Ontwerpen van met aptameer gouden nanodeeltjes geladen pH-gevoelige liposomen kapselen morine in voor de behandeling van kanker

Resultaten en discussie

Karakterisering

De huidige studie had tot doel een nieuw liposoom te ontwikkelen dat de voordelen van nanodeeltjes (Apt-geladen Au NP's) bezit en effectief kan worden gebruikt als een middel tegen kanker. De basiseigenschappen van de nieuwe liposomen zijn belangrijk voor verder onderzoek. Apt-Au@MSL werd gesynthetiseerd zoals beschreven in een eerdere studie [23], met kleine aanpassingen, en vervolgens gekarakteriseerd met behulp van verschillende methoden (Fig. 3). Figuur 3b presenteert de resultaten van UV-vis-spectroscopie, die de karakteristieke piek laat zien en de vorming van Au NP's kan volgen. Karakteristieke pieken werden waargenomen in het UV-vis spectrum van Au NP's bij ongeveer 530 nm. In het bijzonder vertoonde UV-vis-spectra-analyse een sterke UV-absorptie, die werd beïnvloed door Apt-modificatie van het oppervlak. Dezelfde resultaten werden waargenomen. Karakteristieke pieken werden verplaatst nadat pH-gevoelige liposomen waren gecoat met Morin. De karakteristieke piek van de gefabriceerde Apt-Au@MSL bevond zich op 362 en 550 nm. Deze resultaten gaven aan dat de synthese met succes was voltooid. Voor verdere karakterisering werd FT-IR-spectroscopie uitgevoerd om de resultaten van de synthese te verifiëren. De karakteristieke rode verschuiving van pieken van Morin-liposomen en Apt-Au@MSL duidden verder op de succesvolle modificatie van Morin (figuur 3c). We hebben Morin-afgiftetest uitgevoerd in PBS op verschillende pH-niveaus om de pH-gevoeligheid van Apt-Au@MSL te bepalen. Deze drie pH-waarden simuleren de neutrale omgeving van de bloedcirculatie, de licht zure omgeving van de tumor en de zure omgeving van het intracellulaire lichaam. Het afgiftepercentage van Morin werd gedetecteerd met UV-vis-spectroscopie. Bij pH  5,0 kwam ongeveer 54% Morin vrij binnen 24 h, en continue afgifte werd waargenomen in de volgende 96 h; ondertussen werd bij pH   7,4 slechts ongeveer 10% Morin binnen 24 uur vrijgegeven. Deze resultaten laten zien dat Apt-Au@MSL een goede stabiliteit vertoont onder normale fysiologische omstandigheden, waardoor medicijnlekkage wordt voorkomen; het medicijn komt echter snel vrij in het kernlichaam. Dit gedrag van medicijnafgifte kan het effect van de behandeling effectief verbeteren (figuur 3d). TEM en SEM werden uitgevoerd om de structuren van het liposoom en Apt-Au@MSL op te helderen (figuur 3f). TEM werd uitgevoerd om de structuren van de AuNP's op te helderen. Zoals weergegeven in figuur 3g, hebben de AuNP's een deeltjesgrootte van ongeveer 10 nm, wat consistent is met de grootte van de modificatie op de liposomen (figuur 3g). De SEM-resultaten in Fig. 3e geven aan dat onbewerkte liposomen uitsluitend unilamellaire blaasjes vormen met een niet-uniforme diameter van ongeveer 120 nm, wat consistent is met de grootte bepaald door DLS. Daarentegen laat Apt-Au@MSL zien dat de morfologie van hybride blaasjes wordt toegeschreven aan Au-Apt-modificatie. De diameter van 150 nm was ook consistent met de grootte bepaald door DLS (Fig. 3i). Met name TEM-onderzoek van de interacties tussen de pH-gevoelige liposomen en Au-Apt onthulde dat de Au NP's bijna uitsluitend geassocieerd waren met de vesiculaire lipidedubbellaag en gelokaliseerd waren aan de periferie van de blaasjes (figuur 3h). De ζ-potentiaalmetingen worden weergegeven in Fig. 3j en de zeta-potentialen van Au NP's en Au-Apt zijn negatief. Het resultaat laat zien dat zowel Au NP's (− 57.1 ± 0.3 mV) als Au-Apt negatief geladen zijn (− 31,7 ± 0.2 mV). Apt-Au@MSL werd gemodificeerd met positief geladen Morin-liposomen en de potentiaal veranderde in 36,4 ± 0,3 mV. Positieve en negatieve ladingsadsorptie is het mechanisme waarmee Au-Apt en Morin-liposomen binden. Bovendien geeft figuur 3k de verandering in de inkapselingssnelheid van het deeltje in de loop van de tijd weer, wat de stabiliteit van het deeltje in de loop van de tijd aangeeft. Zoals te zien is in figuur 3k, verandert de inkapselingssnelheid van het deeltje nauwelijks binnen 24 h, wat aangeeft dat het deeltje een goede stabiliteit vertoont over een bepaalde periode. De standaardcurve van Morin-concentratie versus de UV-Vis-absorptie van Morin werd opgesteld om de inkapselingssnelheid van Morin-liposoom en Apt-Au@MSL te bestuderen. De resultaten lieten zien dat de invangefficiëntie van Morin-liposoom en Apt-Au@MSL 90,2% en 89,6% kan bereiken, zoals weergegeven in Tabel S1 en Fig. S1

Karakterisering afbeeldingen. een Schematische weergave van de synthese van Apt-Au@MSL. b Ultraviolette absorptiespectra van Morin, Au NP's, Au-Apt, Morin-liposoom en Apt-Au@MSL. c FT-IR-spectrometers van Morin, Morin-liposoom en Apt-Au@MSL. d Het afgiftegedrag van Morin van Apt-Au@MSL bij verschillende pH-omstandigheden. e SEM-beeld van het Morin-liposoom. v SEM-afbeelding van de Apt-Au@MSL. g TEM-afbeelding van de Au NP's. u TEM-afbeelding van de Apt-Au@MSL. ik Diameters van Morin-liposoom en Apt-Au@MSL zijn ten minste driemaal bepaald via DLS. j ζ-Potentieel van Au NP's, Apt-Au en Apt-Au@MSL. k Beknellingsefficiëntie (EE%) van Morin-liposoom en Apt-Au@MSL

Antikankeractiviteitstest van Apt-Au@MSL

In vitro

Morin vertoont superieure antitumoractiviteit maar heeft een lage biologische beschikbaarheid vanwege de lage oplosbaarheid in water. Nadat Morin was ingekapseld door pH-gevoelige liposomen en getransformeerd in een in water oplosbaar materiaal, werd het oppervlak van het liposoom gemodificeerd met Au-Apt om het beoogde antitumoreffect te verkrijgen. Figuur 4a toont de antikankeractiviteit van Apt-Au@MSL door MTT-assay in vitro. De geneesmiddelconcentratie wordt bepaald door de Morin-concentratie. De met Morin behandelde groep vertoonde geen duidelijke antikankeractiviteit, vergeleken met de blanco groep. De groep die werd behandeld met Morin ingekapseld door pH-gevoelige liposomen vertoonde echter verhoogde antikankeractiviteit. Het resultaat suggereert dat de antitumoractiviteit van Morin-liposomen superieur was aan die van onbewerkte Morin. Tegelijkertijd vonden we dat de antitumoractiviteit van het liposoom gemodificeerd door Apt (Apt-Au@MSL) was verbeterd. Tabel 1 geeft een overzicht van de IC₅₀ waarden van Morin, Morin-liposomen, Apt-Au@MSL en cisplatine. Morin, Morin-liposomen en Apt-Au@MSL vertoonden een breed scala aan antikankeractiviteit op tumorcellen. Ze vertoonden een duidelijke voorkeur voor SGC-7901-cellen met een hoge potentie en lage toxiciteit voor normale menselijke cellen. De IC₅₀ waarde van Apt-Au@MSL was 15,6 ± 1,5 μg/ml voor de SGC-7901-cellen. Deze resultaten werden verder bevestigd door RTCA-testen. De SGC-7901-cellen werden in verschillende concentraties gekweekt met Apt-Au@MSL; de blanco groep werd behandeld met PBS en de controlegroep bestond uit Morin en Morin-liposomen. Adhesie en verspreiding werden gevolgd met behulp van iCELLigence (Fig. 4b). De resultaten waren grotendeels vergelijkbaar met die verkregen door MTT-testen. De antitumoractiviteit van Apt-Au@MSL was significant hoger dan die van Morin en Morin-liposomen. Apt-Au@MSL zou de proliferatie van SGC-7901-cellen kunnen remmen met een verhoging van de concentratie. Veranderingen in celmorfologie na behandeling met Apt-Au@MSL werden ook waargenomen met fluorescentiemicroscopie. Zoals weergegeven in figuur 4c, behouden de SGC-7901-cellen zonder Apt-Au@MSL de structurele integriteit van de cel. Daarentegen wordt de celintegriteit aangetast nadat cellen zijn behandeld met Apt-Au@MSL in verschillende concentraties.

een Levensvatbaarheid van de cellen van SGC-7901-cellen geïncubeerd met ander materiaal (Morin, Au-Apt, Morin-liposoom en Apt-Au@MSL) in verschillende concentraties (0, 5, 10, 15, 20 en 30 g/ml). De door PBS behandelde cel werd als blanco groep ingesteld. b De celproliferatiecurve van SGC-7901-cellen werd gedetecteerd door het RT-CES-systeem. De verschillende verbindingen werden toegevoegd bij 10 h. De concentraties van a , b , en c zijn verschillende Apt-Au@MSL (10, 20 en 30 μg/mL), respectievelijk. c De heldere celbeelden bij de verschillende concentraties (0, 2,5, 5, 10, 20 en 30 μg/mL)

Apoptotische celdoodanalyse

Kwantitatieve analyse van apoptose werd uitgevoerd door flowcytometrie met behulp van Annexin-FITC-kleuring. De cellen werden gekleurd met PI en Annexine V-FITC en vervolgens geanalyseerd met behulp van een CytoFLEX-flowcytometer (Beckman Coulter). Annexine V werd gebruikt om vroege apoptotische cellen gebonden aan de blootgestelde fosfatidylserine te detecteren, en PI-labeling werd gebruikt om de late apoptotische cellen te kleuren. De apoptose-ratio was 1,57% voor de blanco groepen. De met Morin behandelde cellen vertoonden een apoptoseverhouding van 3,51%. Apt-Au@MSL vertoonde bij verschillende concentraties een hoger inducerend vermogen met apoptoseverhoudingen van 7,44%, 10,75%, 15,53% en 40,77% (Fig. 5). De versterkte apoptose bevestigde ook de uitstekende antikankeractiviteit die wordt veroorzaakt door Apt-Au@MSL. De apoptoseverhouding van de SGC-7901-cellen nam toe met een verhoogde Apt-Au@MSL-concentratie.

Op annexine V-FITC/PI-kleuring gebaseerde flowcytometrie-analyse van SGC-7901-apoptose na behandeling met verschillende methoden. De concentratie van a , b , c , en d is respectievelijk 5, 10, 20 en 30 g/ml

Antikankeractiviteitsonderzoek door fluorescentieassay

Het antitumoreffect op SGC-7901-cellen, geïnduceerd door Apt-Au@MSL, werd intuïtief geëvalueerd met LIVE/DEAD-fluorescentie-assays. Nadat cellen waren geïncubeerd met Morin, Morin-liposomen en Apt-Au@MSL in verschillende concentraties, werden ze gedurende 30 min onder donkere omstandigheden samen met de LIVE/DEAD-kit gekleurd. In Fig. 6 laten de cellen in de blanco groep zien dat alle groene fluorescentiecellen levende cellen vertegenwoordigen. De controlegroepen, waaronder Morin en Morin-liposomen, tonen het aantal rode fluorescerende cellen. De cellen die werden behandeld met Apt-Au@MSL in verschillende concentraties vertoonden echter duidelijk een groot aantal apoptotische cellen. Met een toename van de concentratie namen levende cellen geleidelijk af. Het percentage dode cellen nam voornamelijk toe en de celdichtheid nam af. Het resultaat bevestigde dat Apt-Au@MSL tumorapoptose effectief kan bevorderen.

Fluorescentiemicroscopische beelden van SGC-7901 geïncubeerd met verschillende concentraties Apt-Au@MSL en daaropvolgende korte kleuring. De blanco groep was PBS. De Morin en Morin-liposoom werden ingesteld als controlegroep

Onderzoek naar celintegriteit

Om de invloed van opname en transport van de Apt-Au@MSL naar de SGC-7901-cel te bevestigen, hebben we een TEM-assay uitgevoerd. De verandering in celmorfologie werd waargenomen door TEM. TEM-beelden werden uitgevoerd om de interne structuur van de cellen te observeren en een referentie te bieden voor antikankermechanismen. Zoals weergegeven in figuur 7, vertoonden de blanco afbeeldingen van de SGC-7901-cellen zonder behandeling significante veranderingen in de morfologie en het uiterlijk van heldere celwanden. In de controlegroep (Morin en Morin-liposomen) vertoonde de celmorfologie gedeeltelijke schade en trok het nucleaire gebied samen. Er werden echter ook significante veranderingen in de celwand en interne structuur waargenomen na blootstelling aan Apt-Au@MSL. Het cytoplasma lekte en de nucleaire structuur werd onduidelijk. Rond holle cellen werden veel celfragmenten gevormd. Bovendien vielen de celwanden uiteen of werden vernietigd. Hele profielen werden onduidelijk, cellen werden beschadigd en het cytoplasma lekte. De rode pijlen vertegenwoordigden het Au NP-gebied. As the concentration of the Apt-Au@MSL increased, more Au NP regions appeared in the nucleus. This occurrence suggested the release of Morin after Apt-Au@MSL entered the cell interior, hence the appearance of a large amount of Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.

TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs

Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL

To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.

Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. een SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. d , e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P  < 0.05, **P  < 0.01

Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth

In Vivo

The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.

een In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). b Tumor weight of mice in different groups after 24 days. c Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. d Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n  = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P  < 0.05, **P  < 0.01

Histological Analysis of Anticancer Activity

H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.

een H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. b Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)

In Vivo Toxicity Evaluation

The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.

In vivo toxicity evaluation. een Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. b Weight of mice in different groups after 24 days. c Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n  = 3)