Geavanceerde detectie van miRNA-335-5p met interdigitaal elektrode voor beoordeling van buikaorta-aneurysma ernst

Samenvatting

Een buikaorta-aneurysma (BAA) verwijst naar de vergrooting van de onderste arterie van de buikaorta, en vroege detectie is dringend nodig voor diagnose. In deze studie werd een interdigitaal elektrode (IDE) sensoroppervlak gebruikt om miRNA-335-5p te identificeren, wat de vorming van BAA's weerspiegelt. De uniformiteit van het siliciummateriaal werd waargenomen via 3D-profilometrie, en de chemisch gemodificeerde hoog geleidende oppervlakte verbeterde de detectie via de I-V modus. De doel-miRNA-335-5p werd in een dosis-afhankelijke manier gedetecteerd en op basis van lineaire regressie en 3σ analyses was de gevoeligheid 1 fM met een gebiotinineerde probe. De hoge specificiteit werd aangetoond door de doelsequentie te discrimineren van niet-complementaire en enkel- en drievoudig mismatched sequenties. Deze resultaten demonstreerden hoge prestaties detectie van miRNA-335-5p met goede reproduceerbaarheid voor bepaling van BAA-ernst.

Inleiding

Buikaorta-aneurysma's (BAA's) zijn levensbedreigende ziekten gedefinieerd als een buikaorta met diameter >3 cm of groter dan normaal. Deze aandoening treedt op met atherosclerosis of plakkervorming, wat de wanden van de buikaorta verzwakt en een uitwaartse uitsteeksel veroorzaakt, vergelijkbaar met een ballon. In de tijd verwijdert de arteriewand, vergelijkbaar met het verouderen van tuinslangen. De druk van het bloed dat door de aorta stroomt, zorgt ervoor dat dit verzwakte gebied uitwaarts bulgeert, wat een aneurysma wordt genoemd. BAA ontstaat wanneer het verzwakte deel van de aorta leidt tot complicaties. BAA kan leiden tot dood door ruptuur in kleine aneurysmata. Momenteel worden lichamelijke onderzoeken, CT-angiogrammen, MRI en echografie gebruikt voor diagnose. Er zijn echter geen detectiemethoden voor BAA, die vaak per toeval ontdekt worden bij analyse van andere gezondheidsproblemen. Dit leidt tot vertraagde identificatie, met onnodige gezondheidsrisico's. Om dit op te lossen, moeten onderzoekers vroege detectiemethoden ontwikkelen, en een potentiele strategie is de ontwikkeling van een sensoringssysteem.

Vroege, snelle en gevoelige ziekte detectie op kwantitatieve wijze is een vitaal doel voor klinische diagnose. Huidige biosensing platforms voldoen aan verschillende eisen en vereisen geschikte laboratoriuminstellingen en training. De meeste methoden zijn niet draagbaar, wat vereist is voor ideale point-of-care detectie. Verder is een analyse van veranderingen in biomarkerniveaus zeer wenselijk om artsen te helpen bij nauwkeurige en snelle besluitvorming. Circulerende biomarkeren die in specifieke gebieden geëxprimeerd worden, moeten verder onderzocht worden om BAA te diagnosticeren en behandelingsvoortgang te volgen. Identificatie van deze circulërende biomarkeren helpt bij diagnose en patientenfollow-up na behandeling. Om aan deze behoeften te voldoen, stelt deze studie voor sensoren te genereren voor geschikte biomarkeren voor BAA. De sensor (interdigitaal elektrode) in deze studie heeft potentieel voor hoge prestatie analyse met een breed bereik aan biomarkeren. Het is een dielectrode systeem met afwisselende gaten en vingers die werken onder dielectrische metingen.

Biomarkeren kunnen elke biomoleculen zijn: DNA, RNA, eiwritten, koolhydraten, lipiden en hun gemodificeerde vormen. Daarnaast hebben onderzoekers voorgesteld dat verschillende biomarkeren, zoals niet-coderende RNA's, geëxprimeerd worden in het cellulaire systeem, maar niet in eiwritten vertaald. Niet-coderende RNA's zijn meestal niet vertaald en hebben doorgaans korte sequenties. Verschillende klassen: microRNA's (miRNA's), ribosomale RNA's, transfer RNA's, kleine nucleolaire RNA's, kleine kern RNA's, telomerase RNA's, snRNA's, Xist RNA's, vault RNA's, 7SL RNA's. miRNA's functioneren voornamelijk in transcriptionele en post-transcriptionele regulatie van genexpressie, vaak resulterend in genstilting. Recent beschreven onderzoekers het belang van miRNA's voor BAA voorspelling en rapporteerden een reductie in expressie van miRNA-335-5p in BAA patiënten. De combinatie van klinische factoren en microRNA-expressie verbeterde ziektevoorspelling drastisch met verhoogde nauwkeurigheid. Onderzoekers richtten zich specifiek op miRNA-335-5p, wat een significant minimal bereik vertoonde in individuen met snelgroeiende BAA. Een afname in miRNA-335-5p niveaus verhoogde vertrouwen in detectie van groeiende BAA. Met andere woorden, negatieve output (hogere niveaus) van miR-335-5p duidt op BAA-ernst en minimaliseert arbeidszame screening. Deze bevinding werd gedemonstreerd door Wanhainen et al. en toonde aan dat miRNA's nuttige biomarkeren zijn voor BAA screening en eliminatie van risico op snelgroeiende BAA. De huidige studie demonstreert de toepassing van miRNA-335-5p detectie via een interdigitaal elektrode (IDE) sensor om de ernst van BAA in aangedane individuen te bepalen.

Materialen en methoden

Reagentia en biomoleculen

Streptavidine, 1,1'-carbonyldiimidaazol (CDI), fosfaatbufferoplossing (PBS) van Sigma-Aldrich, VS. Ethanolamine van Fisher Scientific, VK. Alle oligo's commercieel gesynthetiseerd via Apical Scientific Sdn. Bhd., Maleisië.

Patronenontwerp op chroommasker

Initieel patronen van de dielectrische sensor ontworpen met AutoCAD software. Gewenste afmetingen: lengte 7500 µm, breedte 4100 µm, 20 vingers-gaten paren, gatgrootte 85 µm, elektrodegrootte 100 µm, elektrodedikete 40 nm, vingerslengte 4000 µm. Patroon geprint op blanco fotomasker en geplakt op chroomglas oppervlak. Chroomglas vastgezet onder UV-blootstellingssysteem voor patroonoverdracht. Siliciumdioxide substraat met aluminium dunne film tegenover chroomglas geplaatst en 10 s UV-licht blootgesteld. Patroon overgedragen gevolgd door ontwikkelproces met resist developer.

Fabricage van interdigitaal elektrode

Oppervlakte elektrode geproduceerd via conventioneel microelektronisch fabricageproces: (i) 4-inch wafer met bestaande native oxide. (ii) Wafer gereinigd met buffered oxide etch (BOE) en pirahnamengsel voor native oxide en anorganische contaminanten. (iii) 2800 Å dikte oxidelag gegroeid via 1 uur natte thermische oxidatie bij 1000 °C. (iv) Wafer met oxidelag in vier gedeeld voor betere hantering. (v) Metaallaag gedeponeerd met adhesielaag voor geleidende laag. Aluminiumlaag (40 nm) geproduceerd op 3 cm lang met 0,5 mm diameter via thermische verdamping fysieke depositie. (vi) Laag positieve fotoresist spincoating op substraat. (vii) Wafer zacht gebakken 90 °C, 60 s. (viii) Wafer uitgelijnd met chroommasker, 10 s UV-blootstelling. (ix) Wafer gespoeld in RD6 developer oplossing 15 s voor onblootgestelde gebied, resulterend in IDE patroon met oxide. (x) Wafer hard gebakken 90 °C, 120 s. (xi) Wafer geëtst met aqua regia voor blootgestelde gebieden van beide lagen. (xii) Oppervlaktepatroon geproduceerd, overgebleven fotoresist afgewassen met aceton. 3D nanoprofilometrie (Hawk 3D-profilometrie, VS) analyse voor duidelijke afbeelding van gaten tussen elektroden. Stroommetingen (A) uitgevoerd met Keithley 6487 met lineaire sweep 0-2 V, stap 0,1 V (bij 20 s).

Oppervlakte chemische functionalisatie: Tetravalente streptavidine-biotine strategie

Voor oppervlakte chemische functionalisatie: siliciumoppervlak grondig gewassen met 1 M kaliumhydroxide (pH 9,0) voor activering. Vervolgens gemodificeerd met CDI (0,5 M) met 1 u incubatie om te reageren met 100 nM streptavidine (1 u), uitgestoten uit originele voorraad in 10 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4). Ongereageerde ruimtes geblokkeerd met 1 M ethanolamine (1 u). Vervolgens tetravalente streptavidine gereageerd met 1 µM gebiotinineerde probe miRNA-335-5p (10 min) bij kamertemperatuur. Na elke modificatie oppervlak grondig gewassen met PBS tenzij anders aangegeven.

Ontwerp probe en doelsequenties uit miRNA-335-5p

Volledige miRNA-335-5p (5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3') met accescode MIMAT0000765, verzameld uit databank. Gewenste regio als doel: 5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3'. Probe ontworpen als 5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3'. Aan 3'-eind biotine getagd voor interactie met geïmmobiliseerde streptavidine op sensoroppervlak. Secundaire structuur van volledige miRNA-335-5p voorspeld via online mfold software.

Probe-doel interacties: miRNA-335-5p sequenties

Na binding gebiotinineerde probe aan streptavidine oppervlak, interactie doel miRNA-335-5p sequentie (10 min) bij kamertemperatuur van lage femtomolaire tot lage nanomolaire concentraties (1 fM tot 1 nM, 10-voudige seriële verdunningen in PBS). Bevestigingen onafhankelijk getest van lagere naar hogere concentraties, na duplexvorming oppervlak gewassen met 5-voudige volumes PBS, metingen genomen.

I-V metingen

Elektrische karakterisaties via I-V metingen met Keithley 6487 Picoammeter met spanning/stroomvoorziening. Metingen vastgelegd op bovengenoemde voltages op kaal oppervlak gevolgd door elke oppervlakte chemische modificatie. Voor interactieve analyse tussen probe en doel miRNA-335-5p bij elke concentratie, meting na wasstap met 10 reactievolumes. Alle modificaties, interacties en metingen onder natte condities tenzij anders aangegeven.

Resultaten en discussie

Fabricage van IDE sensor en oppervlakteanalyse

Deze studie gebruikte miRNA-335-5p als instrument om BAA-ernst te verduidelijken via interactieve analyse op IDE sensor (Fig. 1). Voor interactieve analyse met probe en doel uit volledige miRNA-335-5p, IDE oppervlak ontworpen en geproduceerd via conventionele fotolithografische technieken. Stap-voor-stap oppervlaktemodificaties uitgevoerd en gemeten met amperemeter (Fig. 2b, c). Maskeruitlijning voor IDE fabricage en uniformiteit bevestigd via hoge-resolutie 3D nanoprofilometrie analyse. Dit bevestigde fabricage en afstand tussen vingers goed uitgelijnd (Fig. 2d). IDE's hebben elektrodegrootte ~100 µm met spacing ~85 µm, groot geïntercaleerd netwerk met miljoenen biomarkeren in serie/parallel vormend. Om succes van geproduceerde IDE's te waarborgen, verschillende kaale apparaten gebruikt voor reproduceerbaarheid onder dielectrisch systeem. Dit systeem meet moleculaire trillingen tussen dielectroden door dipolmoment (Fig. 2c). Deze dielectrische IDE is een wel geaccepteerd systeem, breed gebruikt voor biomoleculaire en chemische analyses. In deze studie alle oppervlakte chemische modificaties en interactieve analyses gemeten via I-V stroommodus.

Hoog-dichtheid oppervlakte moleculaire assemblage: Streptavidine-biotine strategie

Hoog-dichtheid moleculaire hechtingen op sensoroppervlak of biochips zijn cruciaal en sterk afhankelijk van oppervlaktefunctionalificatie. Deze studie stelde voor om het juiste oppervlak te bepalen voor hoog aantal moleculaire accommodaties, verplicht voor genexpressie, ontdekking, moleculaire analyse. Voor deze toepassingen vereist generatie van analytische systeemoppervlakken juiste koppeling van moleculen om ze in geschikte formaten te immobiliseren. Deze materiaaloppervlakken bestudeerd om oppervlakte interactiemechanisme te onderzoeken, want ze zijn goedkoop en bieden variabele pakkingsdichtheden, morfologie, dikte. Dit vergemakkelijkt juiste hechting van moleculen en voorkomt verlies van biomoleculaire activiteit. Verder behoudt juiste oriëntatie van biomoleculaire immobilisatie met juiste secundaire structurele bevestiging.

Om hoog-dichtheid moleculen op oppervlak te bereiken: siliciumoppervlak grondig gewassen met alkalische oplossing en gemodificeerd met CDI. Om hoge niveaus biotineringsproeven op CDI oppervlak te vangen, probe geïmmobiliseerd met streptavidine. Streptavidine is een tetravalent eiwit met vier plaatsen om biotine te binden, beschouwd als hoge-affiniteit molecuul in biologische wetenschappen. IDE oppervlak had stroomniveau 2,08E-10 A, na CDI hechting toegenomen tot 9,2E-06 A. Dit duidt aan dat CDI-gemodificeerd IDE oppervlak geschikt is voor analyses. Bij toevoeging streptavidine stroomniveau verder toegenomen tot 2,36E-05 A. Met deze strategie hoger aantal gebiotinineerde probes geïmmobiliseerd uit volledige miRNA-335-5p op IDE oppervlak (Fig. 3a). Biotine interacties na blokkeringsstap op IDE oppervlak om ongereageerde gebieden te maskeren. Bij elke oppervlaktemodificatie stroomveranderingen bepaald (Fig. 3b). Fig. 3c: na ethanolamine toevoeging stroomveranderingen 2,53E-05 A, bij 1 nM gebiotinineerde vangsequentie stroom gedaald tot 1,29E-08 A. Deze stroomverandering bevestigt immobilisatie vangprobe op IDE sensoroppervlak. Doorgaans draagt enkelstrengs oligonucleotide meer negatieve lading met blootgelegde 5-carbonaat fosfaat ruggengraat (probe), terwijl nettolading ethanolamine neutraal is. Dit grote ladingverschil resulteerde in duidelijke stroomvariatie (Fig. 3c). Parameter herstelde weer bij duplexvorming met doeldraad door reductie blootstelling fosfaat ruggengraat en additionele positieve lading van nucleobasen in miRNA draad (Fig. 4a).

Dosis-afhankelijke interactieve analyse op IDE

Na hechting gebiotinineerde probe op sensoroppervlak, doel interactieve analyse met verschillende doses. Validatie van lage femtomolaire tot lage nanomolaire bereik. Voorlopige analyse met 1 nM doel miRNA-335-5p sequenties. Na toevoeging 1 nM doel sequentie op vangprobe-gemodificeerd oppervlak, stroomniveau veranderd van 1,29E-08 A tot 1,29E-07 A (Fig. 4a); hybridisatie bevestigd tussen vangprobe en doelsequentie. Na bevestiging, limiet van detectie bepaald door titratie doelsequentie van 1 fM tot 1 nM, apart op vangprobe-gemodificeerde oppervlakken. Stroomveranderingen gedetecteerd voor en na immobilisatie. Stroomverschillen voor 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM hybridisaties: 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21, 11,61E-08 A respectievelijk. Duidelijke dosis-afhankelijke stroomveranderingen gedetecteerd in alle geteste concentraties (Fig. 4b).

Hoge analytische prestaties: Gevoeligheid, specificiteit, reproduceerbaarheid

Op basis van concentratie-afhankelijke toename, lineaire regressieanalyse uitgevoerd. Gevoeligheid geschat via 3σ berekening, viel op 1 fM (Fig. 5a, b). Concentratie <1 fM toonde achtergrondsein en lagere waarden. Specificiteitsanalyse uitgevoerd om doelsequenties te discrimineren van niet-complementaire en enkel- en drievoudig mismatched sequenties. Ontworpen probe toonde sterkere reactie met perfecte miRNA-335-5p complementaire sequenties dan andere sequenties (Fig. 6a). Enkel-mismatched sequentie resulteerde in hogere stroomrespons dan niet-complementaire en drievoudig mismatched sequenties door gedeeltelijke duplexvorming. Reproduceerbaarheidsanalyses met alle chemische en biologische modificaties op IDE oppervlak in drievoud, data gemiddeld. Gemiddelde data toonden geen significante veranderingen bij herhaalde experimenten (Fig. 6b). Verder, ter ondersteuning IDE prestaties, kenmerken van beschikbare methoden vergeleken (Tabel 1).

Conclusies

Ontwikkeling van analytische methode met biologische biomarkeren helpt BAA diagnosticeren tijdens lichamelijke onderzoeken. In dit onderzoek werd miRNA-335-5p-gemedieerde detectie voor voorspelling BAA-ernst ontwikkeld, aangezien miRNA-335-5p geëxprimeerd bleek met BAA. Output gegenereerde IDE detectie toonde lagere tot hogere detectieniveaus voor voorspelling BAA-ernst. Lagere detectielimiet 1 fM met hoge specificiteit en reproduceerbaarheid voor hoge prestatie analyse. Tetravalente streptavidine-biotine methode in dit onderzoek leverde goed resultaat en kan gebruikt worden voor andere biomarkeren analyses.

Beschikbaarheid van data en materialen

Alle data volledig beschikbaar zonder beperkingen.

Afkortingen

BAA:

Buikaorta-aneurysma

CDI:

1,1'-Carbonyldiimidaazol

PBS:

Fosfaatbufferoplossing

IDE:

Interdigitaal elektrode

UV:

Ultraviolett