% [4]. Daarom is het van cruciaal belang om oncogenen of tumorrepressieve genen te bevestigen die zouden kunnen fungeren als biomarkers bij de ontwikkeling van ESCC om effectievere therapeutische methoden voor ESCC-patiënten te bieden.

MicroRNA's (miRNA's) zijn kleine niet-coderende RNA's die een essentiële rol spelen bij het moduleren van genexpressie [5] en het is duidelijk dat ze het vermogen hebben om tumorprogressie te beïnvloeden door de mRNA-stabiliteit en het vermogen van mRNA's te reguleren [6]. Een aantal miRNA's zoals miR-4324 [7], miR-889-3p [8] en miR-9 [9] bleken geassocieerd te zijn met het proces van ESCC. MiR-301 is een lid van de miRNA's die wordt gevormd door de fam33a-transcriptie-eenheid die zich op 17q22-23 in het menselijk genoom bevindt. De overexpressie van miR-301 is eerder geïdentificeerd, wat weerspiegelde dat het betrokken is bij menselijke ziekten [6, 10]. De functiemechanismen van miR-301 zijn echter niet ontdekt in ESCC. Bovendien is bevestigd dat fosfatase en tensine-homoloog (PTEN) vaak worden verstoord in tumoren en het doelwit zijn van kiembaanmutaties bij kankerpatiënten, wat een remmende rol speelt bij tumoren [11]. Het is gevalideerd dat de ontregeling van PTEN gecorreleerd is met ESCC-ontwikkeling [12]. Interessant is dat recent onderzoek heeft aangetoond dat miR-301 zich richt op PTEN bij niet-kleincellige longkanker [13]. Deze targetingrelatie tussen miR-301 en PTEN in ESCC-ontwikkeling moet echter nog worden onthuld. Ons onderzoek richtte zich op de effecten van miR-301 en PTEN op ESCC-progressie, die grotendeels onbekend blijven en nieuw zijn. We concludeerden dat miR-301 de angiogenese en celgroei in ESCC kan beïnvloeden door PTEN-expressie te moduleren.

Materialen en methoden

Ethische verklaring

Voorafgaand aan het onderzoek werden schriftelijke geïnformeerde toestemmingen verkregen van alle patiënten. De protocollen van deze studie zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het tweede ziekenhuis van Jilin University en gebaseerd op de ethische principes voor medisch onderzoek waarbij menselijke proefpersonen betrokken zijn van de Verklaring van Helsinki. Dierproeven waren strikt in overeenstemming met de Guide to the Management and Use of Laboratory Animals, uitgegeven door de National Institutes of Health. Het protocol van dierproeven is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het tweede ziekenhuis van Jilin University.

Studieonderwerpen

Honderdtien monsters van ESCC-weefsel en aangrenzende normale weefsels (> 5 cm van de tumor) werden verzameld van ESCC-patiënten (78 mannen en 32 vrouwen) die slokdarmresectie hadden ondergaan op de afdeling thoracale chirurgie van het tweede ziekenhuis van Jilin University vanaf januari 2015 tot december 2017. Van de 110 patiënten waren er 84 gevallen > 60 jaar en 26 gevallen ≤ 60 jaar; tumorgrootte:65 gevallen ≥ 5 cm en 45 gevallen < 5 cm; 71 gevallen zonder lymfekliermetastase (LNM) en 39 gevallen met LNM; het stadium van tumor, knoop en metastase (TNM):60 gevallen bevonden zich in het I + II-stadium en 50 gevallen bevonden zich in het III-stadium; tumorlocatie:13 gevallen waren bovenste ESCC en 97 gevallen waren midden-lagere ESCC. De patiënten waren allemaal gediagnosticeerd met ESCC en hadden niet eerder radiotherapie of chemotherapie aanvaard. De tumoren werden volledig weggesneden en de negatieve chirurgische marge werd bevestigd door pathologie. Volgens de stadiëringscriteria van ESCC, voorgesteld door de Union for International Cancer Control (UICC) in 2009 [14], werd de postoperatieve pathologische stadiëring van de patiënten geïdentificeerd als het pT1-4N1-2(I-IIIb) stadium. Er was geen significante complicatie bij patiënten na de operatie en perioperatieve sterfte werd uitgesloten.

Kwantitatieve polymerasekettingreactie met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR)

Totale RNA's in weefsels en cellen werden geëxtraheerd met behulp van Trizol-kits (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, VS). De RNA-concentratie en kwaliteit werden gemeten. RNA-primers (Tabel 1) werden ontworpen en gesynthetiseerd door TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning China). Het RNA werd omgekeerd getranscribeerd in cDNA op basis van de instructies van Takara PrimeScript™ RT-reagenskit met g DNA Eraser (Takara). We hebben qPCR uitgevoerd op de Light Cycler 480II (Roche) met de Power PCR SYBR groene PCR-mastermix (Takara). U6 werd gebruikt als de laadcontrole van miR-301 en β-actine werd gebruikt als de interne referentie van PTEN. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van 2^−△△Ct methode [15].

Western Blot-analyse

RIPA-lysisbuffer (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) werd gebruikt om het totale eiwit in cellen en weefsels te extraheren en het eiwit werd gekwantificeerd door een BCA Protein Assay-kit (Beyotime). De eiwitconcentratie van elk monster werd gemeten en 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese werd uitgevoerd. De monsters werden overgebracht op de nitrocellulosemembranen, die vervolgens een nacht bij 4 ° C werden geblokkeerd met 5% magere melkpoeder. Daarna werden de membranen aangevuld met primaire antilichamen PTEN en β-actine (beide 1:500 en van Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, VS) voor incubatie gedurende de nacht, vervolgens toegevoegd met de respectieve secundaire antilichamen en gedurende 1 uur geïncubeerd. Na onderdompeling in het verbeterde chemiluminescentiereagens (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, VS) gedurende 1 minuut, werden de membranen blootgesteld in een donkere omgeving en ontwikkeld met behulp van LAS4000 mini-chemiluminescentie-imager. De grijswaarden werden geëvalueerd door een beeldvormingssysteemsoftware met β-actine als controle; daarom werd het uiteindelijke relatieve tot expressie gebrachte eiwit verkregen. De eiwitbanden werden geanalyseerd door ImageJ2x-software.

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

Er werd voorspeld dat de 3'-niet-vertaalde regio (UTR) -sequentie van PTEN interageert met miR-301, of een gemuteerde sequentie binnen de voorspelde doelwitplaatsen werd gesynthetiseerd en ingevoegd in de XbaI- en FseI-plaatsen van de pGL3-controleluciferasereportervector (Promega, WI, VS). Vervolgens werden pGL3-PTEN-wt- en pGL3-PTEN-mut-vectoren geproduceerd. De correct geïdentificeerde wt en mut luciferase-reporterplasmiden met miR-301 mimic en mimic NC werden gedurende 48 uur gecotransfecteerd in KYSE30- en Eca109-cellen. Vervolgens werden de cellen gelyseerd en werden respectievelijk de luciferase-activiteiten bepaald met luciferase-detectiekits (Promega).

Celcultuur, groepering en transfectie

ESCC-cellijnen (KYSE-150, KYSE-30, Eca109 en KYSE-70) werden verkregen van het Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) en de menselijke slokdarmepitheelcellen (HEEC's) werden verworven van Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, China). Cellen werden gekweekt in RPMI 1640-medium (Invitrogen) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, Life Technologies, VS), 100 eenheden/ml penicilline G-natrium (Sigma) en 100 g/ml streptomycinesulfaat (Sigma). MiR-301-expressie en de mRNA-expressie van PTEN in elke cellijn werden gemeten met RT-qPCR en de cellijn met de hoogste en laagste relatieve expressie werd gekozen voor de daaropvolgende cellulaire experimenten.

KYSE-30-cellen werden in 7 groepen gescheiden en respectievelijk behandeld met miR-301-remmer, remmer-negatieve controle (NC), pcDNA-PTEN (genaamd overexpressed (oe)-PTEN), pcDNA-NC (genaamd oe-NC), miR-301-remmer + klein interfererend RNA (si)-PTEN of miR-301-remmer + si-NC. Eca109-cellen werden ook in 7 groepen gescheiden en afzonderlijk behandeld met miR-301 mimic, mimic NC, si-PTEN, si-NC, miR-301 mimic + oe-PTEN, miR-301 mimic + oe-NC. remmer NC, miR-301-remmer, miR-301 mimic, mimic NC, si-NC en si-PTEN werden gekocht bij GenePharma Ltd., Company (Shanghai, China); pcDNA-PTEN NC en pcDNA-PTEN werden verkregen van (Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Shanghai, China)). De cellen werden tijdelijk getransfecteerd in ESCC-cellen door lipofectamine 2000 (Invitrogen) toen de celconfluentie 60% bereikte.

Cell Counting Kit (CCK-8) Assay

Cellen werden gezaaid in een plaat met 96 putjes (1 × 10³ cellen/putje) en gedurende verschillende tijdsperioden geïncubeerd. Na 24 uur, 48 uur, 72 uur en 96 uur geïncubeerd, werd elk putje aangevuld met 10 μL CCK-8-oplossing (5 mg/mL), en vervolgens werden de cellen van elke groep geïncubeerd bij 37 ° C zonder licht blootstelling gedurende 2 uur. De waarden voor optische dichtheid (OD) bij 450 nm werden geanalyseerd door een microplaatlezer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VS).

Kolonievormingstest

Cellen werden na transfectie uitgezaaid met 500 cellen/putje in platen met 6 putjes en 14 dagen gekweekt. Kolonies werden gefixeerd met methanol, gekleurd met 0,5% kristalviolet en geteld onder de omgekeerde microscoop.

Transwell-assay

Cellen (5 × 10³ ) geïncubeerd in RPMI 1640-medium werden gezaaid in apicale kamers van Transwell-apparaten met niet-gecoat of matrigel-gecoat membraan (Corning, NY, VS). Na 24 uur werden cellen op apicale kamers verwijderd, terwijl cellen die aan de onderkant achterbleven werden gefixeerd en vervolgens gekleurd met 0,1% kristalviolet. Een microscoop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) werd gebruikt om op 3 willekeurige velden te tellen om het aantal cellen te berekenen.

Flowcytometrie

Celcyclus en apoptose werden geëvalueerd door middel van flowcytometrie. Annexine V-fluoresceïne isothiocyanaat (10 µL) en propidiumjodide (PI; 5 µL, Sigma) werden met de cellen geïncubeerd (5 × 10⁵ cellen / putje) in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Het percentage apoptotische cellen werd berekend met behulp van een flowcytometer (BD Biosciences, CA, VS) met FlowJo versie 10-software (FlowJo LLC, OR, VS).

Om de celcyclus te beoordelen, moeten cellen (5 × 10⁵ cellen/putje) werden overnacht gefixeerd met 75% ethanol bij 4 °C en gekleurd met 5 µl PI/ribonuclease A (Sigma) bij 4 °C gedurende 30 minuten in het donker. Gegevens werden geanalyseerd met een flowcytometer (BD Biosciences). Fluorescentiesignalen (14.000) van elk monster werden verzameld en berekend met behulp van ModFit LT versie 3.2-software (Verity Software House, Inc., ME, VS).

Subcutane tumorgenese bij naakte muizen

Tweeënveertig vrouwelijke BALB / c-nu naaktmuizen (4 w, met een gewicht van 16-24 g) werden verkregen van Experimental Animal Center Jilin University (Changchun, China). De naakte muizen werden in 14 groepen verdeeld (n = 3). Naakte muizen van zeven groepen werden respectievelijk geïnjecteerd met KYSE-30-cellen volgens de celgroepering, en naakte muizen in de overige zeven groepen werden afzonderlijk geïnjecteerd met Eca109-cellen op basis van de groepering. De concentratie van getransfecteerde KYSE-30- en Eca109-cellen werd aangepast tot 5 × 10⁶ cellen/100 L. De naakte muizen werden gefixeerd en subcutaan geïnjecteerd met overeenkomstige ESCC-cellen onder steriele omstandigheden. De grootste lengte (L) en breedte (W) van de tumoren werden wekelijks gemeten en het tumorvolume (V ) = 1/2 × L × W ² . De naakte muizen werden geëuthanaseerd in de 5^de week van injectie met de tumoren weggesneden, en de tumoren werden gewogen en gefotografeerd. De tumorvormingssnelheid werd berekend als het aantal muizen met subcutane tumor/totaal aantal geïnjecteerde naakte muizen in de groep - × -100%. De injectietijd werd als abscis genomen en de tumorgrootte werd als ordinaat genomen; zo werd de tumorgroeicurve in een grafiek weergegeven.

Immunohistochemische kleuring

De tumorweefsels van naakte muizen werden gefixeerd met 10% formaldehyde, ingebed in paraffine en in plakjes van 4 m gesneden. Vervolgens werden de coupes 2 uur bij 60 °C gedroogd, van was ontdaan met xyleen, gedehydrateerd met gradiënt-ethanol en geïncubeerd met 50 μL 3% H₂ O₂ gedurende 10 minuten. Daarna werden de coupes gedrenkt in 0,01 M citroenzuurbufferoplossing, 20 minuten gekookt bij 95 ° C, geblokkeerd door normale geitenserumwerkoplossing bij 37 ° C gedurende 10 minuten en toegevoegd met CD₃₄ (1:100, Santa Cruz) bij 4 ° C 's nachts. Daarna werden de secties aangevuld met HRP-gelabeld geiten-anti-konijn / muizen-IgG-polymeer (ZSGB-Bio, Beijing, China), tegengekleurd door hematoxyline, gedehydrateerd en permeabel en vervolgens verzegeld met neutrale balsem. PBS werd gebruikt om de primaire antilichamen te vervangen als de NC. Meting van de dichtheid van microvaatjes (MVD):de coupes werden bekeken onder een microscoop met een lage vergroting. Een endotheelcel of een endotheelcelcluster kleurde tot bruingeel en onderscheidde zich significant van de omringende tumorcellen, en bindweefsels werden als een microvat genomen. De vertakkingsstructuur werd ook als een vat genomen als deze was losgekoppeld, terwijl vaten met lumengrootte > 8 erytrocyten, spierlaag of dikker lumen werden uitgesloten. Het aantal microvaten van 3 hoge gezichtsvelden werd geregistreerd en het gemiddelde aantal was MVD van elk geval.

Statistische analyse

Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS-versie SPSS 21.0-software (IBM Corp. Armonk, NY, VS) en gepresenteerd met Graphpad Prism Software 6.0. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Verschillen tussen twee onafhankelijke groepen werden getest met Student's t-test. One-way ANOVA werd uitgevoerd voor het vergelijken van drie of meer groepen. P waarde < 0,05 was indicatief voor een statistisch significant verschil.

Resultaten

MiR-301 wordt sterk uitgedrukt, terwijl PTEN slecht tot expressie wordt gebracht in ESCC-weefsels en cellen

MiR-301- en PTEN-expressie in ESCC-weefsels en aangrenzende normale weefsels werd beoordeeld met behulp van RT-qPCR en Western-blot-analyse om hun rol in ESCC te onthullen, en er werd vastgesteld dat (Fig. 1a-c) miR-301 was opgereguleerd, terwijl PTEN werd gedownreguleerd in ESCC-weefsels. De patiënten werden verdeeld in de lage en hoge expressiegroepen volgens de mediane waarde van miR-301- of PTEN-expressie om de correlatie tussen miR-301- of PTEN-expressie en klinisch-pathologische kenmerken van ESCC-patiënten te analyseren. De resultaten gaven aan dat miR-301/PTEN-expressie niet gerelateerd was aan leeftijd, geslacht, tumorgrootte, locatie en differentiatie, terwijl het gecorreleerd was met TNM-stadium en LNM van ESCC-patiënten (Tabel 2).

MiR-301 wordt sterk tot expressie gebracht, terwijl PTEN slecht tot expressie wordt gebracht in ESCC-weefsels en -cellen. een Expressie van miR-301 en mRNA-expressie van PTEN in het ESCC-weefsel gedetecteerd met behulp van RT-qPCR; b eiwitexpressie van PTEN in het ESCC-weefsel gedetecteerd met behulp van Western-blot-analyse; c eiwitbanden van PTEN in het ESCC-weefsel in Western-blot-analyse; d expressie van miR-301 en mRNA-expressie van PTEN in ESCC-cellijn gedetecteerd met behulp van RT-qPCR; e eiwitexpressie van PTEN in ESCC-cellijn gedetecteerd met behulp van Western-blot-analyse; v eiwitbanden van PTEN in Western-blot-analyse. *P < 0,05 versus HEEC. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en de t-test werd uitgevoerd voor vergelijkingen tussen twee groepen

Vervolgens werd de expressie van miR-301 en PTEN in 4 ESCC-cellijnen en HEEC's bepaald met behulp van RT-qPCR en Western-blot-analyse. We ontdekten dat (Fig. 1d-f) miR-301 werd opgereguleerd en PTEN werd neerwaarts gereguleerd in ESCC-cellijnen, waaronder KYSE-30 de hoogste miR-301-expressie en de laagste PTEN-expressie had, terwijl Eca109 de tegenovergestelde tendens had. Zo werd de KYSE-30-cellijn behandeld met gedownreguleerd miR-301/tot overexpressie gebracht PTEN en de Eca109-cellijn werd behandeld met tot overexpressie gebracht miR-301/silenced PTEN in de cellulaire experimenten.

PTEN is doelwit van miR-301

Een bio-informatische software (//www.microrna.org/) voorspelde dat PTEN het doelwitgen was van miR-301 (Fig. 2a). Het werd verder bevestigd door een dubbele luciferase-reportergen-assay dat de luciferase-activiteit significant was verminderd in ESCC-cellen die waren gecotransfecteerd met PTEN-wt-vector en miR-301-nabootsing in vergelijking met die gecotransfecteerd met PTEN-mut-vector en miR-301-nabootsing, wat impliceert dat miR-301 in het bijzonder zou kunnen binden aan PTEN (Fig. 2b, c).

PTEN is het doelwitgen van miR-301. een Bindingssites van miR-301 en PTEN werden voorspeld door online voorspellingssoftware; b doelrelatie tussen miR-301 en PTEN in KYSE-30-cellen werd beoordeeld door een dubbele luciferase-reportergentest; c doelrelatie tussen miR-301 en PTEN in Eca109-cellen werd beoordeeld door een dubbele luciferase-reportergentest; d expressie van miR-301 en PTEN mRNA-expressie in KYSE-30-cellen gedetecteerd met behulp van RT-qPCR na miR-310 downregulatie of PTEN-upregulatie; e eiwitexpressie van PTEN in KYSE-30-cellen gedetecteerd met behulp van Western-blot-analyse na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; v eiwitbanden van PTEN in KYSE-30-cellen in Western-blot-analyse na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; g expressie van miR-301 en mRNA-expressie van PTEN in Eca109-cellen gedetecteerd met behulp van RT-qPCR na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; u eiwitexpressie van PTEN in Eca109-cellen gedetecteerd met behulp van Western-blot-analyse na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; ik eiwitbanden van PTEN in Eca109-cellen in Western-blot-analyse na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie. *P < 0,05 versus de remmer-NC-groep, &P < 0.05 versus de oe-NC-groep, ^# P < 0,05 versus de miR-301-remmer + si-NC-groep, a P < 0.05 versus de mimic-NC-groep, b P < 0,05 versus de si-NC-groep, c P <-0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC-groep; N =3. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en de t-test werd uitgevoerd voor vergelijkingen tussen twee groepen. ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen tussen meerdere groepen

RT-qPCR en Western-blot-analyse werden gebruikt om miR-301- en PTEN-expressie in getransfecteerde cellen te beoordelen, en er werd gevonden dat in KYSE-30-cellen (Fig. 2d-f), cellen die waren behandeld met miR-301-remmer miR-301 neerwaarts reguleerden , terwijl opgereguleerde PTEN; cellen behandeld met pcDNA-PTEN (oe-PTEN) verhoogden de PTEN-expressie en si-PTEN keerde het effect van miR-301-remmer op PTEN-expressie om. In Eca109-cellen (Fig. 2g-i) bootsen cellen behandeld met miR-301 opgereguleerde miR-301 na, terwijl PTEN neerwaarts werd gereguleerd; cellen behandeld met si-PTEN verminderden PTEN-expressie en pcDNA-PTEN (oe-PTEN) keerde de remmende rol van miR-301-nabootsing in PTEN-expressie om. Deze gegevens suggereerden dat miR-301 zich richtte op PTEN.

Geremde miR-301 of overexpressie van PTEN beperkt de levensvatbaarheid van ESCC-cellen; Verhoogde miR-301 of verminderde PTEN bevordert de levensvatbaarheid van ESCC-cellen

De levensvatbaarheid van de cellen van ESCC-cellen werd beoordeeld met behulp van kolonievorming en CCK-8-assays. De resultaten onthulden dat in KYSE-30-cellijn (Fig. 3a-c), transfectie van miR-301-remmer of oe-PTEN het vermogen tot kolonievorming en levensvatbaarheid van de cellen onderdrukte; transfectie van tot zwijgen gebracht PTEN elimineerde de impact van miR-301-remmer op de levensvatbaarheid van ESCC-cellen; in Eca109-cellijn (Fig. 3d-f), bevorderde transfectie van miR-301-nabootsing of si-PTEN het vermogen tot kolonievorming en levensvatbaarheid van de cellen; PTEN-overexpressie keerde de bevorderende rol van miR-301-verhoging in het vermogen tot kolonievorming en levensvatbaarheid van Eca109-cellen om. Deze resultaten suggereerden dat miR-301 knockdown of PTEN-overexpressie de levensvatbaarheid van ESCC-cellen onderdrukte, die werden bevorderd door miR-301-verhoging of PTEN-remming.

Geremd miR-301 of tot overexpressie gebracht PTEN beperkt de levensvatbaarheid van ESCC-cellen; verhoogde miR-301 of verminderde PTEN bevordert de levensvatbaarheid van ESCC-cellen. een Aantal kolonies in KYSE-30-cellen na transfectie gedetecteerd met behulp van kolonievormingstest na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; b kolonievormingsvermogen van KYSE-30-cellen na transfectie gedetecteerd met behulp van kolonievormingstest na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; c levensvatbaarheid van KYSE-30-cellen na transfectie gedetecteerd met behulp van CCK-8-assay na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; d aantal kolonies in Eca109-cellen na transfectie gedetecteerd met behulp van kolonievormingstest na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; e kolonievormingsvermogen van Eca109-cellen na transfectie gedetecteerd met behulp van kolonievormingstest na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; v levensvatbaarheid van Eca109-cellen na transfectie gedetecteerd met behulp van CCK-8-assay na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; *P < 0,05 versus de remmer-NC-groep; &P < 0,05 versus de oe-NC-groep; ^# P < 0,05 versus de miR-301-remmer + si-NC-groep; een P < 0,05 versus de mimic-NC-groep; b P < 0,05 versus de si-NC-groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC-groep, N =3. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen tussen meerdere groepen

Geremde miR-301 of overexpressie van PTEN onderdrukt migratie en invasie van ESCC-cellen; Verhoogde miR-301 of verminderde PTEN induceert migratie en invasie van ESCC-cellen

Migratie- en invasiecapaciteiten van ESCC-cellen werden beoordeeld met behulp van de Transwell-assay. De resultaten suggereerden dat in de KYSE-30-cellijn (Fig. 4a, b), de celmigratie en invasiecapaciteiten werden beperkt door remming van miR-301 of overexpressie van PTEN; de onderdrukkende rol van miR-301-remmer bij celmigratie en invasiecapaciteiten werd omgekeerd door si-PTEN. In Eca109-cellijn (Fig. 4c, d) werden de celmigratie en invasiecapaciteiten bevorderd na de transfectie van miR-301-nabootsing of si-PTEN; tot overexpressie gebracht PTEN keerde de impact van miR-301-nabootsing op celmigratie en invasiecapaciteiten om. De bovenstaande bevindingen impliceerden dat de migratie en invasie van ESCC-cellen werden geremd door miR-301-repressie of PTEN-verhoging, terwijl ze werden vergemakkelijkt door miR-301-upregulatie of PTEN-downregulatie.

Geremd miR-301 of tot overexpressie gebracht PTEN onderdrukt migratie en invasie van ESCC-cellen; verhoogde miR-301 of verminderde PTEN bevordert migratie en invasie van ESCC-cellen. een Migratie- en invasiecapaciteiten van getransfecteerde KYSE-30-cellen beoordeeld met behulp van Transwell-assay na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; b statistische resultaten van gemigreerd en invasief in KYSE-30-cellen via Transwell-assay na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; c migratie- en invasiecapaciteiten van Eca109-cellen onder de groepen beoordeeld met behulp van Transwell-assay na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; d statistische resultaten van gemigreerd en invasief in Eca109-cellen via Transwell-assay miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie. *P < 0,05 versus de remmer-NC-groep; &P < 0,05 versus de oe-NC-groep; ^# P < 0,05 versus de miR-301-remmer + si-NC-groep; een P < 0,05 versus de mimic-NC-groep; b P < 0,05 versus de si-NC-groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC-groep, N =3. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen tussen meerdere groepen

Geremde miR-301 of overexpressie van PTEN induceert celcyclusstilstand en apoptose van ESCC-cellen; Verhoogde miR-301 of verminderde PTEN onderdrukt celcyclusstilstand en apoptose van ESCC-cellen

Flowcytometrie werd gebruikt om de celcyclusovergang en apoptose van cellen na transfectie te detecteren, en de resultaten gaven aan dat in de KYSE-30-cellijn (Fig. 5a-d), transfectie van miR-301-remmer of oe-PTEN de apoptotische snelheid bevorderde en verhoogde cellen in de GO/G1-fase, terwijl die in de S- en G2/M-fasen werd verlaagd; de verandering van apoptose en celcyclusstilstand geïnduceerd door miR-301-remmer kan worden teruggedraaid door si-PTEN.

Geremd miR-301 of tot overexpressie gebracht PTEN induceert stopzetting van de celcyclus en apoptose van ESCC-cellen; verhoogde miR-301 of verlaagde PTEN onderdrukt het stoppen van de celcyclus en apoptose van ESCC-cellen. een Celcyclusverdeling van KYSE-30-cellen in elke groep werd gedetecteerd door flowcytometrie na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; b statistische resultaten van percentage in G0 / G1-, S- en G2 / GM-fasen van KYSE-30-cellen in flowcytometrie na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; c apoptose van KYSE-30-cellen werd gedetecteerd door flowcytometrie na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; d apoptotische snelheid van getransfecteerde KYSE-30-cellen gedetecteerd met behulp van flowcytometrie na miR-310-downregulatie of PTEN-upregulatie; e celcyclusverdeling van Eca109-cellen in elke groep werd gedetecteerd door flowcytometrie miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; v statistische resultaten van percentage in G0/G1-, S- en G2/GM-fasen van Eca109-cellen in flowcytometrie na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; g apoptose van Eca109-cellen werd gedetecteerd door flowcytometrie na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie; u apoptotische snelheid van getransfecteerde Eca109-cellen gedetecteerd met behulp van flowcytometrie na miR-310-upregulatie of PTEN-downregulatie. *P < 0,05 versus de remmer-NC-groep; &P < 0,05 versus de oe-NC-groep; ^# P < 0,05 versus de miR-301-remmer + si-NC-groep; een P < 0,05 versus de mimic-NC-groep; b P < 0,05 versus de si-NC-groep; c P < 0,05 versus de miR-301 mimic + oe-NC-groep, N =3. Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie en ANOVA werd gebruikt voor vergelijkingen tussen meerdere groepen

Volgens de resultaten van flowcytometrie hebben we ontdekt dat in Eca109-cellijn (Fig. 5e-h), transfectie van miR-301-nabootsing of si-PTEN de apoptotische snelheid remde, cellen in de G0 / G1-fase verminderde en die van de S-fase en G2/M-fasen; PTEN-overexpressie keerde het effect van miR-301-nabootsing op de apoptotische snelheid en celcyclusstop van Eca109-cellen om. We concludeerden uit deze resultaten dat neerwaarts gereguleerde miR-301 of opgereguleerde PTEN de celcyclusovergang en apoptose in ESCC-cellen bevorderden, terwijl geremde miR-301 of onderdrukte PTEN tegenovergestelde effecten hadden.

Geremde miR-301 of overexpressie van PTEN remt tumorgroei en angiogenese in vivo in ESCC; Verhoogde miR-301 of verminderde PTEN verhoogt tumorgroei en angiogenese in vivo in ESCC

De groei en veranderingen van ESCC-tumoren bij naakte muizen werden in elke groep waargenomen. Tumorgroei werd beoordeeld en de resultaten impliceerden dat in KYSE-30-cellijn (Fig. 6a-e), naakte muizen die waren geïnjecteerd met miR-301-remmer of oe-PTEN het tumorvolume en -gewicht verminderden; de repressieve rol van miR-301-remmer bij tumorgroei werd afgeschaft door si-PTEN. In Eca109-cellijn (Fig. 6f-j) waren het tumorvolume en het tumorgewicht gevorderd in naakte muizen die waren geïnjecteerd met miR-301 mimic of si-PTEN; overexpressie van PTEN keerde het effect van miR-301-nabootsing op tumorgroei om. Ondertussen werd de expressie van CD34 in xenotransplantaten van naakte muizen beoordeeld met behulp van immunohistochemische kleuring en de bevindingen toonden aan dat (Fig. 7a-d) in KYSE-30 xenografts, MVD werd beperkt na miR-301 downregulatie of PTEN-upregulatie; tot zwijgen gebracht PTEN omgekeerde impact van miR-301-remming op MVD. In Eca109-xenotransplantaten was MVD verhoogd na miR-301-upregulatie of PTEN-downregulatie; de verbetering van MVD geïnduceerd door opgereguleerde miR-301 zou kunnen worden afgeschaft door tot overexpressie gebracht PTEN. Deze gegevens gaven aan dat miR-301-remming of PTEN-overexpressie de tumorgroei en angiogenese in ESCC onderdrukte, terwijl miR-301-verhoging of PTEN-silencing omgekeerde effecten hadden.

Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains tumor growth in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases tumor growth in ESCC. een Representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b–d changes of tumor volume of each group after KYSE-30 cells were transfected; e changes of tumor weight of each group after KYSE-30 cells were transfected; v representative figures for the tumor growth observed by subcutaneous tumorigenesis in nude mice after Eca109 cells were transfected; g–i changes of tumor volume of each group after Eca109 cells were transfected; j changes of tumor weight of each group after Eca109 cells were transfected. *P < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group; ^# P < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; a P < 0.05 versus the mimic-NC group; b P < 0.05 versus the si-NC group; c P < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups

Inhibited miR-301 or overexpressed PTEN restrains angiogenesis in ESCC; elevated miR-301 or reduced PTEN increases angiogenesis in ESCC. een Representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after KYSE-30 cells were transfected; b comparisons of MVD of KYSE-30 in tumor tissues among the groups; c representative images of tumor tissues observed by immunohistochemical staining in nude mice after Eca109 cells were transfected; d comparisons of MVD of Eca109 in tumor tissues among the groups *P < 0.05 versus the inhibitor-NC group; &P < 0.05 versus the oe-NC group; ^# P < 0.05 versus the miR-301 inhibitors + si-NC group; a P < 0.05 versus the mimic-NC group; b P < 0.05 versus the si-NC group; c P < 0.05 versus the miR-301 mimic + oe-NC group, n = 3 mice. Data were expressed as mean ± standard deviation, and ANOVA was used for comparisons among multiple groups

Discussie

EC is a kind of invasive malignancy in the gastrointestinal tract [16]. As the major type of EC, ESCC is a malignant tumor occurring in esophageal epithelial cells [17]. The miRNAs, known as small non-coding RNAs, have been demonstrated to function as a significant roles in leading molecules in the silencing of RNA [18]. Our research was designed to explore the effects of miR-301 and its target gene PTEN on ESCC progression, and we have found that the inhibited miR-301 could suppress angiogenesis and cell growth in ESCC by elevating PTEN.

MiR-301 expression was assessed, and we found that miR-301 was highly expressed in ESCC cells in comparison with HEEC, and the higher expression of miR-301 has also been found in ESCC tissues in contrast to the adjacent normal tissues. Similar to this result, Li et al. have identified that miR-301 presented high expression in myocardial infarction tissues [19]. In addition, we have elucidated that PTEN was targeted by miR-301, and the target relation has been pointed out by an extant literature [20]. We have also discovered that PTEN, which has been affirmed to be targeted by miR-301, was downregulated in both ESCC tissues and cells. Similarly, a previous research has unearthed that PTEN was poorly expressed in ESCC compared with non-tumor esophageal epithelial tissue [21]. Furthermore, Ma et al. have illuminated that PTEN expression was degraded in Eca109 cell line [22], which has also been selected for a series of experiments in this research. These studies provide evidence for the high expression of miR-301 and low expression of PTEN in ESCC.

Another important outcome in this research indicated that the inhibited miR-301 could repress the colony formation ability as well as the cell proliferation of ESCC cells via enhancing the PTEN expression, and elevated miR-301 or reduced PTEN had contrary effects. Similarly, Han et al. have elucidated that the downregulation of miR-301 mediated by luteolin has the ability to restrain the cell proliferation in prostate cancer [6]. A recent literature has revealed that the overexpression of PTEN suppresses the proliferation of pancreatic cancer cells [23], and a same result has been summarized in a study focusing on prostate cancer [24]. Besides, we have also unearthed that the downregulation of miR-301 or the elevation of PTEN could inhibit migration and invasion of ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN exhibited the opposite trends. In accordance with this outcome, Shi et al. have supported that inhibited miR-301 attenuated migration and invasion of breast cancer cells [10], and it has been reported that the migration and invasion of ESCC cells could be repressed by the inhibition of miR-130b and the elevation of PTEN [25]. These publications helped verifying the oncogenic role of miR-301 and tumor-repressive effect of PTEN in diverse human cancers. Another result in our research was that inhibited miR-301 overexpressed PTEN to promote cell apoptosis and induce cell cycle arrest at the G0/G1 phase in ESCC cells, and elevated miR-301 or reduced PTEN had the inverse results. Similarly, it has been uncovered by a recent literature that activated PTEN induces cell cycle arrest and apoptosis in ESCC [26]. Consistently, Tian et al. have found in their study that the elevation of PTEN inhibited the angiogenesis by reducing the expression of vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma [27]. Based on the above data, the roles of miR-301 and PTEN in cell apoptosis and angiogenesis in diverse diseases were further confirmed. Consequently, we concluded that the downregulation of miR-301 could restrain the tumor growth in ESCC through the high expression of PTEN, and the similar conclusion has also been unveiled in breast cancer [10] and prostate cancer [28]. On the contrary, miR-301 elevation or PTEN reduction induced the tumor growth in ESCC. It could be concluded that miR-301 and PTEN participated in the in vivo cancer cell growth.

Conclusion

In this study, we have shown that the repression of miR-301 prohibits angiogenesis, cell proliferation, migration and invasion but promotes apoptosis in ESCC cells by upregulating PTEN. This research may further the understanding on potential molecular mechanisms of ESCC and provide novel targets for ESCC treatment.

Afkortingen

ESCC:: Esophageal squamous cell carcinoma
PTEN:: Phosphatase and tensin homologue
MVD:: Microvessel density
EG:: Esophageal cancer
miRNAs:: MicroRNAs
LNM:: Lymph node metastasis
UICC:: Union for International Cancer Control
RT-qPCR:: Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction
3′UTR:: 3′-Untranslated region
WT:: Wild type
MUT:: Mutant type
HRP:: Horseradish peroxidase
FBS:: Foetaal runderserum
OE:: Overexpressed
NC:: Negative control
CCK-8:: Cell counting kit
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle medium
PI:: Propidiumjodide
FITC:: Fluoresceïne isothiocyanaat
MVD:: Microvessel density
ANOVA:: Analysis of variance

Gereguleerde oppervlaktemorfologie van polyaniline/polymelkzuur composiet nanovezels via verschillende anorganische zuren Doping voor het verbeteren van de biocompatibiliteit in weefseltechnologie SOX2 reguleert de lncRNA CCAT1/MicroRNA-185-3p/FOXP3-as om de proliferatie en zelfvernieuwing van baarmoederhalskankerstamcellen te beïnvloeden

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal