Complementatie van ELISA en een interdigitated elektrode-oppervlak in gouden nanodeeltjesfunctionalisatie voor effectieve detectie van menselijke bloedstollingsdefecten

Resultaten en discussie

Voorbehandeling op een PS ELISA-oppervlak

Effectieve immobilisatie van eiwit of antilichaam op het polystyreen (PS) ELISA-oppervlak verbetert blijkbaar de detectielimiet van de interactie tussen doelwit en sonde. Er zijn verschillende immobilisatiemethoden gebruikt voor het aanhechten van eiwitten of antilichamen op de ELISA-plaat. In dit werk hebben we een chemisch gemodificeerd ELISA-oppervlak geïntroduceerd met BNP's voor immobilisatie van eiwitten of antilichamen. We wilden een van de belangrijke stollingsfactoren gebruiken, zoals factor IX (FIX), waarvan algemeen bekend is dat deze belangrijk is [32,33,34,35,36]. Figuur 1 toont de schematische weergave van de eiwitimmobilisatie op het polystyreen ELISA-oppervlak. Eerst werd het ELISA-oppervlak geactiveerd met 1% KOH. Bij afwezigheid van KOH-voorbehandeling is het aantal te binden APTES-moleculen op het PS-oppervlak minimaal. Dit komt door het ontbreken van polaire en waterstofbinding accepterende groepen, die de initiële adsorptie van APTES op polymeren vergemakkelijken [11]. Na KOH-behandeling werd het oppervlak gemodificeerd met een amine door de juiste concentratie APTES om de BNP's te vangen.

Karakterisering van het BNP

Voordat we verder gingen, hebben we de zoals ontvangen BNP's (15 nm) gekarakteriseerd door optische, morfologische en grootteverdelingsmetingen. Figuur 2a toont de UV-Vis-spectrofotometrie-analyse van de BNP's, die blijkbaar de piekmaxima bij 550 nm vertoonden. Transmissie-elektronenmicroscoopwaarnemingen laten zien dat de grootte van de BNP's ~ -15 nm is en dat de vorm goed is (figuur 2b en inzet). Fourier-transformatie infraroodspectroscopie-analyse werd uitgevoerd vanaf het golfgetal van 500 tot 4000 cm ⁻¹ (Fig. 2c). Een schijnbare enkele piek op 1650 cm ⁻¹ werd opgemerkt voor het goud samen met een andere kleine piek, terwijl de aanwezigheid van pieken voor aminegroepen die de aanhechting van APTES vertegenwoordigen. Verdere ondersteuning werd geleverd door de volumeverdeling en zeta-potentiaalanalyses. Op basis van deze analyse geeft de volumeverdeling aan dat er een kleine variatie is in de grootteverdeling (figuur 2d) en dat het zeta-potentieel -6,9 was, wat de stabiliteit van de in dit onderzoek gebruikte BNP's weergeeft (figuur 2e). /P>

Karakterisering van gouden nanodeeltjes. Uitgevoerd met de optimale maat 15 nm. een UV-Vis-spectrofotometrie-analyse. Een prominente enkele piek werd gevonden bij 550 nm. b Transmissie elektronenmicroscoop observatie. Inzet van de afbeelding toont de vergrote afbeelding. Schaalbalk wordt weergegeven. c Fourier-transformatie infrarood spectroscopie analyse. Schijnbare piekposities voor goud en NH₂ zijn aangegeven. d Volumeverdelingsanalyse van het BNP. De verkregen verdeling wordt getoond. e Zeta-potentiaalanalyse. De waarde bleek − 6,9

Voorbereiding en optimalisatie van amine-oppervlak om BNP's vast te leggen

De hoeveelheid APTES heeft een grote invloed op de immobilisatie van het BNP of antilichaam op het PS-oppervlak. Over het algemeen hebben zeer drukke APTES-moleculen een kans om vals-positieve resultaten te creëren. Aangezien APTES is gebruikt van 1 tot 2% om het antilichaam in verschillende sensoroppervlakken te immobiliseren, hebben we hier getitreerd van 1,25 tot 5% APTES, bereid in absolute ethanol. Vervolgens was ons doel om BNP's op de APTES-gemodificeerde oppervlakken te immobiliseren. Er is een mogelijkheid dat de hogere aantallen BNP's het crowding-effect opleveren, dus BNP's met 25, 50 of 100% van 15 nm werden getest op het APTES-gemodificeerde oppervlak om de geschikte verdunning te optimaliseren. Op deze gemodificeerde oppervlakken werd 250 nM van de FIX gedetecteerd met FIX-antilichaam. Zoals getoond in Fig. 2a en b, vertoont 1,25% APTES minder optische absorptie (OD) met alle verdunningen van BNP's (25, 50 en 100%), terwijl 2,5 en 5% APTES een hogere absorptie vertoonden met zowel 50 als 100% van BNP's. Tegelijkertijd werd de signaal-ruisverhouding verbeterd met toenemende APTES- en BNP-concentraties (Fig. 3a, b). De 5% APTES met 50 en 100% BNP's vertoonden niet-specifieke binding, en 50 en 100% BNP's met 2,5% APTES vertoonden vergelijkbare absorptie. Op basis van deze verkregen waarden kozen we 2,5% APTES en 25% verdunning van het BNP voor verdere experimenten.

Bepalen van de hoeveelheden APTES en BNP. Er werden drie verschillende concentraties (1,25, 2,5 en 5%) APTES gebruikt met drie verdunningen van het BNP (25, 50 en 100%). een Visuele detectie van FIX na toevoeging van het substraat. Controlestroken zonder FIX werden opgenomen. b Grafische weergave van het optimale APTES-niveau. 2,5% APTES en 25% BNP bleken optimaal te zijn

Bepaling van de potentiële BNP-omvang

Na APTES- en BNP-verdunningsoptimalisatie hebben we vervolgens de geschikte grootte van BNP's geëvalueerd. Omdat het oppervlak een cruciale rol speelt bij de immobilisatie van eiwitten, hebben we hier geprobeerd drie verschillende BNP's van verschillende groottes te immobiliseren, waaronder 10, 15 en 80 nm. BNP's van verschillende groottes hebben verschillende oppervlakten en verschillende ladingen om het eiwit aan te trekken, en het bindingsvermogen op het APTES-gemodificeerde oppervlak is ook anders. Zoals getoond in Fig. 4a, werd 250 nM FIX gedetecteerd met het ELISA-oppervlak gemodificeerd met 10, 15 en 80 nm BNP's. Het bleek dat BNP's van 15 en 80 nm bijna dezelfde absorptie van 0,4 (OD) vertonen voor de detectie van 250 nM FIX, maar BNP's ter grootte van 10 nm vertonen slechts 0,34 OD. Uit dit experiment hebben we bevestigd dat 15 of 80 nm BNP geschikt zijn voor verdere experimenten, en we gingen verder met 15 nm BNP.

een Het bepalen van de ideale omvang van het BNP. Bij 10, 15 en 80 nm lieten 15 en 80 nm vergelijkbare resultaten zien. Met FIX is met vijftien nanometer de detectielimiet bepaald. b Een controle-experiment voor de detectie van FIX. Drie verschillende controle-experimenten (C1 - zonder FIX-antilichaam; C2 - zonder anti-muis IgG; C3 - zonder FIX) werden uitgevoerd. In geen van de controle-experimenten werd een significant signaal gevonden. Cijfer-inzetstukken geven de visuele resultaten weer

Experimentele strategieën om non-fouling en hoge prestaties te bevestigen

Voordat we de FIX op het BNP-gemodificeerde ELISA-oppervlak detecteerden, hebben we drie verschillende soorten controle-experimenten uitgevoerd, zoals uitgelegd in de sectie "Materialen en methoden". Zoals getoond in Fig. 4b, konden we geen significante absorptie waarnemen in de putjes voor controle-experimenten 1, 2 en 3 (C1, C2 en C3). In het specifieke experiment (S) wordt het hogere absorptieniveau duidelijk geassocieerd met duidelijke kleurveranderingen. In het geval van C1 hebben we geen FIX-antilichaam toegevoegd, wat bevestigt dat FIX-antilichaam specifiek interageert met FIX (in S). Er werd geen waarneembaar signaal gevonden in de afwezigheid van anti-muis IgG in C2, wat verdere verankering geeft voor de juiste interactie van FIX en antilichaam gevolgd door anti-muis IgG. In C3 konden we bij afwezigheid van FIX de significante absorptie niet meten. Uit deze resultaten werd de juiste interactie van FIX met zijn antilichaam op het ELISA-oppervlak bevestigd zonder niet-specifieke binding.

BNP-ondersteunde ELISA versus conventionele ELISA:bepaling van gevoeligheid

Na het uitvoeren van de controle-experimenten, hebben we FIX gedetecteerd met BNP-gemodificeerde oppervlakken en de resultaten vergeleken met de conventionele ELISA-methode. We hebben drie verschillende experimenten uitgevoerd voor de detectie van FIX. Eerst werd het BNP geïmmobiliseerd op APTES-gemodificeerde oppervlakken en vervolgens werd FIX door elektrostatische interactie op het oppervlak van het BNP bevestigd. Door de elektrostatische interactie hebben de meeste eiwitten de mogelijkheid om aan het BNP-oppervlak te binden; op die manier konden we FIX op het ELISA PS-oppervlak immobiliseren. De eiwitimmobilisatie hangt ook af van de ladingen die voortkomen uit de aminozuren en het BNP. Gopinath et al. [37] hebben de sterke binding van FIX op het BNP-oppervlak bewezen, en ze hebben ook gevonden dat het stabiel is onder omstandigheden met veel zout. Bij de tweede methode werden BNP en eiwit eerst voorgemengd voordat ze werden geïmmobiliseerd op het geamineerde ELISA PS-oppervlak. Er werd verwacht dat meer eiwitten op deze manier kunnen binden, omdat er een grotere kans is dat eiwitmoleculen in de oplossingstoestand aan het BNP-oppervlak kunnen binden. De voorgemengde oplossing werd vervolgens geïmmobiliseerd op de APTES-gemodificeerde amine-oppervlakken. Deze methoden werden vergeleken met de conventionele ELISA-methode. Zoals getoond in Fig. 5a, toonde conventionele ELISA (methode 1), toen we de FIX-concentratie titreerden van 0 tot 200 nM, de detectielimiet van 6 nM. De APTES-GNP-FIX-methode (methode 2) geeft de detectielimiet van 200 pM weer, wat meer dan 30 keer hogere gevoeligheid is in vergelijking met de conventionele ELISA. Verbetering van de gevoeligheid wordt bereikt door de juiste oriëntatie van grote aantallen antigenen die op de ELISA PS-plaat zijn geïmmobiliseerd, en uiteindelijk zullen meer antilichamen een interactie aangaan. In dit onderzoek werden gouden nanodeeltjes gebruikt om meer antigenen te immobiliseren door middel van aminemodificatie van de ELISA-plaat. Bij de conventionele ELISA worden antigenen direct geïmmobiliseerd op de ELISA-plaat, wat leidt tot een kleiner aantal moleculen dat zich aan het oppervlak bindt en een verminderde gevoeligheid veroorzaakt ten opzichte van de huidige door gouden nanodeeltjes gemedieerde strategie. Bovendien geeft gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie een verdere verbetering van de gevoeligheid, zoals blijkt uit de onderzoeken met BNP's. Toen we BNP's premixen met FIX, zoals verwacht, was de detectielimiet sterk verbeterd en werd het niveau van 100 pM bereikt, wat een 60 keer hogere gevoeligheid is dan conventionele ELISA. Zoals getoond in Fig. 5a, kon duidelijk worden gezien dat wanneer we BNP's gebruiken voor eiwitimmobilisatie, de maximale absorptie ~ -0,6 bereikte voor zowel voorgemengde als direct geïmmobiliseerde eiwitten op de BNP-oppervlakken, maar de absorptie gevonden met conventionele ELISA was ~ -0,4 met behulp van de vergelijkbare concentratie (200 nM) van FIX. Zelfs bij andere concentraties liet methode 3 een hoger verschil in absorptie zien in vergelijking met de conventionele ELISA, en dit was ook redelijk hoger dan de methode 2. Bij conventionele ELISA werd de zichtbare detectie gevonden vanaf 25 nM, en vanaf 3 nM in methode 2. Met methode 3 konden we de kleurverandering van 200 pM FIX zichtbaar zien vanwege een hogere absorptie (figuur 5a). De absorptie was verzadigd bij 25 nM in methode 3. Omdat we de kleurveranderingen van 200 pM FIX konden visualiseren, hebben we de detectielimiet geëvalueerd en getitreerd met behulp van de lagere concentraties FIX. Het was duidelijk dat de detectielimiet 100 pM bereikte toen we de BNP's en FIX voormengden (Fig. 5b).

een Vergelijking van de gevoeligheid van FIX in BNP-gemodificeerde ELISA met de conventionele ELISA. FIX werd getitreerd van 0,2 tot 200 nM. Conventionele ELISA vertoont de detectielimiet van 6 nM. Op de BNP-gemodificeerde ELISA werd het signaal waargenomen tot 200 pM. Inzet van de afbeelding geeft de visuele resultaten weer. b Detectielimiet van FIX op BNP-gemodificeerde ELISA-plaat. FIX werd getitreerd van 25 tot 100 pM. De detectielimiet bleek 100 pM te zijn. Cijfer-inzetstukken geven de visuele resultaten weer

Detectie van FIX in menselijk serum en verbetering door FIX toe te voegen

Omdat FIX een belangrijke rol bleek te spelen in de stollingscascade [38, 39], hebben we na controle van de detectielimiet ook FIX gedetecteerd in humaan serum. Voor deze analyse hebben we het menselijke serum getitreerd in het bereik tussen 1:1280 en 1:20 verdunningen. Het verdunde serum werd voorgemengd met BNP's en geïmmobiliseerd op het APTES-gemodificeerde ELISA-oppervlak, zoals hierboven vermeld. Het was duidelijk dat de FIX werd gedetecteerd uit 1:640 verdunning van serum, wat overeenkomt met 125 pM FIX (Fig. 6a). Het gezonde menselijke serum bevat gewoonlijk ongeveer 87 nM FIX, samen met andere belangrijke eiwitten zoals albumine en globuline. Met onze strategie bereikten we de specifieke detectielimiet van 125 pM in humaan serum, wat nuttig is voor het identificeren van een bloedstollingsdefect. Aan de andere kant, toen we FIX van 1 tot 8  nM toevoegden aan de 1:640 verdunning van menselijk serum, vertoonde het toenames in de absorptie die gelijktijdig toenam met FIX-concentraties (Fig. 6b).

een Detectie van FIX in menselijk serum. Menselijk serum werd verdund van 1:20 tot 1:1280. FIX werd gedetecteerd in humaan serum verdund 1:640 (de afbeelding binnenin geeft de schematische weergave aan). b Spiking van FIX (0,125 tot 8 nM) in 1:640 verdunning van humaan serum. Met verhogingen van de FIX-concentratie werd de absorptie verhoogd. Cijfer-inzetstukken geven de visuele resultaten weer

Detectie van BNP-FIX op IDE-oppervlak:complementatieanalyse

Omdat bleek dat BNP-geconjugeerde FIX de detectielimiet verbeterde, hebben we een vergelijkbare strategie toegepast met behulp van de elektrochemische sensor met IDE-oppervlak om deze bevindingen aan te vullen. We hebben de FIX getitreerd van 25 tot 200 pM (gemengd met BNP's), geïmmobiliseerd op het amine-gemodificeerde IDE-oppervlak en vervolgens gedetecteerd met FIX-antilichaam. Zoals getoond in Fig. 7a, met toename van de FIX-concentratie, werd het huidige niveau ook gelijktijdig verhoogd vanaf de basislijn. FIX-niveau was verzadigd vanaf 200 pM en de detectielimiet bleek 25 pM te zijn. Deze detectie is viervoudig verbeterd vergeleken met ELISA (100 pM). Bovendien werd FIX-detectie aangetoond in het verdunde menselijke serum (Fig. 7b). Voor dit experiment werd menselijk serum verdund van 1:80 tot 1:1280. Zoals weergegeven in de afbeelding, vertoont de verdunning van 1:1280 (rode curve) een duidelijk verschil met de basislijn (zwarte curve) met de 3σ-schatting, wat aangeeft dat de duidelijke detectie van FIX uit menselijk serum met de verdunning van 1:1280 overeenkomt met met de resultaten van ELISA (gedetecteerd op 1:640). Detectie van IDE met minder verdunning toont de toename in de gevoeligheid.

een Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. b Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280