Bufalin-geladen gepegyleerde liposomen:antitumorwerkzaamheid, acute toxiciteit en weefseldistributie

Resultaten en discussie

Fysische en chemische eigenschappen van BF/PEG-LP

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) onthulde dat BF/PEG-LP een uniforme bolvorm had, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S1A. De structuur van BF/PEG-LP werd geïdentificeerd door FT-IR. Zoals weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S1B, de karakteristieke pieken bij 3495 cm ⁻¹ en 3436 cm ⁻¹ vertegenwoordigde de N–H rektrilling van de amidebinding, terwijl de piek bij 1079 cm ⁻¹ vertegenwoordigde de C–O–C strektrilling van etherbinding in BF/PEG-LP. Om de veiligheid van de formuleringen in vitro te evalueren, werd de hemolysesnelheid van blanco liposomen, BF en BF/PEG-LP bepaald met een RBC-hemolysetest, en werd de cellevensvatbaarheid van HepG2- en HCT116-cellen behandeld met blanco liposomen gemeten door CCK -8 bepaling. De BF-groep vertoonde duidelijke hemolyse; de hemolysesnelheid van de BF/PEG-LP-groep was echter significant lager bij dezelfde concentratie (P < 0.01). Toen de concentratie van BF/PEG-LP werd verhoogd tot 200 g/ml, was de hemolysesnelheid duidelijk hoger dan die van blanco liposomen (P < 0.01, Afb. 1a). De resultaten van de CCK-8-assay toonden aan dat de blanco liposomen niet-toxisch waren voor HepG2- en HCT116-cellen (Fig. 1b).

Fysische en chemische eigenschappen van BF/PEG-LP. een Hemolysesnelheid van rode bloedcellen van blanco liposomen, BF en BF/PEG-LP. Gegevens worden weergegeven als \( \overline{x} \)± s (n = 3). **P < 0.01 vs. BF/PEG-LP-groep bij dezelfde concentratie. b Cytotoxiciteit van blanco liposomen in HepG2- en HCT116-cellen. Gegevens worden weergegeven als \( \overline{x} \) ± s (n = 6). c Stabiliteit van BF/PEG-LP in verschillende pH-omstandigheden. Gegevens worden weergegeven als \( \overline{x} \) ± s (n = 6). **P < 0.01 vs. pH 7.4-groep op hetzelfde tijdstip. Afkortingen:BF, bufalin; BF/PEG-LP, met bufaline geladen PEGylated liposomen

Het effect van de pH van de omgeving op de stabiliteit van BF/PEG-LP werd geëvalueerd met UV-spectrofotometrie. Figuur 1c laat zien dat de absorptie van het monster uit de pH   5,0-groep toenam met de opslagtijd, wat aangeeft dat BF/PEG-LP stabieler was in PBS bij pH 7,4 (P < 0.01).

In vitro apoptose van tumorcellen

Apoptose in HepG2-, HCT116-, A549- en U251-cellen geïnduceerd door BF/PEG-LP werd bepaald met CCK-8-assay. De IC₅₀ waarden van BF / PEG-LP voor alle geteste cellen worden weergegeven in tabel 1. BF / PEG-LP verminderde de levensvatbaarheid van alle celtypen aanzienlijk op een dosisafhankelijke manier (figuur 2). Het remmende effect van BF/PEG-LP was vergelijkbaar met dat van DOX (positieve controle, 50 g/ml) bij concentraties van meer dan 40 ng/ml. Bovendien, gebaseerd op de IC₅₀ waarden, werd de gevoeligheid van cellen voor BF/PEG-LP als volgt gerangschikt:HCT116 > HepG2 > U251 > A549.

Cytotoxiciteit van BF/PEG-LP in HepG2 (a ), HCT116 (b ), A549 (c ), en U251 (d ) cellen. Gegevens worden gepresenteerd als\( \overline{x} \) ± s (n = 6). *P < 0.05, **P < 0.01 vs. controlegroep voor elke cellijn. Afkortingen:BF/PEG-LP, met bufaline geladen PEGylated liposomen; DOX, doxorubicine

Algemene farmacologische evaluatie

Na toediening van BF/PEG-LP was het algemene gedrag van muizen anders dan dat van de blanco groep. Vooral de muizen in de hooggedoseerde BF/PEG-LP-groep vertoonden trillingen en speekselvloed. Na toediening bleven de muizen 10 min in de open velddoos en werd het aantal actieve rasters geregistreerd. In de positieve controlegroep (pentobarbital) was het aantal actieve rasters slechts 342 ± 35, wat significant lager was dan dat in de controlegroep (725 ± 127, P < 0.05). Zoals te zien is in figuur 3a, was het aantal actieve rasters in de BF / PEG-LP-groep met gemiddelde en hoge dosis significant verschillend van de controlegroep. De hengelklimtest toonde aan dat BF/PEG-LP een zeker bevorderend effect had op de gecoördineerde beweging van muizen na een week toediening in vergelijking met die van de controlegroep (P < 0,01), terwijl chloorpromazine een significant bevorderend effect had op de positieve controlegroep (P < 0.05), zoals weergegeven in Afb. 3b.

Farmacologisch effect van BF/PEG-LP op locomotorische activiteit (a ) en gecoördineerde oefening (b ) in muizen. Gegevens worden weergegeven als \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0.05, * ^* P < 0.01 vs. controlegroep op elk tijdstip; ^# P < 0,05 vs. laaggedoseerde BF/PEG-LP-groep. Afkortingen:BF/PEG-LP, met bufaline geladen PEGylated liposomen

Tumor xenograft-experiment

Bij langdurige toediening vertoonden muizen in de positieve controle-, BF- en BF/PEG-LP-groepen mentale retardatie, verminderde voedselinname, langzame reactie en doffe vacht. Dood van muizen trad op in zowel de BF- als de BF/PEG-LP-groep. Het antitumorpercentage van de positieve controlegroep was 36,5%; die van de hooggedoseerde BF-groep was 27,6%; en die van de BF/PEG-LP-groepen met een lage, gemiddelde en hoge dosis was respectievelijk 11,4%, 28,9% en 38,7%. Behalve voor de laaggedoseerde BF-groep, was er een significant verschil tussen de antitumorpercentages van de met geneesmiddel behandelde groepen en de negatieve controlegroep (P < 0.05), zoals weergegeven in Fig. 4a. Vergeleken met die van de laaggedoseerde BF-groep was de tumorremmingssnelheid van de hooggedoseerde BF/PEG-LP-groep significant hoger (P < 0.01), zoals weergegeven in Afb. 4b.

Remmend effect van BF en BF/PEG-LP op de groei van glioma-xenotransplantaten in naakte muizen. Vergelijking van het tumorgewicht (a ) en tumorremmingspercentage (b ) in elke groep. Gegevens worden weergegeven als \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0.05, **P < 0.01 vs. controlegroep; ^# P < 0.05, ^## P < 0.01 vs. hooggedoseerde BF/PEG-LP-groep. c H &E-kleuring van tumorweefsels van tumordragende muizen. Afkortingen:BF, bufalin; BF/PEG-LP, met bufaline geladen PEGylated liposomen; DPP, cisplatine; H&E, hematoxyline en eosine

De xenotransplantaten in de tumordragende muizen waren nodulair van vorm. H &E-kleuring toonde aan dat in de controlegroep de kernen van de tumorcellen groot waren, het cytoplasma klein en de groei van cellen krachtig; in de hooggedoseerde BF/PEG-LP-groep werd een groot gebied van necrotisch tumorweefsel waargenomen en de mate van necrose was dosisafhankelijk, zoals weergegeven in figuur 4c.

Acute toxiciteit

De acute toxiciteit van een enkele i.v. dosis van de formuleringen in Kunming-muizen werd bepaald. De LD₅₀ waarden van BF en BF/PEG-LP waren respectievelijk 0,156 en 3,03 mg/kg. Vergeleken met die van BF was de acute toxiciteit van BF/PEG-LP significant lager (P < 0,01); dit effect werd toegeschreven aan de liposomale formulering, die de afgifte van BF in het bloed regelde.

De pathologische veranderingen bij de muizen na i.v. toediening werden waargenomen door optische microscopie (Fig. 5). Pathologische veranderingen werden waargenomen in verschillende organen, zoals het hart, de lever en de nieren. Ontbinding van de hartspiervezels en breuk met bloeding waren duidelijk. Necrose werd waargenomen in hepatocyten en pulmonale endotheliocyten.

Pathologische veranderingen waargenomen bij dode muizen na intraveneuze toediening van 1,0 mg/kg BF en 4,0 mg/kg BF/PEG-LP. Weefselcoupes werden gekleurd met H&E en waargenomen met optische microscopie. Opmerkingen:Optische microscoop:NIKON Eclipse ci; Beeldvormingssysteem:NIKON Digital Sight DS-FI2 (Tokyo, Japan); Vergroting:×200. Afkortingen:BF, bufalin; BF/PEG-LP, met bufaline geladen PEGylated liposomen; H&E, hematoxyline en eosine

Weefselverdelingsonderzoek

Vergelijking van de chromatogrammen van het blanco weefselhomogenaat en spiked homogenaat, wat aangaf dat er geen significante interferentie was bij de retentietijden van BF en CBG (IS), werd gebruikt om de selectiviteit van de methode te bepalen, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1:Figuur S2. Kalibratiecurven werden geconstrueerd uit de piek-oppervlakverhoudingen van BF tot IS (Y) versus weefselhomogenaatconcentraties variërend van 20 tot 2000 ng/ml, met een correlatiecoëfficiënt R ² > 0,9977 (tabel 2). De precisie-, nauwkeurigheids- en herstelexperimenten van BF in biologische monsters werden getoond in aanvullend bestand 1:tabel S1, terwijl de resultaten van het stabiliteitsexperiment werden getoond in aanvullend bestand 1:tabel S2.

De onbewerkte gegevens van de weefseldistributie-experimenten worden weergegeven in aanvullend bestand 1:tabel S3. Na i.v. injectie van BF/PEG-LP, wordt de weefselverdeling daarvan beïnvloed door verschillende variabelen, zoals samenstelling, deeltjesgrootte en zeta-potentiaal [19]. De concentratie van BF in verschillende weefsels, waaronder het hart, de lever, de milt, de longen, de nieren en de hersenen, werd gekwantificeerd op 5, 15, 45 en 90 min, zoals weergegeven in Fig. 6. Na 45 min na iv. toediening was de concentratie van BF in beide groepen erg laag in sommige weefsels, zoals het hart, de lever, de milt, de long en de nier, wat erop wijst dat de distributie en eliminatie van BF snel plaatsvond. De concentratie van BF in de hersenen, hoewel niet in andere weefsels, kon 90 min na i.v nog steeds worden gedetecteerd. toediening in beide groepen, wat aangeeft dat de distributie en eliminatie van BF relatief langzamer waren in de hersenen dan in andere weefsels.

Weefselverdeling van BF in rattenorganen. A Molecuulformules van bufaline (a ) en cinobufagine (b , IS). B Weefselverdelingsprofielen van BF bij ratten na een enkele intraveneuze dosis BF/PEG-LP of BF bij 0,5 mg/kg. Gegevens worden weergegeven als \( \overline{x} \) ± s (n = 6). Afkortingen:BF, bufalin; BF/PEG-LP, met bufaline geladen PEGylated liposomen; IS, interne standaard

Ondertussen werd in de hersenweefsels van de BF/PEG-LP-groep een 1,20-voudig hogere BF (333 ± 92,5 ng/g bij 5 min) gedetecteerd in vergelijking met die in de BF-groep. Bovendien werd in de BF/PEG-LP-groep een hogere concentratie BF gevonden in de lever, milt en hersenweefsels. Significante accumulatie van BF werd gedetecteerd in de lever, met concentraties van 187 ± 31,0 ng/g in de BF/PEG-LP-groep en 163 ± 35,0 ng/g in de BF-groep (P < 0.01). Een soortgelijk fenomeen, dat voornamelijk wordt veroorzaakt door een dramatische toename van BF in het bloed vóór metabolisme en uitscheiding, werd waargenomen in eerdere onderzoeken [20, 21].

Volgens de resultaten van de weefseldistributie-experimenten zou BF zelf de BBB kunnen passeren, mogelijk vanwege de hoge oplosbaarheid van lipiden, het lage molecuulgewicht (386,52 g/mol) en de chemische structuur, die vergelijkbaar is met die van cholesterol, waarmee het deelt dezelfde kernstructuur van de moeder. De klinische toepassing van BF is echter beperkt vanwege de hoge oplosbaarheid in lipiden en de slechte oplosbaarheid in water. De biologische beschikbaarheid van BF is laag als het niet in een alternatieve vorm wordt toegediend. In een eerdere studie [6] hebben we aangetoond dat de BF/PEG-LP-formulering de oplosbaarheid in water kan verbeteren, de bloedcirculatieduur kan verlengen, de halfwaardetijd kan verlengen en het toepassingsgebied van BF kan uitbreiden, ook voor i.v. chemotherapie. In de huidige studie resulteerde toediening van BF/PEG-LP in een verhoogde concentratie van BF in de hersenen, die langer aanhield (90 min). Bovendien was er een significant verschil in BF-concentratie tussen de BF- en BF/PEG-LP-groepen bij 45 min (167,59 ± 54,52 vs. 71.52 ± 48.35 ng/g, P < 0.01).

In een eerdere studie werd aangetoond dat BF een digitalis-achtig effect op het hart uitoefent, waardoor de hartslag en de contractieve kracht van het myocard bij ratten toenemen [22]. Daarom kan de cardiotoxiciteit van BF bij hoge doses worden veroorzaakt door de accumulatie ervan in het hart. Het biodistributie-experiment in deze studie toonde aan dat de accumulatie van BF in het hart lager was in de BF/PEG-LP-groep dan in de BF-groep (95,0 ± 18,5 vs . 134 ± 17.8 ng/g at 5 min, P  < 0.01; 15.32 ± 5.56 vs. 63.79 ± 28.21 ng/g at 15 min, P < 0.01). Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.