Met behulp van Omniscan-geladen nanodeeltjes als een tumor-gerichte MRI-contrastmiddel in oraal plaveiselcelcarcinoom door Gelatinase-Stimuli-strategie

Resultaten en discussie

Karakterisatie van mPEG-Pep-PCL-nanodeeltjes

De ¹ H NMR(CDCl₃ ) spectra van mPEG-Pep-PCL-copolymeren bevestigden dat het peptide met succes werd geconjugeerd met mPEG en dat de mPEG-Pep-conjugaten met succes werden geconjugeerd met PCL (Fig. la). De molverhouding van hydrofiel blok tot hydrofoob blok (mPEG/PCL) in mPEG-Pep-PCL-copolymeer was ongeveer 0,95 op basis van de integrale verhouding van -CH2-O- (4,04 ppm) in PCL-segment tot -CH2-CH2-O ( 3,65 ppm) in mPEG-segment van ¹ H NMR-meting.

een ¹ H nucleaire magnetische resonantiespectra (300 MHz, 25μC) van PEG-Pep-PCL in CDCl3. b De diameter en polydispersiteitsindex van blanco NP's en omn-geladen NP's (0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL). c De stabiliteit van omn-geladen NP's (0,1 mL, 0,2 mL, 0,3 mL). d TEM-microfoto's van blanco NP's en omn-geladen NP's. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviaties van drie afzonderlijke metingen

Partikelgroottes en stabiliteit van NP's

De deeltjesgroottes en polydispersiteitsindex (PDI) werden bepaald door DLS (figuur 1b). Er werden geen significante verschillen in deeltjesgrootte tussen de drie Omn-NP's gevonden (p> 0,05), terwijl er significante verschillen werden gevonden tussen Omn-NP's en blanco-NP's (p <0,05). Voor de PDI werden geen significante verschillen gevonden tussen deze Omn-NP's (p> 0,05), maar er waren significante verschillen tussen Omn-NP's en blanco-NP's (p <0,05).

Voor de stabiliteit van Omn-NP's werden geen neerslag en duidelijke verandering in grootte waargenomen in alle drie de Omn-NP's (figuur 1c), wat aangaf dat Omn-NP's stabiel waren.

Morfologische studies van NP's

De TEM-microfoto's van blanco NP's en Omn-NP's worden weergegeven in Fig. 1d. De afgeplatte vorm kon ook worden waargenomen in zowel blanco-NP's als Omn-NP's en de Omn-NP's waren veel kleiner dan blanco-NP's vanwege hun verschillende groottes. Bovendien was de Omn in de NP's duidelijk te onderscheiden, die in de NP's als donkere deeltjes verscheen. Dit Omn-deeltje kon verspreid binnen de NP's worden waargenomen.

Inhoud voor het laden van medicijnen en efficiëntie van inkapseling

De inhoud van het medicijnbelading en de inkapselingsefficiëntie van de drie Omn-NP's worden weergegeven in Tabel 1. Het resultaat toonde aan dat 0,3 mL Omn de hoogste medicijnbelading had, maar de inkapselingsefficiëntie was vrij laag, en 0,1  mL Omn had de hoogste inkapselingsefficiëntie en relatief dichtbij medicijnbelading met 0,2 mL en 0,3 mL Omn. Gezien zowel de medicijnbelading als de inkapselingsefficiëntie, werden 0,1  mL Omn-NP's gebruikt in het laatste in vivo MRI-onderzoek. De lage inkapselingsefficiëntie gaf ook aan dat in het reactiesysteem de Omn die we hebben toegevoegd voldoende was voor NP's.

Macroscopische en microscopische morfologische veranderingen van Omn-NP's en Con-Omn-NP's als reactie op collagenase IV

Om de splitsing van NP's als reactie op gelatinase (collagenase IV) te verifiëren, werden de macroscopische en microscopische morfologische veranderingen van Omn-NP's en Con-Omn-NP's na incubatie met Hank's oplossing die 2  mg / ml collagenase IV bevatte geëvalueerd. A1 en B1 toonden de transparante oplossingen van Con-Omn-NP's voor en na incubatie met collagenase IV, en A2 en B2 toonden aan dat er geen verandering werd gevonden voor de microscopische morfologie van Con-Omn-NP's met behulp van TEM voor en na incubatie. C1 en D1 toonden de oplossingen van Omn-NP's voor en na incubatie met collagenase IV. D1 toonde aan dat de vloeistof troebel werd toen precipitatie plaatsvond in de Omn-NP-oplossingen na 24 h. D2 toonde de TEM-beelden van Omn-NP's als reactie op collagenasen IV, de structuren van NP's werden afgebroken (figuur 2). Dit resultaat gaf aan dat onze NP's gelatinase-stimuli waren:de splitsing van het peptide zou de NP's opbreken en de geladen medicijnen zouden vrijkomen. En het kenmerk van het splitsen van het peptide om de geladen medicijnen vrij te maken, werd ook aangetoond via medicijnafgifte en in ons eerdere onderzoek [12, 18].

a1 , a2 , b1 , b2 , c1 , c2 , d1 , d2 Macroscopische en microscopische morfologische verandering van Omn-geladen mPEG-PCL NP's (Con-Omn-NP's) en Omn-geladen mPEG-Pep-PCL NP's (Omn-NP's) na incubatie met collagenase IV

In vitro cellulaire opnamestudies

De cellulaire opname van met coumarine-6 ​​geladen NP's wordt getoond in Fig. 3. De groene fluorescentie van coumarine-6 ​​werd getoond in het cytoplasma van de HSC3-cellen, wat suggereert dat coumarine-6 ​​samen met NP's het cytosol binnenging. Omdat coumarine-6 ​​oorspronkelijk was opgesloten in de NP's, wat aangaf dat onze NP's effectief celmembraanbarrières konden binnendringen en zich via endocytose in het celcytoplasma konden verspreiden.

a, b In vitro HSC3 cellulaire opnamestudies van nanodeeltjes. Confocale microscopiebeelden van HSC3-cellen na incubatie met coumarine-6-geladen NP's

MR-beeldvorming in vivo met Omn-NP's en Omn als contrastmiddelen

Beelden werden verkregen voordat Omn-NP's en Omn intraveneus werden toegediend in een dosis van 0,025 µmmol/kg (Gd ³⁺ ) van 2 groepen. Post-contrastbeelden werden vervolgens verkregen op 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min en 180 min na injectie (Fig. 4a). Het signaal van tumor-naar-achtergrond (TBR ) verhouding werd berekend en gebruikt als een kwantificeerbare indicator voor evaluatie met behulp van Omn-Nps vergeleken met Omn. De resultaten toonden aan dat de maximale TBR voor Omn-NP's 2,23 ± 0,10 en 1,48 ± 0,01 voor Omn was, de tijd tot piek 30 min was voor Omn-NP's en 5 min voor Omn, en de duur van de signaalversterking was 180 min voor Omn- NP's en 30 min voor Omn (figuur 4b). Er was een significant verschil voor maximale TBR en retentietijd tussen de twee groepen (p <0,05). Hoewel onze Omn-NP's een relatief lage medicijnbelasting hadden, werd superieure verbeterde in vivo MR-beeldvorming aangetoond in vergelijking met Omn alleen. Dit bewees ook dat onze Omn-NP's gelatinase-stimuli en tumorspecifiek waren.

een , b Axiale MRI-beelden en lijndiagram van tumor-tot-achtergrondverhouding van xenotransplantaatmodel van menselijke OSCC op de aangegeven tumorposities verkregen met een T1-gewogen sequentie. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviaties van drie afzonderlijke metingen

Ondanks dat recent geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals single-photon emissie computertomografie [19], positron emissie tomografie (PET) [20] en optisch beeld [21] werden gebruikt bij de diagnose van OSCC, is MRI nog steeds de meest gebruikte en betrouwbare hulpmiddelen voor het stadiëren van hoofd-halstumoren volgens het TNM-stadiëringssysteem voor kanker [1] en gadoliniumchelaten zijn nog steeds de meest gebruikte MRI-contrastmiddelen [22].

Om het doel te bereiken om tumor specifiek voor MRI-contrastmiddel te targeten, zijn actieve en passieve targetingstrategieën gebruikt [2, 23, 24]. Actieve targeting [12] is een groot aandachtsgebied geworden bij de diagnose van kanker. Targeting-liganden, zoals aptamer [25], peptide [8], antilichaam [6] en folaat [26], worden geconjugeerd aan macromoleculaire en supramoleculaire multimere Gd-complexen voor binding aan bepaalde receptoren die tot overexpressie worden gebracht door tumorcellen of vasculaturen. De biologische compatibiliteit en biologische afbreekbaarheid van deze macromoleculaire en supramoleculaire eigenschappen zijn echter niet duidelijk, en hun niet-biologische afbreekbaarheid belemmert de klinische toepassing. Onze Omn-NP's bestaan ​​echter uit PEG, PCL, gelatinase-splitsingspeptide en Omn. De PEG en PCL hebben uitstekende eigenschappen op het gebied van biologische compatibiliteit en biologische afbreekbaarheid, en Omn is een klinisch veelgebruikt MRI-contrastmiddel; daarom wordt van onze Omn-NP's verwacht dat ze een uitstekende bioveiligheid hebben.

De modificatie van polymeer met hydrofiel mPEG zou de bloedcirculatie kunnen verlengen en de accumulatie van NP's in tumoren kunnen verhogen. PEGylatie zou de aanhechting van serumeiwitten kunnen verminderen en een stealth-oppervlak kunnen creëren om de circulatietijd te verlengen door de opname door de reticulo-endotheliale systemen te vermijden [12, 17]. De concentratie van de ingekapselde geneesmiddelen nam specifiek toe op de tumorlocaties en in deze studie werd een significante verlengde duur van de verbetering waargenomen. Daarom was de piektijd van TBR veel later en was de latentieperiode van de beeldvorming veel langer in de Omn-NPs-groep dan in de Omn-groep.

Bovendien zal een verbeterde specificiteit en een langere duur van de verbetering de geïnjecteerde dosis gadoliniumionen minimaliseren, en dus het risico op nefrogene systemische fibrose verminderen, een punt van zorg bij het ontwerp van op gadolinium gebaseerde contrastmiddelen [27, 28].

IHC-kleuring voor MMP2 en MMP9

De resultaten van IHC-kleuring voor MMP2 en MMP9 van normale weefsels van organen en tumorweefsels worden getoond in Fig. 5. De resultaten toonden aan dat de expressieniveaus van MMP2 en MMP9 in tumorweefsels (++) waren, terwijl in de meeste normale weefsels waren (− ). In de tumorweefsels waren celplasma en extracellulaire matrix zichtbaar bruin gekleurd, wat wijst op hogere niveaus van MMP2/9-expressie.

een , b IHC-kleuring voor MMP2 en MMP9 in normale en tumorweefsels van xenotransplantaatmuizenmodel van menselijke orale plaveiselcelcarcinoomlijnen

De matrix metalloproteïnase (MMP)-familie speelt een sleutelrol bij kankerinvasie en metastase, MMP2/9, ook bekend als collagenasen IV en gelatinasen A/B, zijn naar verluidt de belangrijkste kankergerelateerde MMP's. Studies hebben een correlatie aangetoond tussen de expressie van gelatinasen en slechte resultaten van veel tumoren, waaronder OSCC [29, 30]. De hoge expressie van MMP2/9 werd ook waargenomen in onze studie. Vanwege de MMP's zijn ongetwijfeld belangrijke doelwitten tegen kanker vanwege hun wijdverbreide expressie en nauwe relatie met kankers. Daarom zouden onze Omn-NP's in bijna alle tumoren kunnen worden gebruikt. De eenvoud en universaliteit ervan hebben een goed klinisch toepassingspotentieel.