Her2-gefunctionaliseerde goud-nanoschaal magnetische hybride nanodeeltjes:een theranostisch middel voor dual-modale beeldvorming en fotothermische therapie van borstkanker

Resultaten en discussies

Karakterisaties

PFOB/SPIOs@PLGA NP's werden vervaardigd via het olie/water-emulsie-oplosmiddelverdampingsproces. SEM-afbeelding (Fig. 2a) onthulde dat de PFOB / SPIOs@PLGA NP's een uniforme bolvormige morfologie en een glad oppervlak bezaten. Zoals getoond in TEM (Fig. 2b), was er een duidelijk verschil in elektronische dichtheid tussen de kern en de schaal van de PFOB / SPIOs@PLGA NP's, wat suggereert dat PFOB in de NP's is ingekapseld. Bovendien, zoals weergegeven in het inzetbeeld van hogere vergroting, werd de aanwezigheid van SPIO's aangetoond als diepgrijze vlekken in de schaal en het vloeibare PFOB-kerngebied van PFOB/SPIOs@PLGA NP's. De gemiddelde diameter van PFOB/SPIOs@PLGA NP's was ongeveer 248,3 nm met een polydispersiteitsindex van 0,037, en de zeta-potentiaal was ongeveer -14,7 mV volgens de DLS-meting. Daarom konden PFOB/SPIOs@PLGA NP's gemakkelijk positief geladen PAH absorberen om vervolgens negatief geladen Au-nanodeeltjes met een gemiddelde grootte van 5-7 nm te hechten, die werden gebruikt als zaden om de groei van gouden nanoschil rond het oppervlak van PFOB te stimuleren /SPIOs@PLGA NP's via seeding-procedure.

Karakteriseringen van Her2-GPH NP's. een SEM (schaal = 2 μm) en b TEM (schaal = 200 nm) afbeeldingen van PFOB/SPIOs@PLGA NP's; c SEM (schaal = 1 μm) en d TEM (schaal = 100 nm) afbeeldingen van Her2-GPH NP's; e EDS-elementafbeeldingen tonen de verdelingen van C-, O-, Fe-, F-, Br- en Au-elementen in Her2-GPH NP's

Her2-GPH NP's werden bereid door anti-Her2-antilichamen te koppelen aan PFOB/SPIOs@PLGA@Au NP's via SH-PEG-COOH. In dit proces werd klassieke carbodiimidetechnologie gebruikt om de carbonzuurgroepen van gePEGyleerde PFOB/SPIOs@PLGA@Au NP's te activeren en de covalente binding van aminogroepen aan antilichamen te bevorderen [31]. Zoals geïllustreerd in SEM- en TEM-afbeeldingen (Fig. 2c, d), behielden Her2-GPH NP's een goed gedefinieerde bolvormige morfologie met een ruw oppervlak, en dichte Au NP's met een diameter van tientallen nanometers waren duidelijk te zien op het oppervlak van de NP's, die de succesvolle fabricage van de gouden nanoshells aangaven. In kaart brengen van EDS-elementen (Fig. 2e) en resultaten van elementenanalyse (Fig. 3a) van Her2-GPH NP's onthulden duidelijk de grote hoeveelheid Au-element en de aanwezigheid van Fe-, F- en Br-elementen, wat wijst op de succesvolle inkapseling van SPIO's en PFOB en de vorming van Au nanoshells. Bovendien werd het gehalte aan Au- en Fe-elementen in Her2-GPH NP's volgens ICP-AES beoordeeld op respectievelijk 67,71 ± 7.34% wt.% en 2.13 ± 0.52% wt.%.

Karakteriseringen van Her2-GPH NP's. een EDS-elementenanalyse van Her2-GPH NP's; b UV-Vis-absorptiespectra van Her2-GPH NP's in verschillende voorbereidingsstadia; c Maatverdeling en d Zeta-potentieel van Her2-GPH NP's

Bovendien werden ook UV-Vis-absorptiespectra van Her2-GPH NP's in verschillende voorbereidingsstadia onderzocht (figuur 3b). PFOB/SPIOs@PLGA NP's vertoonden geen duidelijke absorptiepiek in het bereik van 400 tot 800 nm, terwijl Au NP's een plasmaresonantiepiek vertoonden bij ongeveer 520 nm. Zowel PFOB/SPIOs@PLGA@Au NP's als Her2-GPH NP's vertoonden een continue brede piek variërend van 600 tot 900 nm (NIR-regio) vanwege de aangehechte Au-zaden die groter genoeg werden door het zaaiproces om te clusteren. De brede absorptiespectra in het NIR-gebied zorgden ervoor dat de Her2-GPH NP's konden werken als fotoabsorbers voor NIR-fotothermische therapie. Bovendien hadden Her2-GPH NP's, vergeleken met PFOB / SPIOs@PLGA NP's, een verhoogde grootteverdeling van 282.3 nm met een polydispersiteitsindex van 0.18 (Fig. 3c). En de zeta-potentiaal was -31.3 mV (Fig. 3d), wat de goede stabiliteit ervan impliceert.

Meting van fotothermische prestaties

Het fotothermische conversie-effect van de Her2-GPH NPs-oplossing werd geëvalueerd onder bestraling van een NIR-laser (808 nm, 1 W/cm ² ), en de temperatuurvariatie werd elke 10 s gecontroleerd met een IR-warmtebeeldcamera. Na 10  min laserbestraling veranderde de thermische beeldkleur van verschillende concentraties van Her2-GPH NP's-oplossing, wat aangeeft dat de temperatuur toenam met toenemende concentratie van Her2-GPH NP's (figuur 4a). Fotothermische temperatuurmeting was consistent met de beeldgegevens. Er kon worden waargenomen dat de temperatuur van de NP's-oplossing steeg met toenemende blootstellingstijd en concentratie (figuur 4b). In detail was de temperatuurstijging van de Her2-GPH NPs-oplossing 18,5°C bij een concentratie van 0,2 mg/ml, terwijl er slechts 1,2°C-stijging was voor DI-water. Om kankercellen te doden, moest de temperatuur worden verhoogd tot het temperatuurbereik van hyperthermie (40-47 °C) volgens eerdere studies [32]. Vanwege het thermische verlies in vitro is een temperatuurstijging van ongeveer 10 ° C echter niet voldoende om celdood te induceren [33]. Her2-GPH NP's zouden de temperatuur met ongeveer 18 °C kunnen verhogen bij een relatief lage concentratie, waardoor ze het potentieel hebben om kankercellen te doden door hyperthermie. Om de fotothermische stabiliteit van Her2-GPH NP's te verifiëren, werden bovendien UV-zichtbare NIR-absorptiespectra van monsters verzameld voor en na laserbestraling. En de absorptiespectra zijn bijna onveranderd voor en na laserblootstelling (Fig. 4c), waardoor Her2-GPH NP's kunnen worden gebruikt als efficiënte fotoabsorber voor PTT van kanker.

Fotothermisch effect van Her2-GPH NP's. een NIR warmtebeelden en b temperatuurvariatie van Her2-GPH NP's bij verschillende concentraties, na bestraling door een NIR-laser (808 nm, 1 W/cm ² ,10 minuten); c UV-Vis-NIR absorptiespectra voor en na de fotothermische bestralingstest

In vitro cytotoxiciteitstest

Het is algemeen bekend dat biocompatibiliteit van NP's een van de belangrijkste aandachtspunten is bij biomedische toepassingen en dat deze eerst moet worden bepaald. Zo werden CCK-8-assays gebruikt om de cytotoxiciteit van Her2-GPH NP's in MDA-MB-231- en SKBR3-cellen van borstkanker te evalueren, zoals weergegeven in Fig. 5a en b. In vergelijking met controles bleef de levensvatbaarheid van met Her2-GPH NP's behandelde MDA-MB-231- en SKBR3-cellen meer dan 90% bij de concentratie variërend van 10 tot 200 g/ml gedurende 24 h, wat wijst op de lage cytotoxiciteit en goede biocompatibiliteit van de resulterende NP's, die hun veiligheid zouden kunnen garanderen voor verdere celexperimenten en klinische studies.

Mobiele levensvatbaarheid van a MDA-MB-231 en b SKBR3-cellen bij verschillende doseringen van Her2-GPH NP's (0, 10, 20, 50, 100, 200 μg/ml) gedurende 12 h en 24 h (gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SD, n = 4)

In vitro receptorspecifieke targetingonderzoeken

Confocale laserscanmicroscopie

Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) wordt veel gebruikt als groene fluorescentieprobes voor immuundetectie en het kan gemakkelijk verschillende soorten monoklonale antilichamen binden. We kiezen dus voor FITC-gelabeld anti-Her2-antilichaam en de verbinding van NP's met antilichaam kan meer visueel worden waargenomen door middel van immunofluorescentietest. Om de binding van anti-her2-antilichamen aan GPH NP's te verifiëren, werden GPH NP's en Her2-GPH NP's op schalen geplaatst (Φ = 20 mm) voor CLSM-analyse. Zoals geïllustreerd in Fig. 6, konden zowel Her2-GPH NP's als GPH NP's duidelijk worden waargenomen in helder veld. GPH NP's vertoonden geen fluorescentiesignaal, terwijl Her2-GPH NP's heldergroene fluorescentie vertoonden in de FITC en het samengevoegde kanaal, wat de succesvolle conjugatie van anti-her2-antilichaam met GPH NP's bevestigde.

Confocale microscopische beelden van Her2-GPH NP's en GPH NP's in helderveld, FITC-fluorescentie en samengevoegde kanalen (schaalbalk = 5 μm)

We gebruikten LSCM om de targetingspecificiteit van Her2-GPH NP's in vitro te bevestigen. Zoals te zien is in figuur 7, vergeleken met niet-gerichte groep (b), vertoonden SKBR3-cellen die waren geïncubeerd met gerichte Her2-GPH NP's (a) heldergroene fluorescentiesignalen op het oppervlak van celmembranen, wat aangeeft dat de NP's die Her2-antilichamen dragen zou effectief kunnen binden aan Her2-positieve cellen [34]. Om de distributies van Her2-GPH NP's in SKBR3-cellen duidelijk te observeren, hebben we een helder beeld (a1), FITC-fluorescentiebeeld (a2), nucleair beeld (a3) ​​en een overlay-beeld (a4) ervan geleverd. Vanwege de korte incubatietijd van NP's werden ze voornamelijk verspreid op het oppervlak van celmembranen en geaggregeerd tot zwarte vlekken. In competitieonderzoek waren er verwaarloosbare fluorescentiesignalen wanneer SKBR3-cellen werden voorbehandeld met overtollige vrije anti-Her2-antilichamen en vervolgens werden geïncubeerd met Her2-GPH NP's (figuur 7c). Deze resultaten toonden aan dat het richtgedrag van Her2-GPH NP's receptor-gemedieerd was en kon worden geblokkeerd door een overmaat aan vrije anti-Her2-antilichamen [26]. Bovendien wordt weinig fluorescentie gedetecteerd in MDA-MB-231-cellen die onder dezelfde omstandigheden zijn behandeld met Her2-GPH NP's (Fig. 7d), wat bevestigde dat Her2-GPH NP's specifiek binden aan SKBR3-cellen die Her2-receptoren tot overexpressie brengen.

Confocale microscopische beelden en flowcytometrieresultaten van SKBR3-cellen geïncubeerd met gerichte Her2-GPH NP's (a /a1 –a4 , e ) en niet-gerichte GPH NP's (b , v ), met vrij Her2-antilichaam voorbehandelde SKBR3-cellen geïncubeerd met Her2-GPH NP's (c , g ), en MDA-MB-231-cellen geïncubeerd met Her2-GPH NP's (d , u ). a1 het beeld van helder veld; a2 het beeld van het DAPI-kanaal; a3 het beeld van het FITC-kanaal; en a4 de afbeelding van het samengevoegde kanaal (schaalbalk = 10 μm)

Flowcytometrie

De bindingssnelheid van Her2-GPH NP's aan cellen werd verder kwantitatief bepaald via FCM. Zoals duidelijk wordt geïllustreerd in Fig. 7, was de bindingssnelheid van gerichte NP's aan SKBR3-cellen (e) opmerkelijk hoger dan die van MDA-MB-231-cellen (h) (86% - ± -3,72% versus 2,31% - ± -0,36%, P <-0,001), wat het specifieke targetingvermogen van Her2-GPH NP's op Her2-positieve cellen aangeeft. Bovendien hadden Her2-GPH NP's weinig targetingbinding aan SKBR3-cellen die waren voorbehandeld met een overmaat aan vrije anti-Her2-antilichamen (Fig. 7g), en er was een significant verschil tussen de gerichte remmingsgroep en de gerichte groep (3,16% - ± -0,41 % versus 86% ± 3,72%, P < 0,001). Op basis van het bovenstaande leverden de FCM-resultaten verder sterk bewijs dat Her2-GPH NP's een specifiek targetingvermogen hadden voor het herkennen en combineren met SKBR3-cellen die Her2-receptoren tot overexpressie brengen, en het targetinggedrag was receptorgemedieerd.

In vitro Amerikaanse beeldvorming en kwantitatieve analyse

Echografie met in vitro-oplossing

In onze studie werd het Amerikaanse beeldvormingseffect van de Her2-GPH NPs-oplossing in vitro beoordeeld onder verschillende modi met behulp van de Mylab Twice Ultrasound System-eenheid. Waargenomen uit Fig. 8a, vertoonden de buizen gevuld met Her2-GPH NP's-oplossing een sterke gestippelde echo in zowel 2D-grijsschaal- als CEUS-modi. Daarentegen vertoonde DI-water een echo. Bovendien nam met de toenemende concentratie van Her2-GPH NP's het ultrasone contrastversterkingssignaal geleidelijk toe. Zoals geïllustreerd in TIC, nam de gemiddelde signaalintensiteit van de Her2-GPH NP's geleidelijk toe naarmate de concentratie van NP's toenam en het bleef overeenkomen met het CEUS-resultaat. Het middel bij een concentratie van 2 mg/ml had significant sterkere contrastversterkingssignalen dan de NP's bij 0,1 mg/ml (82 ± 0.69 dB vs 27 ± 6.7 dB, P <-0,01), wat aangeeft dat de sterkere terugverstrooiing wordt geproduceerd door een hogere concentratie van de NP's. Het bovenstaande gaf aan dat de Her2-GPH NP's een bevredigend contrastverhogend effect in vitro hadden en een dergelijke contrastversterking was concentratie-afhankelijk. Bovendien werd ook de lengte van de echografie-beeldvormingstijd van Her2-GPH NP's bij een concentratie van 2  mg / ml onderzocht (figuur 8b). Her2-GPH NP's vertoonden een voortreffelijk contrastversterkt signaal vóór 2 min, en de signaalintensiteit nam geleidelijk af met het verstrijken van de tijd. Er was echter nog steeds een duidelijk verbeteringssignaal binnen 5 min, wat kan voldoen aan de eis van klinische contrastversterkte echografie. Conventionele met gas gevulde microbellen als UCA's zouden het terugverstrooiingssignaal van bloed kunnen versterken door niet-lineaire oscillaties onder ultrageluid, maar zijn niet geschikt voor moleculaire evaluatie van weefsel vanwege de beperking in intravasculaire beeldvorming en slechte stabiliteit [35]. Vergeleken met met gas gevuld middel hebben de met vloeibare fluorkoolstof gevulde PLGA-nanocapsules akoestische stabiliteit met een langere circulatiehalfwaardetijd [16]. Bovendien bleek uit ons eerdere onderzoek dat Au-nanoschelpen goede reflectie-eigenschappen hebben vanwege het hoge atoomnummer en de dichtheid [36]. Daarom hebben we de ultrasone resonantie-eigenschappen van met PFOB gevulde PLGA-nanocapsules gecombineerd met de grote echogeniciteit van Au-nanoschelpen, die het terugverstrooiingssignaal van Her2-GPH NP's in vitro aanzienlijk verbeterden.

een In vitro tweedimensionale (2D) grijsschaal-echografie (VS) en contrastversterkte echografie (CEUS) beelden en de tijd-intensiteitscurve (TIC) van Her2-GPH NP's onder verschillende concentraties (0, 0,1, 1, 1,5, 2 mg/ml). b In vitro Amerikaanse beelden van Her2-GPH NP's (2 mg/ml) met verstrijkende tijd

Gerichte Amerikaanse beeldvorming van borstkankercellen

Het gerichte ultrasone beeldvormingsvermogen van Her2-GPH NP's op borstkankercellen werd geëvalueerd in 2D-grijsschaalmodus met behulp van de Mylab Twice Ultrasound System-eenheid. Zoals getoond in Fig. 9a, vertoonden zowel de met NP's behandelde als de controlecellen uniforme, hyperechoïsche banden in de gel met duidelijke grenzen. Er kon duidelijk worden waargenomen dat de echogene band van SKBR3-cellen behandeld met Her2-GPH NP's helderder en dichter was dan die van niet-gerichte en controle SKBR3-cellen. Er werden echter geen significante verschillen in echosignalen waargenomen in MDA-MB-231-cellen die werden behandeld met gerichte of niet-gerichte NP's. We hebben de gemiddelde grijsschaalwaarde van de afbeeldingen verder gekwantificeerd op basis van de gedefinieerde ROI, en de resultaten werden getoond in Fig. 9b. De grijsschaalwaarde van SKBR3-cellen behandeld met gerichte Her2-GPH NP's was significant hoger dan die van SKBR3 niet-gerichte en controlegroep (P < 0.01). Bovendien vertoonden SKBR3-cellen die waren behandeld met gerichte Her2-GPH NP's hogere grijswaarden in vergelijking met MDA-MB-231-cellen die met dezelfde NP's waren behandeld (P < 0.05). Deze resultaten toonden aan dat Her2-GPH NP's specifiek konden binden aan Her2-positieve SKBR3-cellen en het potentieel hadden om het ultrasone moleculaire beeldvormingseffect van doelcellen te versterken.

een In vitro echografie en b grijsschaalwaarde-analyse van MDA-MB-231- en SKBR3-cellen behandeld met gerichte Her2-GPH NP's of niet-gerichte GPH NP's. MDA-MB-231- en SKBR3-cellen dienden als controles (gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SD, *P < 0.05, **P < 0.01, n = 3)

In vitro MR-beeldvorming en kwantitatieve analyse

T ₂ Meting en MR-beeldvorming van Her2-GPH NP's

SPIO's zijn intensief onderzocht in T ₂ - gewogen MR-beeldvorming vanwege hun vermogen om transversale relaxatietijden van de omringende waterprotonen te verkorten, wat resulteert in een afname van de MR-signaalintensiteit en het mogelijk maakt om een ​​negatieve contrastversterking van de doellaesie te bieden [37, 38]. De T ₂ contrastbeeldvormingsmogelijkheden van Her2-GPH NP's met verschillende Fe-concentraties werden geëvalueerd bij een 0, 5 T magnetisch veld. Afbeelding 10a geeft de transversale relaxatiesnelheden weer (1/T ₂ ) van waterprotonen als functie van de ijzerconcentratie in de waterige oplossing van Her2-GPH NPs. En de relaxiviteit (r ₂ ) werd berekend op basis van de helling van 441,47 mM ⁻¹ s ⁻¹ , wat meer dan 2 keer zo hoog is als het commerciële SPIO-gebaseerde MR-beeldvormingscontrastmiddel Feridex (152 mM ⁻¹ s ⁻¹ ) onder dezelfde magnetische veldsterkte [39]. Hoe hoger T ₂ relaxiviteit kan te wijten zijn aan het feit dat de aggregatie van SPIO's in de polymere matrix resulteert in een relatief vergroting van de magnetische NP's en de magnetische interacties verbetert [37, 40]. Bovendien is de signaalintensiteit van T ₂ -gewogen MR-beeldvorming nam geleidelijk af samen met de toename van de ijzerconcentratie (Fig. 10b), wat verder bevestigde dat Her2-GPH NP's het vermogen hadden voor T ₂ -gewogen MR-contrastbeeldvorming.

In vitro MR-beeldvorming. een De transversale relaxatiesnelheden (1/T ₂ ) van Her2-GPH NPs waterige oplossing als functie van de ijzerconcentratie in een 0,5 T magnetisch veld. b T ₂ -gewogen MR-beelden van Her2-GPH NP's met verschillende ijzerconcentraties verkregen met behulp van spin-echo-sequentie. c T ₂ -gewogen MR-beelden en d signaalintensiteit van Her2-GPH NP's (100 μg/mL) en GPH NP's (100 μg/mL) geïncubeerd met MDA-MB-231 en SKBR3-cellen. MDA-MB-231- en SKBR3-cellen dienden als controles (gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SD, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n = 3)

Gerichte MR-beeldvorming van borstkankercellen

Het gerichte MR-beeldvormingseffect van Her2-GPH NP's op SKBR3- en MDA-MB-231-cellen werd bevestigd door in vitro T ₂ -gewogen MR-beeldvorming. Zoals getoond in Fig. 10 c en d, vertoonden SKBR3-cellen die waren behandeld met gerichte Her2-GPH NP's merkbare negatieve contrastverbetering en de signaalintensiteit nam met 48% af in vergelijking met de controlecellen (P < 0,001). De intensiteit van het MR-signaal van niet-gerichte met GPH NP's behandelde SKBR3-cellen vertoonde echter weinig reductie. Bovendien veranderde de signaalintensiteit van MDA-MB-231-cellen gelabeld met Her2-GPH NP's of GPH NP's niet significant in vergelijking met de controlegroep (P> 0,05). Bovendien vertoonden met Her2-GPH NP's behandelde SKBR3-cellen een hogere mate van vermindering van de signaalintensiteit dan die van MDA-MB-231-cellen (P < 0,001), wat kan worden gebruikt om de twee cellen van elkaar te onderscheiden. De bovenstaande resultaten gaven samen aan dat Her2-GPH NP's T . zouden kunnen verbeteren ₂ -gewogen MR-beeldvorming door receptor-gemedieerde celspecifieke opname [41].

In vitro gerichte PTT-evaluatie

Aanvankelijk werd kleuring met calceïne-AM/propidiumjodide (PI) gebruikt om gerichte fotothermische cytotoxiciteit in vitro visueel te evalueren. Calcein AM, een niet-fluorescerende levende celkleuring, kan het celmembraan doordringen en hydrolyseren om een ​​groene fluorescerende calceïnekleurstof in levende cellen te produceren. Propidiumjodide (PI) is een dode celkleuring, die zich bindt aan het DNA van dode cellen om rode fluorescentie te genereren [33]. Zoals getoond in Fig. 11a, waren er geen duidelijke dode cellen wanneer NIR-laserbestraling of de Her2-GPH NP's afzonderlijk werden gebruikt, wat aangeeft dat noch laserbestraling noch de NP's zelf cytotoxisch waren. Evenzo vertoonden cellen behandeld met niet-gerichte GPH NP's in combinatie met NIR-laser weinig celdood. Integendeel, een groot aantal dode cellen kon worden waargenomen wanneer Her2-GPH NP's werden behandeld in de aanwezigheid van laserbestraling, wat suggereerde dat het middel hyperthermische celdood zou kunnen induceren door zich te richten op het fotothermische effect. De levensvatbaarheid van de cellen werd verder kwantitatief geëvalueerd door middel van een CCK-8-assay. Zoals geïllustreerd in Fig. 11b, vertoonden SKBR3-cellen die waren behandeld met Her2-GPH NP's en laserbestraling een afname (62 ± 4,56%) in cellevensvatbaarheid vergeleken met de controlegroep (P < 0,001). Bovendien was de levensvatbaarheid van de cellen van de gerichte Her2-GPH NP's-groep onder de laserbestraling gedurende 10 min significant lager dan die van de niet-gerichte groep (38 ± 4,56% vs 87,6 ± 4,06%, P < 0.05).

In vitro gerichte fotothermische test. een Confocale microscopische beelden van calceïne-AM/PI-gekleurde SKBR3-cellen in verschillende behandelgroepen (Her2-GPH NPs-groep, lasergroep, GPH NPs + lasergroep, Her2-GPH NPs + lasergroep) (schaalbalk = 100 μm). SKBR3-cellen dienden als controle. b Relatieve cellevensvatbaarheid van SKBR3-cellen in de vijf groepen na behandeling zoals weergegeven in Fig. 11 a (gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SD, *P < 0.05, ***P < 0.001, n = 4); c cellevensvatbaarheid van SKBR3-cellen geïncubeerd met Her2-GPH NP's in verschillende concentraties (0, 50, 100, 150, 200 g/ml) met of zonder NIR-laserbestraling (808 nm, 1 W/cm ² , 10 min) (gegevens uitgedrukt als gemiddelde ± SD, *P < 0.05, ***P < 0.001, n = 4)

Bovendien hebben we de CCK-8-assay gebruikt om de fotothermische cytotoxiciteit van Her2-GPH NP's bij verschillende concentraties kwantitatief verder te beoordelen. Zoals getoond in Fig. 11c, bleef de levensvatbaarheid van SKBR3-cellen behandeld met Her2-GPH NP's zonder NIR-laserbestraling meer dan 90%, terwijl de levensvatbaarheid van met laser bestraalde cellen aanzienlijk afnam met toenemende concentraties van Her2-GPH NP's. Slechts minder dan 20% van de met laser bestraalde cellen bleef levensvatbaar bij een concentratie van 200 g/ml in vergelijking met de niet met laser bestraalde cellen bij dezelfde concentratie (P < 0,001). Deze resultaten bevestigden verder dat relatief lage concentraties Her2-GPH NP's voldoende waren om voldoende temperatuurstijging te geven om SKBR3-cellen te doden.

Verder hebben we SKBR3- en MDA-MB-231-cellen in verschillende verhoudingen samen gekweekt om de heterogene expressie van Her2 in borsttumorweefsels te simuleren. De resultaten toonden aan dat de totale cellevensvatbaarheid na fotothermische inductie van Her2-GPH NP's afnam met de toenemende proporties van SKBR3-cellen, en de totale cellevensvatbaarheid van de andere proportiegroep was significant hoger dan die van de 100% SKBR3-cellengroep ( P < 0.05) (Extra bestand 1:Afbeelding S1). Bovendien was in de aanwezigheid van Her2-GPH NP's gedurende 30 min de totale levensvatbaarheid van de cellen na inductie met NIR-laser significant lager dan die van de niet-laserbestralingscellen (P <-0,05), behalve voor de groep met 100% MDA-MB-231-cellen. Alles bij elkaar genomen, konden Her2-GPH NP's specifiek binden aan SKBR3-cellen en hadden ze een groot potentieel om kankercellen te doden door fotothermisch effect. Het mogelijke mechanisme van fotothermische hyperthermie voor SKBR3-cellen moet voornamelijk worden toegeschreven aan de blootstelling van de kankercellen aan hogere temperaturen, die de normale celgroei en proliferatie remden door intracellulaire eiwitten te denatureren [42].