Mitochondria-gerichte en resveratrol-geladen dual-functionele titaniumdisulfide nanosheets voor fotothermische getriggerde tumorchemotherapie

Abstract

Een subcellulaire, op organellen gerichte afgifte van geneesmiddelen tegen kanker is een veelbelovende strategie om de antikankereffecten te maximaliseren en de nadelige effecten te minimaliseren. Hierin hebben we een mitochondria-gericht nanoplatform voor medicijnafgifte voorbereid op basis van IR780-jodide (IR780) en titaniumdisulfide (TiS₂ ) nanobladen. Vanwege het grote specifieke oppervlak van TiS₂ nanosheets, zou het nanoplatform resveratrol (RV) tegen kanker in hoge mate kunnen laden. De voorbereide nanocomposiet (IR780-TiS₂ /RV) werd gebruikt voor een effectieve fotothermische getriggerde tumorchemotherapie. IR780-TiS₂ /RV vertoonde bevredigende stabiliteit en biocompatibiliteit, en de beladingsratio van RV en IR780 was respectievelijk ongeveer 112% en 56%. Bij de nabij-infrarood (NIR) bestraling wordt de warmte gegenereerd door IR780-TiS₂ /RV kan de RV-release activeren. Door de conjugatie met de mitochondria-specifieke IR780, IR780-TiS₂ /RV kan zich richten op en zich ophopen in mitochondriën en RV vrijgeven wanneer het wordt geactiveerd door NIR om het mitochondriale membraanpotentieel te verminderen, snel de opregulatie van belangrijke intrinsieke apoptotische factoren zoals cytochroom c te induceren en de caspase-cascade te initiëren, waardoor het chemotherapeutische effect wordt bereikt. De IR780-TiS₂ /RV nanocomposiet bleek een hoge anti-tumor werkzaamheid in vitro en in vivo te hebben, evenals geen opmerkelijke weefseltoxiciteit. We denken dat onze studie aantoont dat de NIR-getriggerde IR780-TiS₂ /RV nanoplatform zou een veelbelovend chemotherapeutisch middel kunnen zijn in de klinische praktijk.

Inleiding

Kanker blijft een levensbedreigende ziekte en veroorzaakt wereldwijd hoge sterftecijfers [1]. Chirurgie, chemotherapie, bestraling en hormonale therapie zijn nog steeds de belangrijkste therapeutische methoden die in de klinische praktijk worden gebruikt [2, 3]. Van deze methoden is chemotherapie een algemeen aanvaarde behandelingsoptie door zowel clinici als patiënten vanwege de relatief hoge werkzaamheid [4, 5]. Chemotherapie gaat gepaard met enkele ernstige problemen, bijvoorbeeld resistentie tegen geneesmiddelen, terugkeer van tumoren en niet-specificiteit [5,6,7]. Daarom is het van grote urgentie om nieuwe chemotherapeutische middelen en strategieën te ontwikkelen om deze obstakels te overwinnen [8]. In de afgelopen jaren is het laden van een medicijn tegen kanker op een gefunctionaliseerde drager die tegelijkertijd een gerichte afgifte en een gecontroleerde afgifte van het medicijn kan bereiken een populaire benadering geworden om het therapeutische effect te maximaliseren en de bijwerkingen te verminderen [9,10,11] . Een groot specifiek gebied dat een betere medicijnbeladingsratio kan bieden, is essentieel voor een uitstekende medicijndrager [12].

Om de specificiteit van het medicijn te verbeteren, wordt de drager bovendien gewoonlijk gemodificeerd met een cel-targeting-molecuul, zoals foliumzuur en glutathion dat zich richt op het celoppervlak [13,14,15,16,17]. Aangezien veel chemotherapeutische geneesmiddelen inwerken op specifieke subcellulaire organellen, zou het ontwerpen van een organel-specifiek toedieningssysteem het therapeutische effect opmerkelijk kunnen vergroten en de nadelige effecten verminderen [18,19,20]. Bijgevolg is de selectie van de beoogde locatie in de tumorcellen van vitaal belang voor het medicijnafgiftesysteem. Mitochondriën zijn niet alleen een "energiefabriek" van cellen, maar ook een belangrijk doelwit van chemotherapeutische geneesmiddelen die zich richten op de mitochondriën om de intrinsieke apoptotische route te initiëren [21,22,23]. Daarom zou de ontwikkeling van een op mitochondriën gericht anti-kankermedicijnafgiftesysteem van vitaal belang kunnen zijn voor effectievere kankerchemotherapie. Tot nu toe zijn er verschillende soorten medicijnafgiftesystemen ontworpen, zoals mesoporeuze silica, op koolstof gebaseerde materialen en eiwitten [17, 24,25,26]. Hoewel is gemeld dat deze dragers efficiënt zijn voor medicijnafgifte en tumortherapie, zijn meer nieuwe, zeer efficiënte medicijnafgiftesystemen nog steeds zeer gewenst.

In deze studie hebben we een mitochondria-targeting en NIR-triggered drug delivery nanoplatform geconstrueerd op basis van tweedimensionaal titaniumdisulfide (TiS₂ ) nanosheets voor gecontroleerde en gerichte tumorchemotherapie. TiS₂ is een lid van overgangsmetaal dichalcogeniden, die een groot specifiek gebied hebben [27,28,29]. Na afschilfering door proteïne-geassisteerde ultrasone trillingen, werd het oppervlak van TiS₂ nanosheets kan worden gewijzigd door andere functionele moleculen via covalente of niet-covalente interacties. Bovendien werd het tumor-mitochondria-specifieke molecuul IR780 (IR-780 jodide) gekozen om de TiS₂ nanobladen. IR780 geeft de nanosheets het mitochondria-targeting-vermogen, dat zowel door het organisch-anion-transporterende polypeptide-gemedieerde actieve transport als door het lipofiele kationkenmerk is [30, 31]. Er werd gemeld dat IR780 als een lipofiel kation meer accumulatie vertoonde in de mitochondriën van tumorcellen vanwege de hoge omvang van het mitochondriale membraanpotentieel in tumorcellen dan normale cellen [32, 33]. Bovendien is IR780 ook een nabij-infrarood responsief fotothermisch middel. Het voorbereide nanoplatform, genaamd IR780-TiS₂ , werd bevestigd als biocompatibel en kon effectief het antikankergeneesmiddel resveratrol (RV) (IR780-TiS₂ laden) /RV) [24]. De IR780-TiS₂ /RV bezat een mitochondria-targeting-vermogen en een fotothermisch effect. NIR werd toegepast als een externe stimulus om de lokale medicijnafgifte te activeren na NIR-bestraling. In vitro en in vivo experimenten toonden aan dat IR780-TiS₂ /RV heeft een zeer efficiënt chemotherapie-effect. Verdere studie van het mechanisme onthulde dat de celdood geïnduceerd door IR780-TiS₂ /RV was via de mitochondria-gemedieerde intrinsieke apoptose-route. Dit op mitochondriën gerichte medicijnafgiftesysteem (schema 1) zou een potentieel chemotherapeutisch middel kunnen zijn in toekomstige klinische toepassingen.

Het voorbereidingsschema van IR780-TiS₂ /RV, dat werd gebruikt als een NIR-getriggerd medicijnafgiftesysteem voor tumorchemotherapie gemedieerd door intrinsieke apoptose-route

Materialen en methoden

Materialen

Sigma-Aldrich leverde de IR-780 jodide (IR780), TiS₂ poeder, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (St. Louis, MO, VS). Runderserumalbumine (BSA>98,0%) werd gekocht bij BioSharp Co., Ltd. (Korea). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) werd verkregen van Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japan). Celkweekreagentia, waaronder DMEM-medium en foetaal runderserum (FBS) werden geleverd door Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS). Chemicaliën werden verkregen van Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Synthese van IR780-TiS₂ /RV

De eerste stap was de bereiding van in water oplosbare TiS₂ nanosheets volgens vorig rapport [34]. In detail, 5 mg bulk TiS₂ werd gemengd met 5 mL water en 20 min geroerd. De TiS₂ watersuspensie werd vervolgens toegevoegd aan 5 mg BSA en werd verwerkt onder ijsbad ultrasoon gedissocieerd met behulp van een ultrasoonapparaat van 500 W en 20 kHz (Sonics, VCX130, VS) gedurende 6 h. Daarna werd het bereide mengsel 10 min gecentrifugeerd bij 12.000 tpm, resulterend in TiS₂ nanosheets in het supernatant.

Ten tweede, TiS₂ nanosheets werden geconjugeerd met IR780. Als zuurbindend middel werd triëthylamine (TEA) toegepast. Vijf milligram IR780 werd opgelost in 2 ml DMSO en gedurende 8 uur bij 60°C geroerd onder toevoeging van TEA. De mengselsuspensie werd gedurende 2 dagen in gedestilleerd water gedialyseerd en vervolgens 8 min gecentrifugeerd bij 9000 tpm om het geaggregeerde product te verwijderen. Het supernatant werd verzameld, wat resulteerde in IR780-TiS₂ .

Eindelijk werd RV geladen op IR780-TiS₂ . IR780-TiS₂ (1 mg/ml) werd gemengd met RV (2 mg/ml, opgelost in DMSO), dat een nacht bij kamertemperatuur licht werd geroerd. Daarna werden DMSO en vrije RV geëlimineerd via dialyse in gedestilleerd water gedurende de nacht om IR780-TiS₂ op te leveren. /RV. Gebaseerd op literatuur, de RV-laadverhouding gedetecteerd door een UV-vis spectrofotometer (UV-2550, Shimadzu, Japan) en berekend volgens de volgende vergelijking:

$$ \mathrm{RV}\ \mathrm{loading}\ \mathrm{ratio}\ \left(\%\right)=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

waar A _een (mg), A _b (mg), en A _c (mg) vertegenwoordigen de initiële, ongebonden RV en de IR780-TiS₂ , respectievelijk.

Bruker TENSOR 27 Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) spectrometer (Bruker Optics Ltd., Coventry, VK) werd gebruikt om de chemische structuur van TiS₂ te detecteren , IR780-TiS₂ , en R780-TiS₂ /RV. Brunauer-Emmett-Teller (BET) analyse werd uitgevoerd om het specifieke oppervlak van de monsters te bepalen, berekend uit N₂ adsorptieresultaat via een oppervlakteanalysator (Quantachrome ChemBET-3000) op basis van de BET-vergelijking.

Cellijn en celcultuur

De muizen-darmkankercellen CT26 werden verkregen van de Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection (Shanghai, China). De cellen werden gekweekt in compleet DMEM-medium (10% FBS + 90% DMEM) in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 °C.

In vitro lokalisatie van IR780-TiS₂ /RV

FITC werd gebruikt om IR780-TiS₂ . te labelen /RV of TiS₂ /RV. In het kort, FITC werd opgelost in ethanoloplossing (2,0 mg/ml) en gemengd met IR780-TiS₂ /RV of TiS₂ /RV waterige oplossing (1,0 mg/mL) onder 4 uur roeren in een donkere omgeving bij kamertemperatuur. Het mengsel werd een nacht in gedestilleerd water gedialyseerd om de overtollige FITC en ethanol te verwijderen, wat resulteerde in FITC-gelabelde IR780-TiS₂ /RV of TiS₂ /RV-oplossing. Om de mitochondriale co-lokalisatie van nanodeeltjes in vitro te bevestigen, werden de cellen behandeld met FITC-gelabeld IR780-TiS₂ /RV of TiS₂ /RV gedurende 5 h en gekleurd door mitochondria-specifieke kleurstof MitoTracker. Daarna, de cellulaire internalisatie van IR780-TiS₂ /RV of TiS₂ /RV werd waargenomen met behulp van een CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). In het kort werden CT26-cellen geïncubeerd met FITC-gelabeld TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV (met dezelfde concentratie FITC) gedurende 5 h. En vervolgens werden de cellen behandeld met MitoTracker Red FM-oplossingen (100 nM) bij 37 ° C gedurende 30 min. Na drie keer wassen met PBS werden de cellen geobserveerd met een CLSM. ImageJ-software werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van cellen te analyseren.

In vitro onderzoek naar NIR-getriggerde tumorchemotherapie en apoptose

4 × 10³ cellen/putje CT26-cellen in kweekplaten met 96 putjes werden behandeld met vrij RV, IR780-TiS₂ , IR780-TiS₂ /RV en TiS₂ /RV met verschillende RV-concentraties gedurende 5 h en werden vervolgens bestraald met of zonder NIR gedurende 3 min (808 nm, 0,3 W/cm² ). Na een verdere incubatie van 24 uur werd de levensvatbaarheid van behandelde cellen geanalyseerd met CCK-8-assay. De behandelde cellen werden ook gekleurd door Rhodamine123 (Sigma) en geanalyseerd door FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, VS). Detectie van celapoptose werd ook uitgevoerd door FCM-analyse met behulp van Annexin V-FITC / PI-apoptose-detectiekit (Bender MedSystems, Wenen, Oostenrijk) zoals eerder beschreven.

Western Blot

CT26-cellen werden behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV + NIR (equivalent RV, 30 g/mL; equivalent IR780, 0,5 g/mL) voor een incubatie van 5 uur. Na nog een incubatie van 24 uur werden de cellen respectievelijk verzameld van Western-blot, die was gebaseerd op het eerder gerapporteerde protocol [23]. In het kort werden de cellen gelyseerd en geremd door een protease en Triton X-100. Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese werd gebruikt om eiwitten te winnen en te scheiden, die vervolgens werden verschoven naar een PVDF-membraan en geblokkeerd met 5% vetvrije melk. Daarna werden de verdunde primaire antilichamen gedurende 12 uur bij 4 ° C geïncubeerd, inclusief cytochroom c (1/1000, Boster, Wuhan, China), gesplitst caspase-3 (1/1000, CST), gesplitst caspase-9 (1/ 1000, CST) en actine (1/1000, Mouse, Boster, Wuhan, China) en vervolgens geïncubeerd met een secundair antilichaam. Ten slotte werd ECL-reagens gebruikt om de eiwitten te detecteren.

Dierenmodel

Om CT26 subcutaan tumormodel vast te stellen, 1 × 10⁷ CT26-cellen (100 L, in PBS) werden subcutaan geïnjecteerd in de rug van naakte Balb/c-muizen. Tumorvolume = lengte × breedte² /2. Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het centrale ziekenhuis van Zhumadian (Henan, China).

In vivo biodistributie

Biodistributie van IR780-TiS₂ /RV in de tumordragende naakte muizen werd gedetecteerd op 24 uur na intraveneuze injectie van de staart met IR780-TiS₂ /RV (150 μL, 6 mg/kg). De belangrijkste organen, waaronder het hart, de lever, de milt, de longen, de nieren en de tumor werden gewogen en verteerd door middel van een waterige oplossing. Het Ti-elementgehalte in deze weefsels werd gekwantificeerd door ICP-OES.

In vivo NIR-getriggerde tumorchemotherapie

CT26-tumordragende muizen werden willekeurig verdeeld in zes groepen (n = 6), inclusief zoutoplossing, zoutoplossing +NIR, RV, IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV + NIR (equivalente RV, 1 mg/kg; equivalente IR780, 0,5 mg/kg). De NIR-bestralingsconditie is 808 nm, 0,3 W/cm² , en 3 min. Gedurende 30 dagen behandeling werden om de 3 dagen tumorvolumes en muizengewichten geregistreerd. Na de behandeling werden de organen, waaronder het hart, de lever, de milt, de long en de nieren in verschillende groepen gefixeerd en gekleurd door H&E.

Statistische analyse

De resultaten werden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaarddeviatie. Studenten t test werd gebruikt om significante verschillen tussen twee groepen te onderzoeken. P < 0,05 werd als significant beschouwd en P < 0,01 werd als zeer significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van IR780-TiS₂ /RV

Om IR780-TiS₂ . voor te bereiden /RV, ten eerste, biocompatibele TiS₂ nanosheets werden bereid door middel van een runderserumalbumine (BSA) en ultrasone trillingen ondersteunde exfoliatiemethode zoals eerder gerapporteerd [34, 35]. Vervolgens IR780-TiS₂ werd gesynthetiseerd in een substitutiereactie tussen een chlooratoom van IR780 en aminogroepen van BSA geabsorbeerd op de TiS₂ nanosheets met behulp van een zuurbindend middel TEA. Eindelijk, de IR780-TiS₂ nanoplatform laadde het antikankergeneesmiddel RV via fysieke absorptie. Het schematische diagram van IR780-TiS₂ /RV wordt getoond in Schema 1. Aanvullend bestand 1:Afbeelding S1 toont het TEM-beeld van de eiwitondersteunde geëxfolieerde TiS₂ , wat een weergegeven nanosheet-structuur was. Het XRD-patroon van de TiS₂ nanosheets werden ook gedetecteerd, wat wijst op een goede kristalliniteit van het bereide TiS₂ nanosheets, consistent met de waarnemingen van TEM (aanvullend bestand 1:figuur S2). Na functionalisering is de IR780-TiS₂ /RV-nanocomposiet had een vlokachtige morfologie met een roosterafstand van 0,25 nm zoals aangetoond door transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 1a, b) en een gemiddelde diameter van ongeveer 123,6 nm en een zeta-potentiaal van -37,2 mV zoals gedetecteerd door Nanosizer (Malvern Instrumenten) (Fig. 1c, d). Na een opslag van 2 weken in water, FBS of zoutoplossing, is de gemiddelde grootte van IR780-TiS₂ /RV bleef constant op ongeveer 123 nm (Fig. 1e), wat de stabiliteit van IR780-TiS₂ aangeeft /RV, mogelijk door hechting van BSA op het oppervlak van de TiS₂ nanobladen. Afbeelding 1f toont de absorptiespectra van vrij IR780, vrij RV, TiS₂ nanosheets en IR780-TiS₂ /RV. Het absorptiespectrum van IR780-TiS₂ /RV toonde de pieken van vrij IR780 en vrij RV, wat aangeeft dat zowel IR780 als RV met succes waren geconjugeerd met de TiS₂ nanobladen. De RV-laadverhouding van IR780-TiS₂ was ongeveer 112% (W /W ), die werd bereikt door niet-covalente interacties (bijv. π –π stapelen en hydrofobe interacties). Bovendien werden, volgens het BET-resultaat, de oppervlakten berekend op 15,2 m² /g en 122.1 m² /g voor bulk TiS₂ en TiS₂ nanobladen, respectievelijk. De geëxfolieerde TiS₂ nanosheets vertonen een veel groter BET-oppervlak dan dat van de bulk TiS₂ , die een groot actief gebied bieden voor het laden van medicijnen. De belasting was zeer waarschijnlijk vanwege het grote specifieke oppervlak van en de BSA-hechting aan de IR780-TiS₂ nanobladen [23]. Om verder te bevestigen dat RV en IR780 zijn geladen in TiS₂ nanosheets, de FTIR-spectra van TiS₂ nanobladen, IR780-TiS₂ , en IR780-TiS₂ /RV werden gemeten. In Aanvullend bestand 1:Afbeelding S6, alle karakteristieke pieken van TiS₂ nanosheets verschenen in FTIR-spectra van IR780-TiS₂ /RV. Bovendien verschenen er drie nieuwe pieken (~ 3191 cm⁻¹ , ~ 1510 cm⁻¹ , 1230 cm⁻¹ ) in het spectrum van IR780-TiS₂ /RV, wat aangeeft dat het bestaan van RV en IR780 [36, 37].

een Het TEM-beeld van IR780-TiS₂ /RV. b Het TEM-beeld met hoge resolutie van IR780-TiS₂ /RV. c De maatverdeling en d zeta-potentiaalverdeling van IR780-TiS₂ /RV. e De hydrodynamische verandering van de deeltjesgrootte van IR780-TiS₂ /RV in water, FBS en zoutoplossing gedurende 2 weken. v De absorptiespectra van RV, IR780, TiS₂ nanosheets en IR780-TiS₂ /RV

Na een laagvermogen NIR-bestraling van 3 minuten (808 nm, 0,3 W/cm² ), de IR780-TiS₂ /RV-oplossingstemperatuur steeg evenredig met de concentratie van IR780-TiS₂ /RV (0, 5, 10 g/ml), en de 10 μg/ml IR780-TiS₂ /RV-oplossing bereikte de hoogste temperatuur van 47,6 °C (Fig. 2a). Bovendien, IR780-TiS₂ /RV had zijn aanvankelijke fotothermische effect behouden, zelfs na vijf cycli van NIR-bestraling, terwijl vrije IR780 een verminderd fotothermisch effect vertoonde (figuur 2b). Deze resultaten duiden op de IR780-TiS₂ /RV nanocomposiet heeft een uitstekende fotostabiliteit.

een Het fotothermische effect van IR780-TiS₂ /RV onder de NIR-straling (808 nm, 0,3 W/cm² ) gedurende 3 minuten. b Temperatuurverandering van IR780 en R780-TiS₂ /RV na vijf cycli van NIR-bestraling (808 nm, 0,3 W/cm² , 3 min). c Het schema van fotothermisch getriggerde RV-afgifte. d Vrijgavekinetiek van RV van IR780-TiS₂ /RV in PBS-buffer (pH = 7.4 en 6.5) met of zonder NIR-bestraling (808 nm, 0.3 W/cm² ). **P < 0.01, vergeleken met pH = 7.4 en pH = 6.5 groep

Vervolgens werd de RV-afgifteverhouding gemeten onder verschillende omstandigheden van pH- en NIR-bestraling (Fig. 2c, d). Na 24 uur was de RV-afgifteverhouding 8,56% onder fysiologische omstandigheden (pH 7,4), maar deze was significant verhoogd tot 16,2% bij pH 6,5, wat aangeeft dat deze kan worden verbeterd door zwak zure omstandigheden. Bovendien was de RV-afgifteverhouding opnieuw significant verhoogd tot 44,8% bij pH 6,5 en een NIR-bestraling van 3 minuten (808 nm, 0,3 W/cm² ). Deze resultaten tonen aan dat de NIR-bestraling een controleerbare externe stimulus kan zijn om de afgifte van RV uit IR780-TiS₂ te triggeren /RV. Dit effect is waarschijnlijk te wijten aan de warmte die wordt gegenereerd door IR780-TiS₂ onder NIR-bestraling waardoor de niet-covalente adsorptie-interacties tussen RV en de IR780-TiS₂ oppervlak [35]. Bovendien kan de H+ in een zure omgeving de oppervlaktelading van TiS₂ . veranderen die de hydrofiele/hydrofobe balans van de nanodeeltjes veranderen [38, 39].

In vitro lokalisatie van IR780-TiS₂ /RV

Om de celopname en de intracellulaire distributie van IR780-TiS2/RV te onderzoeken, heeft de IR780-TiS₂ /RV-nanodeeltjes werden gelabeld met FITC en een CLSM werd gebruikt om de intracellulaire fluorescentie te visualiseren. Na een incubatie van 5 uur, TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV vertoonde een vergelijkbare fluorescentie-intensiteit in het cytoplasma (Fig. 3a, b), wat aangeeft dat beide nanocomposieten cellen kunnen binnendringen, waarschijnlijk via endocytose. De IR780-TiS₂ /RV nanocomposiet vertoonde een grotere intensiteit van gele en groene fluorescentie wanneer het FITC-signaal werd samengevoegd met MitoTracker-labeling (Fig. 3a, c). Deze resultaten geven aan dat IR780-TiS₂ /RV kan mitochondriën met een hoge efficiëntie targeten. Bovendien is de distributie van IR780-TiS₂ /RV in het cytoplasma werd verder bevestigd met behulp van TEM, dat in sommige mitochondriën vastgehouden nanodeeltjes liet zien (figuur 3d). Samen bevestigen deze resultaten duidelijk dat IR780-TiS₂ /RV bereikt een goede mitochondriale targeting, wat de accumulatie van mitochondriale geneesmiddelen verder bevordert, wat onmiddellijke celtoxiciteit veroorzaakt. De mitochondria-targeting werd waarschijnlijk gemedieerd door zowel het organisch-anion-transporterende polypeptide-gemedieerde actieve transport als het lipofiele kationkenmerk, waardoor de nanodeeltjes zich sterk ophopen in de mitochondriën van tumorcellen [30,31,32,33].

een De fluorescentiebeelden van CT26-cellen die zijn geïncubeerd met FITC-gelabeld TiS₂ /RV of IR780-TiS₂ /RV voor 5 h. Groene fluorescentie is het FITC-signaal en rode fluorescentie is het MitoTracker-signaal. b De overeenkomstige analyse van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van met FITC gelabeld TiS₂ /RV of IR780-TiS₂ /RV in cellen in Fig. 3a. c De overeenkomstige co-lokalisatiecoëfficiënt van FITC-gelabelde TiS₂ /RV of IR780-TiS₂ /RV en mitochondriën in cellen in Fig. 3a. M betekent mitochondriën. **P < 0.01, vergeleken met TiS₂ /RV groep alleen

In vitro NIR-getriggerde tumorchemotherapie

Eerst werd het fotothermische effect in vitro geëvalueerd. Na een incubatie van 5 uur, IR780-TiS₂ /RV vertoonde een temperatuurstijging van ongeveer 17 °C, terwijl TiS₂ /RV vertoonde een temperatuurstijging van ongeveer 10 °C (Fig. 4a). Het fotothermische effect werd toegeschreven aan IR780 en TiS₂ nanobladen. Aantonen van biocompatibiliteit als een nanoplatform voor het laden van medicijnen, IR780-TiS₂ vertoonde geen uitgesproken cytotoxiciteit onder de concentratie van 300 g/ml (Fig. 4b). Bovendien had RV met of zonder NIR-bestraling een vergelijkbaar concentratie-afhankelijk celdodend effect (figuur 4c). Bij dezelfde RV-concentratie bereikte RV het beste celdodende effect wanneer geladen door IR780-TiS₂ en bestraald door NIR vergeleken met alle andere aandoeningen, d.w.z. vrij RV, vrij IR780-TiS₂ , en camper geladen door TiS₂ (Fig. 4d). Interessant is dat de geloste IR780-TiS₂ platform vertoonde geen opmerkelijk antikankereffect bij blootstelling aan NIR-bestraling vergeleken met dat zonder NIR-bestraling (Fig. 4d), wat aangeeft dat de warmte gegenereerd door IR780-TiS₂ op de NIR-bestralingsstimulus werd voornamelijk gebruikt om de medicijnafgifte te activeren die vervolgens de cellen doodde. Deze resultaten suggereren dat IR780-TiS₂ /RV kan RV in de mitochondriën afgeven wanneer het wordt geactiveerd door NIR-bestraling en zo de lokale concentratie van RV in de mitochondriën opmerkelijk verhogen en een groter tumorremmend effect bereiken.

een De temperatuurveranderingscurven van PBS (controle), TiS₂ /RV, of IR780-TiS₂ /RV-behandelde cellen onder een NIR-bestraling van 3 minuten (808 nm, 0,3 W/cm² ). b In vitro cytotoxiciteit tegen CT26-cellen behandeld met verschillende concentraties IR780-TiS₂ . c Cellevensvatbaarheid van cellen behandeld met RV met of zonder NIR-bestraling (808 nm, 0,3 W/cm² ) gedurende 3 min. d Cellevensvatbaarheid van cellen behandeld met IR780-TiS₂ , RV, TiS₂ /RV, of IR780-TiS₂ /RV met of zonder NIR-straling (808 nm, 0,3 W/cm² ) gedurende 3 min. **P < 0.01, vergeleken met IR780-TiS₂ /RV zonder NIR-groep alleen

Het celdoodmechanisme

Ter illustratie van het onderliggende mechanisme van NIR-getriggerde chemotherapie van IR780-TiS₂ /RV analyseerden we het celdoodtype, mitochondriaal membraanpotentieel (Ψm) en expressieniveaus van belangrijke apoptose-gerelateerde eiwitten. Ten eerste werd FCM gebruikt om het celdoodtype te detecteren met behulp van Annexin V-FITC / PI-kleuring (figuur 5a). Bij dezelfde RV-concentratie, vrije RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV + NIR kunnen allemaal apoptose induceren, voornamelijk vanwege de aanwezigheid van RV. Er is inderdaad gerapporteerd dat RV het vermogen heeft om apoptose te induceren. Van deze behandelingen, IR780-TiS₂ /RV + NIR vertoonde het hoogste percentage apoptose van 90,8%. Vervolgens werden de signaalroutes voor apoptose onderzocht. Een afname van Ψm is gemeld als de belangrijkste gebeurtenis in de mitochondriale (intrinsieke) apoptotische route [40]. Bij dezelfde RV-concentratie, IR780-TiS₂ /RV + NIR verminderde Ψm met ongeveer 85%, wat significanter was dan een m-afname veroorzaakt door IR780-TiS₂ , TiS₂ /RV met of zonder NIR, en vrije RV (Fig. 5b). Dit experiment geeft aan dat IR780-TiS₂ /RV + NIR induceerde celdood die werd gemedieerd via de mitochondriale (intrinsieke) apoptotische route [41]. Vervolgens werd de expressie van eiwitten die cruciaal zijn voor apoptose, met name cytochroom c (cyto c), caspase 9 en caspase 3, gedetecteerd via een Western-blot-assay. De cellen behandeld met IR780-TiS₂ /RV + NIR bracht meer cytosolisch cyto c tot expressie dan die behandeld met RV, IR780-TiS₂ /RV, of IR780-TiS₂ /RV (Fig. 5c). De translocatie van cyto c is de belangrijkste initiator van de caspase-cascade [42,43,44]. Bijgevolg was de expressie van gesplitst caspase 9 en gesplitst caspase 3 aanzienlijk verhoogd in de IR780-TiS₂ /RV + NIR-behandelde cellen. Samen suggereren deze gegevens duidelijk dat apoptose werd gemedieerd door de mitochondriale (intrinsieke) route.

een Celapoptose van CT26-cellen behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV + NIR door FCM. b De verandering in mitochondriale membraanpotentiaal van CT26-cellen behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV met of zonder NIR-bestraling door FCM. c Expressie van apoptose-gerelateerde eiwitten in CT26-cellen die zijn behandeld met PBS (controle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV + NIR. Cytochroom c, gesplitst caspase-3 en gesplitst caspase-9 werden getest met Western-blot. **P < 0.01, vergeleken met IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV + NIR, en IR780-TiS₂ groepen

In vivo NIR-getriggerde tumorchemotherapie

Om de werkzaamheid van de NIR-getriggerde chemotherapie in vivo te evalueren, werden CT26-tumordragende muizen behandeld met zoutoplossing, zoutoplossing + NIR, RV, IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV + NIR, en IR780-TiS₂ /RV + NIR. De tumorgrootte in de IR780-TiS₂ De /RV + NIR-groep nam significant af en de tumor verdween bijna na 30 dagen behandeling, terwijl in de overige groepen het tumorvolume een stijgende trend vertoonde (figuur 6a). Tijdens de behandeling was er geen significant verschil in lichaamsgewicht tussen de groepen (Fig. 6b). Ten slotte onthulde H &E-beeldvorming geen merkbare weefseltoxiciteit of -afwijking in alle geteste groepen (figuur 6c). Deze resultaten tonen aan dat de IR780-TiS₂ /RV-nanocomposiet heeft een uitstekende door NIR geactiveerde antitumorwerking en een lage systemische toxiciteit. Bovendien is de biodistributie van de IR780-TiS₂ /RV werd in vivo geëvalueerd. Zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S4, werden de nanodeeltjes meestal in het leversysteem ingevoerd en mogelijk door het systeem gemetaboliseerd [45].

een Het groeiprofiel van CT26 xenografted tumoren na intraveneuze injectie van zoutoplossing (controle), RV, TiS₂ /RV en IR780-TiS₂ /RV met of zonder NIR-bestraling van 3 minuten (808 nm, 0,3 W/cm² ). b Lichaamsgewicht van tumordragende muizen na verschillende behandelingen. c H&E-beelden van de belangrijkste organen van alle behandelde muizen na 30 dagen behandeling. **P < 0.01, vergeleken met zoutoplossing, zoutoplossing + NIR, RV, TiS₂ /RV + NIR, en IR780-TiS₂ /RV-groepen

Conclusie

Samenvattend hebben we een mitochondria-gericht en RV-geladen nanoplatform ontwikkeld op basis van TiS₂ nanosheets for a NIR-triggered drug release and enhanced tumor chemotherapy. The as-prepared IR780-TiS₂ /RV with flake-like morphology showed good stability and biocompatibility. Owing to the mitochondria-targeted ability of IR780, IR780-TiS₂ /RV could selectively accumulate in tumor cell mitochondria and where it could release RV when triggered by the NIR irradiation. The released RV facilitated the mitochondrial membrane potential decrease, cyto c release, and, subsequently, initiated a cascade of caspase reactions to promote tumor cell apoptosis through the mitochondrial signaling pathway. In vitro and in vivo results demonstrated that IR780-TiS₂ /RV exhibited an efficacious NIR-triggered tumor chemotherapy without a significant tissue toxicity. These results suggest that IR780-TiS₂ /RV could be a promising chemotherapeutic agent in clinical practice.