Biosynthese en antibacteriële activiteit van zilvernanodeeltjes met behulp van gistextract als reducerende en afdekkende middelen

Resultaten en discussie

Synthese van Ag NP's

Zoals schematisch geïllustreerd in Schema 1, begon de bereiding van Ag NP's met de zelfassemblage van biomoleculen in het gistextract om gistmicellen te vormen. Dan, Ag ⁺ werd in situ verminderd door de reductiemiddelen in het gistextract, waaronder aminozuren, vitamines en koolhydraten. De gevormde Ag-nanodeeltjes werden gestabiliseerd door de biomoleculen. De oppervlaktecoating op Ag NP's verhoogde de affiniteit voor het bacteriële membraan, waardoor de permeabiliteit van de celwand toenam. De interactie tussen Ag NP's en peptidoglycaan veranderde de configuratie van peptidoglycaan, wat uiteindelijk leidde tot het apoptoseproces om de bacteriën te beschadigen.

Voorgestelde schematische illustratie van de biosynthese van Ag NP's

Structurele karakterisering van Ag NP's

Zoals getoond in Fig. 1a, toonde het typische SEM-beeld aan dat de gesynthetiseerde Ag NP's een bolvorm en fijne grootte hebben. De EDX bevestigde de vorming van Ag NP's (figuur 1b). Een sterke optische absorptiepiek werd waargenomen bij ongeveer 3 keV, wat een typische optische absorptiepiek is van zilveren nanokristallieten voor oppervlakteplasmonresonantie. De kleine hoeveelheden zuurstof en koolstof kunnen worden toegeschreven aan de dunne laag organische afdekking op de gesynthetiseerde Ag NP's. De reactie van AgNO₃ oplossing met NaOH leidt tot de vorming van een kleine hoeveelheid Ag₂ O. Daarom kan een kleine hoeveelheid O ook worden toegeschreven aan de aanwezigheid van Ag₂ O. De morfologie en grootte van de Ag NP's werden verder gekenmerkt door TEM met hoge resolutie (HRTEM). De Ag NP's varieerden in diameter van 10,3 tot 18,9 nm (figuur 1c), met een gemiddelde grootte van 13,8 nm (figuur 1d). De grootte, vorm en oppervlaktechemie van Ag NP's toonden een belangrijk effect op de antimicrobiële activiteit. Door de kleinere omvang en het grotere oppervlak konden de Ag NP's beter interageren met het bacteriële membraan voor een verdere verbeterde antimicrobiële activiteit [15,16,17]. De heldere roosterranden in het HRTEM-beeld vertoonden een randafstand van 0, 15 nm (figuur 2a), wat overeenkomt met de (220) vlakken van zilver. Zoals getoond in Fig. 2b, werd de kristallijne aard van de Ag NP's aangetoond door de typische geselecteerde gebiedsdiffractie (SAED) -patronen, waarbij de heldere cirkelvormige ringen overeenkomen met de (311), (220), (200) en ( 111) vliegtuigen [18, 19].

een Veldemissie SEM-beeld van Ag NP's, b EDX-spectrum van Ag NP's, c TEM-afbeelding van Ag NP's en d grootteverdeling van Ag NP's

een Roosterranden van Ag NP's in de HR-TEM-afbeelding, b cirkelvormige ringen van Ag NP's van de typische patronen voor geselecteerde gebiedsdiffractie (SAED)

Het UV-Vis-spectrum van Ag NP's vertoonde een sterke piek bij 418 nm, wat te wijten was aan oppervlakteplasmonresonantie (figuur 3a). Een gele oplossing van gesynthetiseerde Ag NP's wordt getoond in Fig. 3b, die de vorming van Ag NP's aangeeft. De XRD-patroonanalyse van de gesynthetiseerde Ag NP's toonde vier intense pieken bij 77,36 °, 64,30 °, 43,52 ° en 38,16 °, overeenkomend met de (311), (220), (200) en (111) vlakken voor zilver, respectievelijk (Fig. 3c). De gegevens werden bevestigd door standaard zilvergegevens van JCPDS-kaart nr. 04-0783 [20]. Het XRD-patroon toonde de kristallijne aard van de gesynthetiseerde Ag NP's aan, in overeenstemming met een eerder rapport [21]. FTIR-analyse werd gebruikt om de potentiële biomoleculen op de gesynthetiseerde Ag NP's te karakteriseren en te identificeren (Fig. 3d). De brede band op 3405 cm ⁻¹ komt overeen met −OH uitrekken [22]. De zwakkere piek bij 2915 cm ⁻¹ wordt toegewezen aan de −CH2 rektrilling. De band op 1655 cm ⁻¹ in het gistextract is te wijten aan de C=O-rektrilling van carboxylgroepen, en deze band verschuift naar 1573 cm ⁻¹ in Ag NP's, vanwege de interactie tussen carboxylgroepen en Ag NP's [23]. De scherpe piek van 1375 cm ⁻¹ wordt toegeschreven aan de C-N rektrilling. De banden op 1048 cm ⁻¹ en 1083 cm ⁻¹ worden toegewezen aan de strektrillingen van respectievelijk C–O–C en C–OH [24, 25]. Deze resultaten toonden aan dat biomoleculen van het gistextract verantwoordelijk waren voor de biosynthese van Ag NP's. De oppervlaktecoating op Ag NP's beïnvloedde de affiniteit voor het bacteriële membraan [26, 27]. De toestanden van Ag NP's werden verder gekenmerkt door XPS. Zoals getoond in Fig. 4a, werd de volledige scan van het XPS-spectrum met duidelijke pieken toegeschreven aan C 1s , Ag 3d , Ag 3p , Ag 3s , en O 1s . De Ag 3d (5/2) en Ag 3d (3/2) pieken werden waargenomen bij bindingsenergieën van respectievelijk ongeveer 368,5 en 374,5 eV (figuur 4b). Deze energiesplitsingswaarde van 6,0 eV toonde de vorming van Ag NP's [28, 29].

een UV-Vis-spectrum van Ag NP's, b foto van gesynthetiseerde Ag NP's, c XRD-patroon van Ag NP's en d FTIR-spectrum van Ag NP's en gistextract

een De volledige scan van het XPS-spectrum van Ag NP's en b het Ag 3d XPS-spectrum

De oppervlaktelading van Ag NP's werd bepaald door het Malvern Zeta Nano ZS-90-instrument, wat een belangrijke parameter is voor stabiliteit en dispersie van de colloïdale oplossingen. De zeta-potentiaal is de oppervlakte-elektrostatische potentiaal op de grens tussen de diffuse laag en de compacte laag van nanodeeltjes, en die een indicator is voor toepassingen van biomedische polymeren [30]. Zoals getoond in Aanvullend bestand 1:Fig. S1, bij een lagere pH-waarde van 3, onthulde het zeta-potentiaal van Ag NP's een licht negatieve lading (− 3,2 mV). Het zeta-potentieel van Ag NP's nam monotoon af van − 12,1 mV bij pH  7.0 tot − 24,4 mV bij pH  11,0, wat de negatief geladen groepen op het oppervlak van Ag NP's bevestigde. Gao et al. rapporteerde dat de dispersie en stabiliteit van Ag NP's voornamelijk toe te schrijven zijn aan de oppervlaktelading [31]. De aanwezigheid van negatief geladen groepen verbetert de stabiliteit en dispersie van Ag NP's in waterige oplossingen [32].

Cytotoxiciteit van Ag NP's en analyse van biomoleculen

De biocompatibiliteit van de gesynthetiseerde Ag NP's is belangrijk voor hun verdere biomedische toepassing. Om de cytotoxiciteit van de Ag NP's te onderzoeken, werd de cellevensvatbaarheid van Cos-7-cellen gedetecteerd door de MTS-assay. De Cos-7-cellen werden gedurende 24 uur geïncubeerd met Ag NP's in verschillende concentraties. Zoals getoond in Fig. 5a, werd geen significante cytotoxiciteit onthuld wanneer cellen werden behandeld met de Ag NP's in concentraties zo hoog als 200 g / ml. Er kan worden geconcludeerd dat de Ag NP's verwaarloosbare cytotoxiciteit en goede biocompatibiliteit met Cos-7-cellen vertoonden.

een Cytotoxiciteit van Ag NP's in Cos-7-cellen en, b SDS-PAGE-analyse. Baan 1:laadbufferbesturing. Lanen 2-4:gesynthetiseerde Ag NP's. Baan 5:gistextract gecentrifugeerd met 8000 rpm

Om de synthetische mechanismen van de gesynthetiseerde Ag NP's te onderzoeken, analyseerden we biomoleculen op het oppervlak van Ag NP's en gistextract. Zoals getoond in Fig. 5b, toonde de SDS-PAGE-analyse geen detecteerbaar of marginaal eiwit op het oppervlak van de gesynthetiseerde Ag NP's of in het gistextract. De biomoleculen in het gistextract hebben we verder bepaald met een high-speed aminozuuranalysator. Zoals samengevat in Aanvullend bestand 1:Tabel S1 met ondersteunende informatie, zijn er ongeveer 22 soorten aminozuren in het gistextract die rijk zijn aan glutaminezuur, γ-aminoboterzuur, ornament en alfa-linoleenzuur. Het iso-elektrische punt van deze aminozuren is ongeveer 6, behalve dat van lysine en arginine ongeveer 10-11. Daarnaast bevat een verscheidenheid aan componenten met −NH₂ , zoals ureum, ammoniak, asparagine en glutamine, kunnen worden gevonden. De biomoleculen van reductieve aminozuren, alfa-linoleenzuur en koolhydraten in het gistextract spelen een belangrijke rol bij de vorming van Ag NP's. Er werd gemeld dat NADH-afhankelijke reductase [33, 34] of het nitraatreductase-enzym betrokken is bij het reductieproces [35,36,37] in de biosynthese van Ag NP's via het micro-organisme-extract.

Biomoleculen van het gistextract spelen een beslissende rol bij de vorming van Ag NP's door ze te beschermen tegen aggregatie. Stabilisatoren van biomoleculen helpen overtollige reacties tussen Ag NP's te voorkomen [38]. De amfotere moleculen van aminozuren bevatten zowel basische als zure groepen. De nettolading van deze aminozuurverbindingen kan negatief of positief zijn, afhankelijk van de pH-veranderingen van de gistextractoplossing, wat het bindingsvermogen tijdens de synthese van Ag NP's verder beïnvloedt [39]. In de alkalische oplossing dragen aminozuren op het oppervlak van Ag NP's netto negatieve ladingen die de elektrostatische afstotingsinteracties maximaliseren [40,41,42]. De biomoleculen uit het gistextract fungeren als een afdekmiddel en spelen een sleutelrol bij het regelen van de grootteverdeling, vorm en morfologie bij de vorming van Ag NP's. De waarde van pH is een belangrijke factor met een effect op de gecontroleerde synthese van Ag NP's in het onderzoek. Wanneer de pH-waarde lager is dan 7, vindt kiemvorming met een lage snelheid plaats. Ag NP's kunnen bij hogere pH-waarden in enkele minuten worden gevormd en de deeltjesgrootte neemt af met de toenemende pH-waarden van de oplossing. De optimale balans tussen de groeiprocessen en nucleatie werd aangetoond [43]. De onstabiele en geagglomereerde Ag NP's kwamen altijd voor in het reductieproces van oplossingen met extreme pH-waarden (> 11) [44].

Antibacteriële activiteit

E. coli is uitgebreid geëvalueerd voor de antimicrobiële activiteit van Ag NP's. De groei van E. coli in de aanwezigheid of afwezigheid van Ag NP's bewijst het antimicrobiële vermogen. Zoals getoond in Fig. 6a vertoonden de gesynthetiseerde Ag NP's significante antibacteriële activiteit op een concentratieafhankelijke manier tegen E. coli . De groeiremmingstest toonde een volledige vermindering van E. coli bij Ag NP-concentraties boven 20,0 g/ml in vergelijking met de negatieve controle. De halve remmende concentratie (EC₅₀ ) Ag NP's was 13,4 g/ml. De dosis van 20,0 g/ml Ag NP's vertoonde een significant antibacterieel effect tegen E. coli gedurende de geteste tijd, terwijl de 10,0 g/ml Ag NP's een gedeeltelijk remmend effect vertoonden (Fig. 6b).

een De groeiremming van E. coli en b tijdsverloopanalyse van het antibacteriële effect

Om te onderzoeken of de Ag NP's echt de antibioticaresistente bacteriële cellen aantasten, evalueerden we de antibacteriële activiteit van Ag NP's tegen ampicilline-resistente E. coli door kolonievormende eenheidstest. E. coli -Amp ⁺ brengt stabiel een hoog aantal kopieën van pcDNA3.4-plasmide tot expressie dat het β-lactamase-gen bevat dat ampicillineresistentie verleent aan E. coli [45]. De E. coli -Amp ⁺ cellen werden gekweekt in de LB-agarplaat bij de behandeling met alleen ampicilline of bij de combinatiebehandeling met Ag NP's. De remmende activiteit van de bereide Ag NP's wordt weergegeven in Fig. 7. Opgemerkt werd dat de Ag NP's in combinatiebehandeling met ampicilline superieure antibacteriële activiteit vertoonden vergeleken met ampicilline alleen. Daarentegen heeft de behandeling van ampicilline alleen geen remmende activiteit op E. coli -Amp ⁺ . Combinatietherapie van antibiotica en Ag NP's biedt een complementaire strategie om antibioticaresistente bacteriële cellen te overwinnen, wat de huidige therapeutische benaderingen verder verbetert. De algemene resultaten die in deze studie worden gepresenteerd, dragen bij aan de ontwikkeling van alternatieve antibacteriële remmers voor de behandeling van bacteriële infecties veroorzaakt door multiresistente bacteriestammen.

De groei van E. coli -Amp ⁺ bij behandeling met alleen ampicilline (50 g/ml) of in combinatie met Ag NP's (25 g/ml). een Hoge dichtheid en b lage dichtheid van E. coli -Amp ⁺ cellen

Er is grote behoefte aan nieuwe medicijnen met verschillende mechanismen om bacteriële resistentie tegen te gaan. Vanwege hun krachtige antimicrobiële activiteit zijn Ag NP's gebruikt in medische producten, producten voor persoonlijke verzorging en textiel. Er zijn meerdere mechanismen waarmee Ag NP microbiële resistentie bestrijdt [46]. Ag NP's hoopten zich op op het bacteriële membraanoppervlak, waardoor de permeabiliteit van de celwand toenam. De interactie tussen Ag NP's en peptidoglycaan veranderde de configuratie van peptidoglycaan en beschadigde zo het bacteriële membraan [47]. De kenmerken van vorm, oppervlaktestructuur, morfologie, dispersiteit en biocompatibiliteit van Ag NP's spelen een belangrijke rol in hun antimicrobiële activiteit.