Draagbaar Plasmonisch Thermisch Apparaat voor Accurate Kwantificering van Laterale Stroomassays

Samenvatting

Point-of-care testing (POCT) wordt breed gebruikt voor vroege diagnose en monitoring van ziekten. Laterale stroomassay (LFA) is een succesvol commercieel hulpmiddel voor POCT. Echter, LFA lijdt vaak aan een gebrek aan kwantificering en analytische gevoeligheid. Om deze nadelen op te lossen, hebben we eerder een thermische LFA ontwikkeld met plasmonische goudnanopartikelen voor thermische contrast in een draagbaar apparaat. Hoewel deze methodologie de analytische gevoeligheid aanzienlijk verbetert vergeleken met conventionele visuele detectie, blijven kwantificeringsproblemen bestaan. In deze studie optimaliseerden we de werkomstandigheden voor het apparaat met behulp van geleiding en straling thermische sensing modi waardoor kwantificering van LFA mogelijk werd. De detectielimiet van de strips die slechts nanopartikelen bevatten, werd met 5-voud (geleidingsmodus) en 12-voud (stralingmodus) verlaagd vergeleken met traditionele visuele detectie. Het effect van de omgevingstemperatuur werd bestudeerd voor beide detectiemethoden, wat uitwees dat de stralingmodus meer beïnvloed werd door de omgevingstemperatuur dan de geleidingsmodus. Om de thermische sensing-methode te valideren, werd humaan choriaal gonadotropine (HCG) biomarker gekwantificeerd met onze LFA-strips, met een detectielimiet van 2,8 mIU/mL bij gebruik van de stralingsdetectiemethode.

Inleiding

Vroege detectie en snelle diagnose zijn belangrijk voor ziekte-screening en behandeling. De meeste medische tests zijn tijdrovend en vereisen ingewikkelde voorbereiding van klinische monsters, grote instrumenten en goed opgeleide laboratoriumprofessionals. Die eisen hebben de medische behandeling in resource-beperkte gebieden sterk belemmerd. Point-of-care testing (POCT) gebruikt eenvoudige apparatuur en minimaliseert de tijd die nodig is om klinisch relevante resultaten te verkrijgen, waardoor artsen en patiënten snel beslissingen kunnen nemen. POCT heeft duidelijke voordelen, zoals korte detectietijd, snelle monsterverwerking, eenvoudige instrumentatie en lage operationele eisen. Dus kan de opkomst van POCT helpen bij vroege en snelle diagnose van ziekten, met name in resource-beperkte gebieden, waardoor de medische voorwaarden verbeteren. Echter, lage analytische gevoeligheid, ingewikkelde operationele procedures en hoge apparatuurkosten belemmeren meestal de toepassing van deze techniek. Daarom is verder werk dringend nodig om POCT-toepassingen te vinden met de meeste ideale kenmerken, terwijl de nadelen worden geminimaliseerd.

Om enkele van die problemen op te lossen, is laterale stroomassay (LFA) een heel goede kandidaat als testhulpmiddel in POCT. LFA is een papier-gebaseerde, point-of-care strip biosensor die gebruikt wordt om doelanalyten in een gegeven monster te identificeren. LFA wordt uitgevoerd in een papier-gebaseerde strip, die bestaat uit een monsterpad, conjugaatpad, absorptiepad en een nitrocellulose-membraan waar de detectie plaatsvindt. Onder de voordelen van LFA is het de moeite waard om de rapiditeit en eén-stap assay, kosteneffectiviteit, eenvoudige bediening, klein monstervolume en lange houdbaarheid onder verschillende omgevingscondities te noemen. Conventionele LFA levert "ja of nee" resultaten door inspectie van kleurveranderingen op de testlijn met het blote oog, de populairste detectiemethode voor dit type assays. Dus neigt dit type benadering te lijden aan gebrek aan nauwkeurigheid en subjectieve oordelen. Niettemin, aangezien het eenvoudig is om LFA te integreren met elektronische apparaten, is een haalbare detectiebenadering het ontwikkelen van strip-readers om nauwkeurige kwantitatieve resultaten te verkrijgen. Charge-coupled devices (CCD) of complementaire metaal-oxide-halfgeleider (CMOS) sensoren worden meestal toegepast om beelden op te nemen in strip-readers. Beeldverwerkingssoftware wordt vaak gebruikt om kwantitatieve resultaten te bereiken. In deze optische readers wordt de optische informatie verkregen uit reflectie, transmissie of verstrooiing van het licht van een externe bron opgetekend om kwantificering toe te staan. In colorimetrische readers wordt de kleurintensiteit, zoals grijze waarde of RGB-coördinaten, verzameld van de test- en controllijnen om de LFA-strips te analyseren. Een nadeel van deze benadering is dat de kleurstof zijn kleur kan verliezen door fotodesctructie, mechanische middelen of andere degradatieprocessen, wat resulteert in slechte herhaalbaarheid en nauwkeurigheid. In die systemen die resorten tot fluorescentie-readers, worden de organische fluoroforen blootgesteld aan een specifieke excitatiegolflengte die de emissie van de fluorofore in de strips op een langere golflengte induceert. Dit uitgezonden licht wordt dan verzameld om een kwantitatieve detectie te krijgen. Het probleem dat niet genegeerd kan worden is dat de organische fluoroforen die meestal in deze toepassingen gebruikt worden, lijden onder photobleaching en chemische degradatie, wat een verzwakking van het signaal over tijd veroorzaakt, wat specifieke afhandeling en speciale opslag vereist.

Recentelijk wordt thermische sensing geleidelijk toegepast op LFA-detectie. Thermische sensing bestaat in het gebruik van een warmtetransducer waarbij de gegenereerde warmte toeneemt in de aanwezigheid van het analiet, waardoor dit thermische signaal kan worden gedetecteerd door genoemde transducer. Polo et al. verkenden het concept van sensing gedreven door plasmonische verhitting door detectie van kankerbiomarker carcino-embryonaal antigeen (CEA) met behulp van een nabij-infrarood (NIR) lichtbron om warmteopwekking te induceren met behulp van de plasmonische eigenschappen van anisotrope goudnanopartikelen. Qin et al. stelden een methode voor met behulp van thermisch contrast om LFA te kwantificeren met een groene laser als lichtbron, wat een 32-voudige verbetering in analytische gevoeligheid toonde. In 2016 werd een vergelijkbare thermische contrast reader ontwikkeld door Wang die de analytische gevoeligheid in LFA-kwantificering 8-voudig verbeterde. De lichtbron die gebruikt wordt om de warmteopwekking door de transducer te induceren, kan afgestemd worden op specifieke golflengtes om te voorkomen dat het beïnvloed wordt door de aanwezigheid van andere moleculen die niet absorberen op die golflengtes, wat detectiespecificiteit waarborgt. Het gebruik van lichtbronnen in het NIR-gebied van het elektromagnetische spectrum stelt in staat om absorptie van het licht door de meerderheid van moleculen van biologische oorsprong, met name bloed, te voorkomen. Deze voordelen tonen aan dat plasmonische thermische sensing met NIR-lichtbron een veelbelovende LFA-detectiemethode is. Echter, in eerdere onderzoeken werd geen POCT-apparaat ontwikkeld dat LFA-strips samen met een NIR-lichtbron gebruikte.

Hierbij hebben we een draagbaar apparaat gebaseerd op plasmonische thermische sensing ontwikkeld dat de analytische gevoeligheid in LFA verbetert zonder extra modificatie van de strips. Het signaal werd geamplificeerd door de plasmon-resonantie volledig te benutten bij NIR-laserbestraaling. De lasergolflengte in het prototype ligt binnen de gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) piek van de nanopartikelen (die fungeren als licht-naar-warmte transducers in onze instelling), wat warmte op de testlijn genereert. Vervolgens wordt de warmteopwekking gedetecteerd door een thermische sensor in het apparaat die de warmte meet die gegenereerd wordt door infraroodemissie (straling) of door warmteleiding. De hoeveelheid gegenereerde warmte is evenredig met het aantal nanopartikelen op de testlijn en de bestralingsvermogen. Geen additionele operatie is nodig.

Warmteoverdracht heeft drie hoofdformen: geleiding, convectie en straling. Om de detectieprestaties van verschillende warmteoverdrachtsvormen te bestuderen, testten we de geleidingsmodus (contact) en stralingmodus (niet-contact) door twee soorten sensoren. Het hele prototype is compact en gebruikt embedded-systeemtechnologie en surface-mounted componenten. De hoofdfactoren die de detectiemogelijkheid beïnvloeden, werden onderzocht om de werkomstandigheden te optimaliseren. Om de detectiemogelijkheid van het draagbare apparaat te valideren, werden de LFA-strips die direct met nanopartikelen op het membraan geladen waren, gekwantificeerd en vergeleken met conventionele visuele detectie. Aangezien onze detectiemethode temperatuurafhankelijk is, werd het effect van de omgevingstemperatuur op thermische signaaldetectie ook bestudeerd en een calibratiekromme verkregen voor de geleidingsmodus. Ten slotte werden humaan choriaal gonadotropine (HCG) biomarkers gekwantificeerd als model om de detectiemogelijkheden van thermische sensing te verifiëren.

Materialen en Methoden

Materialen en Reagentia

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) werd gekocht van Lonza®. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) en heterobifunctioneel polyethyleenglycol (HS-PEG-COOH, MW = 5000 g/mol (5 kDa)) werden gekocht van SIGMA®. Tween 20, Triton X100, bovine serum albumine (BSA), trehalose, poly-vinyl-pyrrolidone (PVP), N-hydroxysulfosuccinimide (S-NHS), natriumhydroxide, natriumchloride, goud(III)chloride hydraat, en HCG-hormoon werden gekocht van Aladdin®. Saccharose, natriumtetraboraat decahydraat, boorzuur, kaliumjodide en natriumthiosulfaat pentahydraat werden gekocht van Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Natriumborohydride werd gekocht van Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. Anti-αHCG, anti-βHCG en anti-muis secundaire antistoffen, nitrocellulose-membraan (NC-a110), monsterpad (glasvezel BX108), conjugatiepad (glasvezel BX101) en polyvinylchloride (PVC) oppervlakken werden gekocht van JieyYiBiotech™. 4-Morpholineethaanzuur (MES) werd gekocht van Shanghai Majorbio. Zuivere ethanol werd gekocht van Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.

Synthetise van Nanopartikelen (Goud Nanoprismen, AuNPrs)

De nanopartikelen die in deze studie gebruikt werden, werden verkregen met een variatie van ons eerdere gerapporteerde protocol dat later verbeterd werd. Kortom, een volume van 220 mL van 0,5 mM Na₂S₂O₃ werd aangevuld met 20 μL van 0,1 M KI. Daarna werd 110 mL van de bovengenoemde oplossing geleidelijk toegevoegd aan een oplossing die 2 mM HAuCl₄ bevatte over de loop van 30 s en geïncubeerd bij kamertemperatuur tot een totale tijd van 4 min, moment waarop de oplossing aangevuld werd met 110 mL van de overgebleven Na₂S₂O₃+KI oplossing over de loop van 30 s en geïncubeerd voor nog eens 4 min. Ten slotte werd 100 mL Na₂S₂O₃ zonder KI toegevoegd aan de resulterende oplossing en geïncubeerd gedurende 60 min bij kamertemperatuur om de uiteindelijke prisma-vormige nanopartikelen te verkrijgen. Alle incubatiestappen die eerder beschreven werden, werden uitgevoerd zonder te schudden. Na de synthetise werden de nanopartikelen gestabiliseerd met PEG (PEGylatie). De hoeveelheid PEG die aan de nanopartikelen werd toegevoegd, werd bereid in een 1:2 verhouding (NPs tot PEG) van het totale gewicht van goud dat in de synthetise gebruikt werd. PEG werd gedilueerd in 1 mL Milli-Q water, en een bepaald volume NaBH₄ werd dan toegevoegd om een 1:1 molaire verhouding van PEG tot NaBH₄ te bereiken. Het gehele volume van de PEG tot NaBH₄ oplossing werd volledig toegevoegd aan de AuNPrs en aangepast tot pH 12 met 2 M NaOH onder zachte menging. Ten slotte werd de oplossing 60 min gesonicateerd bij 60 °C en daarna 15 min gecentrifugeerd bij 4400 G bij kamertemperatuur om de AuNPrs van overbodige PEG en ongereageerde materialen te scheiden. Pellets werden heropgelost in Milli-Q water en driemaal gecentrifugeerd gedurende 9 min bij 4400 G bij kamertemperatuur. Deze finale monsters werden gedilueerd tot een kwart van hun oorspronkelijke volume om ze te laten decanteren bij kamertemperatuur gedurende diverse weken. Na deze tijd kon de bovenste laag van de oplossing (bevattende een grote fractie van kleinere, lichtere nanometrische goud-bijproducten) verwijderd worden van de AuNPrs die op de bodem neerslaan. De concentratie nanopartikelen werd verkregen door hun absorbantie (OD) te meten bij 400 nm door UV-Vis-spectroscopie en een conversiefactor (ε) van 11,3 mL mg⁻¹ cm⁻¹ toe te passen. Deze waarde werd experimenteel verkregen door de goudconcentratie verkregen door ICP te correleren met de OD bij 400 nm door UV-Vis van de eindproducten van de synthetise.

Conjugatie van Nanopartikelen met Anti-HCG Antistof

Kortom, 3 mL van een oplossing die 0,5 mg/mL PEGyleerde nanopartikelen bevatte, werd driemaal gewassen met 0,1 M MES-buffer pH 5,5 door centrifugatie gedurende 9 min bij 6000 rpm in een mini-spin microfuge bij kamertemperatuur. De uiteindelijke gewassen nanopartikelen werden heropgelost in 1 mL eindvolume van dezelfde buffer (0,1 M MES-buffer pH 5,5), en 4 mg EDC en S-NHS werden aan de oplossing toegevoegd. De monsters werden vervolgens 20 min geïncubeerd onder zachte menging, 9 min gecentrifugeerd bij 6000 rpm, en gewassen met MES-buffer. Daarna werd 20 μL antistofvoorraad (200 μg) aan het monster toegevoegd en 3 uur geïncubeerd bij 37 °C gevolgd door een tweede incubatie overnachts bij 4 °C (geen schudden). De volgende dag werden de geconjugeerde nanopartikels gecentrifugeerd (9 min bij 6000 rpm) en tweemaal gewassen met borate-buffer 5 mM pH 9. Daarna werd 25 mg BSA aan de oplossing toegevoegd. Na 1 uur incubatie bij kamertemperatuur onder zachte schudden, werd het monster gewassen (9 min bij 6000 rpm) met borate-buffer aangevuld met Tween 20 (5 mM pH 9) en ten slotte opgeslagen bij 4 °C tot verder gebruik voor niet langer dan 4–5 dagen.

Na de preparatie van de nanopartikelen werd de assemblage van de teststrips uitgevoerd (beschreven in ESI).

Laden van Nanopartikelen op het Membraan van de Strips

Om de nanopartikelen op het membraan van de strips te laden, werd de concentratie van de oorspronkelijke voorraad van PEGyleerde nanopartikelen (zonder antistof) verkregen en een reeks verdunningen uitgevoerd in Milli-Q water, resulterend in een reeks concentraties van 0 (zuiver Milli-Q water zonder nanopartikelen) tot 10 OD/mL voor de maximale concentratie, wat overeenkomt met 0,9 mg/mL volgens de conversiefactor die eerder gekarakteriseerd was door ICP-AES. Voor de eenvoud en extrapolatie werden de OD-waarden vorgezogen boven gewichtsconcentratie. Dus, 2 μL van elk van de bovengenoemde verdunningen werd met een micropipet direct op het nitrocellulose-membraan van de strips toegevoegd en gelaten drogen bij kamertemperatuur over ~2 uur. De gedroogde strips werden bij kamertemperatuur opgeslagen vóór de bestralingstesten.

Voor de detectie van het HCG-antigen in de strips, werd een reeks verdunningen van het analiet (HCG) uitgevoerd in PBS. Elke strip werd gedraaid door 5 μL AuNPr geconjugeerd met anti-HCG-antistof in het conjugaatpad te laden, en 50 μL van de vereiste verdunning die HCG bevatte. De strips werden op een vergelijkbare manier gedroogd als voor de vorige test.

Ontwikkeling van het Draagbare Apparaat

Het draagbare apparaat werd gemonteerd met behulp van embedded-systeemtechnologie en surface-mounted componenten, aangezien ze van kleine afmetingen en kosteneffectief zijn. De samenstelling van het prototype wordt getoond in Fig. 1b. De moederplaat is de kernmodule van het apparaat, de functie ervan is om de gegevens te verwerken en de rest van de componenten te controleren. Deze module bestaat voornamelijk uit de MCU STM32F407, die een groot geheugen en laag-energiebedrijf kent. Een spanningconversieschakeling werd op de moederplaat ontworpen om de juiste spanningsvoorziening voor elke module in het apparaat te bieden.

Vijf interfaces werden op de moederplaat toegepast voor de verbinding met andere modules. De temperatuursensor was verbonden met de moederplaat via een IIC-interface om de temperatuursignalen die door de sensor worden overgedragen te ontvangen. Voor nauwkeurige temperatuurmeting kozen we temperatuursensoren met een digitale uitgang. De sensor voor geleidingsmodus was een halfgeleidersensor (ADT7420, Analog Devices) met een 16-bit temperatuursresolutie (0,0078 °C) en laag energieverbruik (700 μW). In stralingmodus maakten we gebruik van een infraroodthermometer (MLX90614, Melexis) met een 17-bit temperatuursresolutie en 3,9 mW energieverbruik. De interface tussen de lasercontrolmodule en de moederplaat bestond uit een relaiscontrolschakeling om nauwkeurig beheer van de laserdiode te waarborgen terwijl de moederplaat beschermd wordt tegen hoge stroom. De lasermodule bestond uit drie componenten: (1) de lasercontrolcomponent, (2) een laserdiode (Thorlabs, M9-A64-0200) die een lichtbron met een golflengte van 1064 nm en een optische maximaal vermogen van 200 mW leverde, en (3) een asferische lens (Thorlabs, 354330-C) gemonteerd in de lasermodule om het door de laserdiode uitgezonden licht te bundelen in een 1 mm × 2,5 mm gebied. Deze componenten maakten het mogelijk om de testlijn op de strip nauwkeurig te verlichten. Een LCD-touchscreen (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 pixel) werd gebruikt om een grafische gebruikersinterface te bieden. Interface 4 van het bord was gereserveerd voor programma-download en debug. Een USB-interface werd in het apparaat gemonteerd, die fungeerde als een oplaadpoort voor de batterij en een communicatiepoort tussen het apparaat en een optionele externe computer. Het prototype werd aangedreven door een 10.000 mAh lithiumbatterij. Programma's in de MCU werden gecompileerd door IAR-software (versie 7.50.2.10505). De grafische gebruikersinterface werd ontworpen met behulp van de USART HMI-software.

Ontwerp van de Prototype Behuizing en Teststrip Cartridge

Om te waarborgen dat het apparaat gebruiksvriendelijk en draagbaar is, werden een 3D-geprinte behuizing en een cartridge ontworpen, wat de anti-interferentiecapaciteit en stabiliteit van het apparaat verbeterde. Witgekleurd hars werd gebruikt als materiaal voor zowel de behuizing als de cartridge. Solidworks 2018-software werd gebruikt voor het ontwerp.

Een vormblok behuizing en een rechthoekige bodemplaat werden voor het apparaat ontworpen volgens de vorm van de interne componenten. De vormblok-behuizing bood een vaste montagepositie voor het LCD-scherm en de laserdiode-controlmodule. Een rechthoekige sleuf aan de zijkant van de behuizing werd gebruikt voor het invoegen van de teststrip-cartridge. De bodemplaat was voorzien van een batterij- en moederplaat-montagebasis, waardoor de componenten aan de bodemplaat bevestigd konden worden zonder te verplaatsen. Alle detectieonderdelen waren vastgezet in de bodemplaat. Een steunframe voor zowel de sensor als de strip-cartridge werd in de bodemplaat geplaatst, wat ze in nauw contact bracht. Een fijn-afstelbaare bewegingsbaan werd voorzien voor de laserdiode en lens waardoor vaststellen en afstellen van de afstand mogelijk was. De grootte van de gehele behuizing was 133 mm × 108 mm × 73 mm.

Een speciale cartridge (15 mm × 4 mm × 70 mm) werd ontworpen voor de bescherming van teststrips. De cartridge had drie vensters, één voor het laden van het monster en twee meer voor de visualisatie van de testlijn en controllijn, respectievelijk. Het venster van de testlijn was iets kleiner ontworpen dan de breedte van de teststrip om te waarborgen dat de laser niet door de teststrip kan gaan en de detectie van de sensor beïnvloedt. Een achterste uitknipsel was op de achterkant van de cartridge aangebracht waardoor de geleidende sensor de achterkant van de strips in de positie van de testlijn volledig kan aanraken terwijl te waarborgen dat de stralingssensor de temperatuur goed kan detecteren.

Algoritme voor Thermische Sensing en Parameters Berekening

Omdat de laser de nanopartikelen verlichtte, werd warmte gegenereerd in de testlijn wat detecteerbare temperatuurveranderingen veroorzaakte. Deze warmteopwekking (Q, W/m³) hangt af van de concentratie nanopartikelen (C, OD/mL), het verlichtingsgebied (A, m²) en de laserintensiteit (I, W/m²), volgens de volgende formule:

Q = C I A

Het thermische signaal (temperatuur) werd verzameld toen de laser de strips verlichtte. Omdat het verlichtingsgebied en de laserintensiteit constant gehouden werden, verandert het thermische signaal met de hoeveelheid nanopartikelen die op de testlijn binden. Voor kwantificering van de warmteopwekking werden twee methoden vergeleken. De eerste gebruikte de temperatuurveranderingen om het thermische signaal te kwantificeren. De variatie van temperatuur (∆T) werd berekend voor de bepaling:

∆T = T_eind − T₀

waarbij T_eind de finale (maximale) temperatuur is bereikt aan het einde van de bestraling en T₀ de initiële omgevingstemperatuur is geregistreerd door de sensor vóór het begin van de bestraling. Een andere methode gebruikte de kwantitatieve berekening van de oppervlakte onder de kromme (AUC). Deze methode deelt de kromme in trapeziums volgens een bemonsteringsfrequentie van 10 Hz gevolgd door de berekening van de optelling van alle trapeziums. Het thermische signaal werd bereikt door de oppervlakte te delen door de detectietijd (t_det):

AUC = Σ (ΔT_i + ΔT_i-1) × 0,1 ÷ 2

T_auc = AUC ÷ t_det

Bij toepassing van beide methoden in de detectie, gaf de AUC-analyse een betere herhaalbaarheid van de kwantificering. Daarom werd de AUC-analyse geselecteerd voor haar gebruik in de finale warmtekwantificering.

Om de prestaties van de verschillende detectiemethoden te evalueren, beoordeelden we de LOD van de kwantificering. In elk experiment meetten we één concentratie voor vier monsters (vier strips, n = 4). Rekening houdend met de standaarddeviatie (σ₀) van de blanco-groep en de gevoeligheid (S) wat de helling is van de standaardkromme in lineair bereik, evalueerden we de LOD als:

LOD = 3σ₀ / s

Assay Procedure

De gehele assay-procedure bestond uit drie hoofdstappen: (1) gegevensverzameling, (2) detectie en resultaatverkrijging, en (3) resultaatweergave en opslag. Eerst werd de teststrip in de cartridge geladen en in het apparaat ingevoegd. De meting werd eenvoudig uitgevoerd door op de detectieknop te tikken en de patiëntgegevens in te typen (optioneel kan een anonieme code worden ingevoerd). De informatie werd overgedragen aan de microcontroller unit (MCU) en opgeslagen. Daarna activeerde de MCU de temperatuursensor en de laserdiode om de test te starten. Tegelijkertijd werd de temperatuurdata ontvangen door de MCU naar het LCD gestuurd voor realtime weergave en plotten. Na de detectie berekende de MCU de AUC-waarde en presenteerde het resultaat op het scherm.

Resultaten en Discussie

Karakterisatie van de Nanopartikelen

UV-Vis-spectra van geconjugeerde nanoprismen worden getoond in Fig. 2a, wat aangeeft dat de maximale piek bij 1130 nm ligt. De absorbantie van de AuNPr bij de lasergolflengte (1064 nm) is 92% van de maximale absorbantie bij 1130 nm. SEM- en TEM-afbeeldingen werden verzameld om de morfologie van de nanopartikelen te visualiseren, wat een meerderheid van driehoekige vormen bevestigde.

Optimalisatie van de Meetcondities in het Apparaat

In thermische sensing zijn de detectietijd en de afstand van de laserdiode tot de testlijn de hoofdfactoren die de signaalrespons beïnvloeden. De twee factoren werden bestudeerd om de meetcondities te optimaliseren. Voor de optimalisatie van de bestralingstijd, bestraalde we de strips gedurende 10 min en noteerden de temperatuurveranderingen door beide sensoren respectievelijk. Zoals te zien is in Fig. 3a, steeg de temperatuur gedurende 10 min voort, maar de temperatuurstijging begon een plateau te bereiken na 120 s. Dit resultaat komt overeen met eerdere onderzoeken waarin een vergelijkbare trend werd waargenomen in thermische signaalveranderingen met de tijd. Rekening houdend met de eisen van POCT en energieverbruik, werd de detectietijd van het apparaat ingesteld op 120 s.

De optimalisatie van de afstand werd vervolgens uitgevoerd. Figuur 3b toonde dat het thermische signaal afnam met de toename van de afstand tussen de laserdiode en de testlijn. De reden kan zijn dat het laservermogen dat de testlijn bereikte, verzwakte naarmate de afstand de effectieve bestraalde oppervlakte vergrootte. Om de maximale signaalrespons te verkrijgen, werd de afstand ingesteld op 7 mm.

Het Effect van Omgevingstemperatuur op Thermische Sensing

Aangezien thermische sensing nauw verbonden is met temperatuur, was het nodig te onderzoeken hoe de omgevingstemperatuur de thermische sensing beïnvloedt. De omgevingstemperatuur werd varieerd van 27,5 tot 40 °C met behulp van een broedkast. In totaal werden 4 monsters gemeten bij elk temperatuurpunt met een interval van 2,5 °C. De omgevingstemperatuur versus thermische signaal-krommen werden gemeten voor de blanco- en 1 OD/mL-strips respectievelijk door beide thermische sensing-methoden. De parameters van de aanpassingskromme van de omgevingstemperatuur worden getoond in Tabel 1. Figuur 4a toont dat in geleidingsmodus, de krommehellingen over het algemeen consistent waren voor verschillende concentraties, wat aangeeft dat veranderingen in omgevingstemperatuur hetzelfde effect hadden op verschillende concentraties. Als gevolg kan de omgevingseffectkromme gebruikt worden om kwantitatieve resultaten te kalibreren. In stralingmodus waren de hellingen van de krommen die overeenkomen met de twee concentraties consistent met elkaar, maar beide krommen toonden een dalende trend. De resultaten suggereren dat de geleidingsmodus betrouwbaarder is bij het meten van monsters onder condities met hoge temperatuurvariabiliteit.

Kwantificering van de Nanopartikelen

Thermische Sensing Detectie

Om de standaard kwantificeringskrommen te verkrijgen, werden de twee thermische sensing-methoden respectievelijk gebruikt om teststrips te detecteren die nanopartikelen bevatten in het bereik van 0 tot 10 OD/mL. Die strips die verschillende concentraties nanopartikelen bevatten, werden gedetecteerd door het draagbare apparaat. De instelling van beide sensoren in het apparaat wordt gepresenteerd. Vier monsters werden getest voor elke concentratie bij een omgevingstemperatuur van 27,5 °C. Het apparaat past de AUC-methode toe om het thermische signaal op de testlijn te berekenen. Daarom was de kwantificering van het thermische signaal evenredig met de hoeveelheid nanopartikelen op de testlijn. De kwantificeringskrommen werden gegenereerd door lineaire regressie van de gegevens verkregen van het thermische signaal tegen de concentratie van de nanopartikelen en worden vertegenwoordigd door de formules in Tabel 2.

Tabel 2 toont dat de gevoeligheid van de stralingmodus 15-voudig hoger was dan die van de geleidingsmodus. De LOD van geleidings- en stralingmodus waren respectievelijk 0,053 OD/mL en 0,023 OD/mL. In thermische sensing verbeterde de stralingmodus de detectielimiet (LOD) met 2-voud vergeleken met geleidingsmodus. De stabiliteit van LFA-strips werd ook getest. De geleidende thermische sensing-modus vereist de overdracht van warmte tussen twee vastestoffen. Wanneer de temperatuur van de testlijn snel steeg, duurt het even (relaxatietijd) voordat de sensor dezelfde temperatuur bereikt als de testlijn. Als resultaat was de temperatuur van de sensor lager dan de werkelijke temperatuur in de testlijn aan het einde van de detectie. Aan de andere kant, vereist de stralingmodus geen overdracht van warmte naar de sensor, aangezien de sensor direct de IR-golf die door de testlijn wordt uitgezonden detecteert om de huidige temperatuur te verkrijgen. In de geleidingsdetectiemodus werd een deel van de warmte gedissipeerd door de aanwezigheid van goede thermische geleiders die als heatsink werkten, terwijl in de stralingsdetectie alleen lucht en de strip zelf ingrepen in de warmtedissipatie. Deze redenen kunnen verklaren dat de gevoeligheid van de geleidingsmethode lager is dan de stralingsmethode.

Bij het testen van strips met een concentratie van 10 OD/mL, vonden we een brandmerk met de straling (niet-contact) sensing-modus. Een mogelijke reden voor dit fenomeen is dat in de niet-contactmeting, de lage thermische geleidbaarheid van de lucht de warmte in de testlijn laat behouden en minder efficiënt laat dissiperen, wat de effectieve lokale temperatuur verhoogt en uiteindelijk de verbranding van het membraan veroorzaakt.

In de contactmodus van detectie, fungeerde de sensor met een grote thermische geleidbaarheid als medium en heatsink. Op die manier werd warmte naar de sensor geleid zodat geen verbranding optrad in de testlijn.

Vergelijking tussen Thermische Sensing en Visuele Detectie

Vanwege de populariteit voor draagbare apparaten en wijd verspreid gebruik, vergeleken we de thermische sensing met visuele detectie voor de detectiemogelijkheid. Voor visuele detectie werden foto's van de strip gemaakt door een conventionele microscopische digitale camera. De teststrips werden in de cartridge gemonteerd om de positionele consistentie van de beeldanalyse te waarborgen op een vergelijkbare manier als met de thermische sensing. Software ImageJ werd gebruikt om de grijze waarde in de testlijn te analyseren voor verschillende concentraties nanopartikelen. Een standaardkromme van de visuele detectiemethode werd geplot op basis van de resultaten van deze analyse. Het lineaire bereik tussen de grijze waarde en de concentratie nanopartikelen was 0,2–10 OD/mL (R² was 0,770 voor het bereik 0–0,2 OD/mL, dus werden ze verwijderd uit verdere analyse). De detectielimiet was 0,268 OD/mL. De resultaten gaven aan dat thermische sensing de LOD met 5- tot 12-voud kon verminderen vergeleken met visuele detectie. In Qin's onderzoek vonden ze dat de LOD voor visuele analyse 100-voudig hoger was dan thermisch contrast. Omdat ze een hoog laservermogen en een infraroodcamera gebruikten, kregen ze een groter verschil in LOD. Een redelijke verklaring voor de LOD-verbetering is dat thermische sensing in staat is om de nanopartikelen boven en onder het membraanoppervlak te meten. Een ander voordeel van thermische sensing is dat het een hogere stabiliteit heeft dan visuele detectie. Thermische sensing genereert warmte door de nanopartikelen op de gehele testlijn. Visuele detectie vertrouwt alleen op de kleurreactie van de nanopartikelen op het oppervlak van de testlijn. Zelfs als de analietconcentraties van twee teststrips hetzelfde zijn, is de verdeling van de nanopartikelen op de T-lijn in het raakvlak anders; dus zal de visuele inspectie resulteren in een verschil in detectieresultaten terwijl thermische sensing stabieler en reproduceerbaarder is. Aan de andere kant was de gevoeligheid van de visuele detectie 2-voudig hoger dan thermische sensing. Visuele detectie is een directe methode voor het kwantificeren van nanopartikelen, terwijl thermische sensing een indirecte meting is van de concentratie nanopartikelen door temperatuurveranderingen te meten, wat de gebrekkige gevoeligheid deels kan verklaren. Figuur 5b toont dat het lineaire detectiebereik voor thermische sensing zo laag kan zijn als 0 OD/mL, met R² van 0,972 (geleiding) en 0,987 (straling), wat suggereert dat thermische sensing een beter potentieel heeft voor toepassingen in vroege detectie in POCT dan kleurkwantificering, aangezien de doelanalyten in lagere concentraties zijn.

Kwantitatieve Detectie van HCG

Ten slotte werd de biomarker HCG gekwantificeerd met ons systeem om de thermische sensing te valideren. Zowel geleidings- als stralingmodus werden toegepast om HCG te kwantificeren. Het optische vermogen werd verlaagd naar 150 mW om te voorkomen dat de strips verbranden. Strips met vier verschillende concentraties werden getest. Figuur 6a en b tonen dat de thermische signalen lineair waren ten opzichte van de concentratie HCG van 35 tot 700 mUI/mL. Toen de concentratie uitgebreid werd tot het bereik van 35–7000 mUI/mL, was de lineariteit tussen de logaritme van de concentratie en het thermische signaal. In geleidingsmodus was de LOD 64,2 mIU/mL wat in een vergelijkbaar bereik ligt als visuele detectie. Echter, de ideale LOD van de stralingmodus was 2,8 mIU/mL. De data matched met de kwantificering van nanopartikelen. Vergeleken met andere apparaten die fotothermisch effect toepassen (LOD = 5,5 mIU/mL), verminderde ons apparaat in stralingmodus de LOD met bijna 2-voud. Die resultaten bewijzen dat thermische sensing een effectieve manier is in LFA-detectie en kwantificering.

Conclusies

Een plasmonische thermische sensing-methode voor LFA-detectie werd gevestigd. Een draagbaar apparaat gebaseerd op deze methode werd ontwikkeld door toepassing van verschillende temperatuursensoren (geleiding en straling modi). De studie van de invloed van de omgevingstemperatuur toonde aan dat het een negatieve impact heeft op de thermische sensing en geleidingsmodus minder beïnvloed was dan stralingmodus. In stralingmodus was de impact significanter bij hoge concentraties. Beide modi werden ook getest om de kwantificatiemogelijkheid te vergelijken. Vergeleken met de traditionele visuele detectie, toonden de thermische sensing-methoden een 5- tot 12-voudige verbetering in LOD voor nanopartikelskwantificering. De stralingmodus toonde een betere prestatie dan geleidingsmodus in zowel gevoeligheid als LOD. In de validatie van thermische sensing, werden LFA-strips voor de detectie van HCG getest en de resultaten toonden aan dat de stralingmodus veel gevoeliger was dan de geleidingsmodus. Op die manier bewijzen we dat thermische sensing een haalbare en effectieve manier is voor vroege detectie in LFA-platforms.

Concluderend, kan plasmonische thermische sensing de analytische gevoeligheid daadwerkelijk verbeteren en toont een veelbelovende toekomst in LFA-detectie voor vroege diagnostische toepassingen. Het hierin beschreven draagbare apparaat bood twee sensing-benaderingen om verschillende eisen te voldoen.