Gouden nanodeeltjes met chitosan, N-geacyleerd chitosan en chitosan-oligosacharide als DNA-dragers

Methoden

Nanocomposietsynthese

Elk experiment werd uitgevoerd met gouden nanodeeltjes met gemodificeerd en ongemodificeerd chitosan; er werden twee belangrijke synthesemethoden gebruikt:een daarvan omvatte chemische synthese voor gouden nanodeeltjes met chitosan in zijn eenvoudige vorm (CO-AuNP's) en hydrofoob gemodificeerde chitosan met acylgroepen (Acyl-CO-AuNP's) en de andere een groene/een- potsynthese met behulp van chitosan met korte keten (chitosan-oligosaccharide, COS@n-AuNPs). Figuur 2 toont een schematisch diagram voor elke synthese; de bijbehorende experimentele procedures worden hieronder beschreven.

Schematisch diagram voor elke synthese:a –b chemische synthese voor gouden nanodeeltjes met chitosan in zijn eenvoudige vorm (CO-AuNP's) en met hydrofoob gemodificeerde acylgroepen (Acyl-CO-AuNP's) en c –f groene/eenpotssynthese voor chitosan met korte keten (chitosan-oligosacharide, COS@n-AuNPs)

Materialen

Goud(III)chloridetrihydraat (HAuCl₄ ∙3H₂ O), natriumboorhydride (NaBH₄ ), chitosan met laag molecuulgewicht (50-190 kDa, 75% deacetyleringsgraad) en chitosan-oligosaccharide (laag molecuulgewicht, 5 kDa) werden verkregen van Sigma Aldrich. Al het glaswerk werd gewassen en in een bad van vers bereide aqua regia gelaten (HCl:HNO₃ , 3:1 v /v ) gedurende 24 uur en voor gebruik grondig gespoeld met Mili-Q-water om alle sporen van metaal te verwijderen [39].

Chitosan-gouden nanodeeltjes (CO-AuNP's)

De synthese van chitosan-goud nanodeeltjes werd uitgevoerd door Huang et. al. [9]'s methodologie. Hiervoor werd 20 mg chitosanoplossing met laag molecuulgewicht (2 mg / ml) toegevoegd aan 10  ml 1% azijnzuur en gemengd met vortex tot volledige oplossing en een nacht bewaard. Twee milliliter van de verkregen oplossing werd gefiltreerd met behulp van een 0,22  μm polyethersulfon-spuitfilter en vervolgens gemengd met 1 ml 10  mM HAuCl₄ ∙3H₂ O-oplossing met behulp van sterk roeren gedurende 30 min. 0,4 ml vers bereide 100  mM NaBH₄ koude oplossing werd gebruikt als reductiemiddel; het werd toegevoegd door druppelen onder roeren, en een snelle kleurverandering van geel naar wijnrood werd waargenomen; daarna bleef het roeren gedurende een totale tijd van 2  uur doorgaan (Fig. 2a).

Geacyleerde chitosan-gouden nanodeeltjes (Acyl-CO-AuNP's)

Caproylchloride (C₆ H₁₁ ClO, Sigma Aldrich) werd gebruikt voor de synthese van geacyleerde nanodeeltjes van chitosan-goud.

Geleren

Acylering van chitosan (laag molecuulgewicht) werd uitgevoerd door de methode te volgen die is gerapporteerd door Remant Bahadur et al. [6] met kleine aanpassingen. Hiervoor werd 0,83 g chitosan toegevoegd aan 100  ml 1% azijnzuuroplossing onder magnetisch roeren dat 24 u aanhield. Vijf milliliter van deze oplossing werd gefiltreerd met een 0,22-μm polyethersulfon-spuitfilter en vervolgens werd de pH ingesteld op 7,2 met een 0,1-M natriumhydroxide (NaOH)-oplossing die langzaam onder krachtig roeren werd toegevoegd. Eén milliliter caproylchloride werd toegevoegd aan 5 ml van deze laatste oplossing en het resulterende mengsel werd 5 uur geroerd. De pH van het mengsel werd ingesteld op 6,8-7 met een hydroxide-oplossing. De verkregen gel werd geprecipiteerd met aceton en gecentrifugeerd bij 5000 rpm gedurende 20 min bij 4 °C. Overtollig capronzuur werd verwijderd door drie keer te wassen met methanol (50-60 ° C) en te decanteren, en het gedurende 3 dagen op het fornuis te laten drogen. Deze gel werd gebruikt voor de synthese van nanocomposiet.

Nanocomposieten

Een milliliter van een 10 mM HAuCl₄ ∙3H₂ O-oplossing werd toegevoegd aan 2 ml gel verdund tot 0,33 % in een 0,1 M HCl-oplossing, onder roeren gedurende 1 uur. Voeg hier ten slotte de laatste 0,4  ml van een 0,1-M NaBH₄ . aan toe vers bereide koude oplossing onder roeren, vorming van gouden nanodeeltjes was duidelijk met de roze / rode kleur die veranderde voordat 2  uur continu roeren was voltooid (Fig. 2b).

Chitosan-oligosacharide-gouden nanodeeltjes (COS@n-AuNPs)

COS@n-AuNP's werden bereid door een gewijzigde methodologie te volgen die is gerapporteerd door Manivasagan et al. [20]. Chitosan-oligosacharide (COS) werd toegevoegd aan 10 ml HAuCl₄ ∙3H₂ O-oplossing en 60 min bij 80 ° C geroerd. Er werden vier syntheses uitgevoerd door de hoeveelheid COS (100 en 200 mg) en de goudconcentratie in de HAuCl₄ te variëren ∙3H₂ O-oplossing (0,003 en 0,017 wt%). Tabel 1 toont de parameters die worden gebruikt in de AuNP-synthese voor elk experiment. De vorming van gouden nanodeeltjes was duidelijk met de wijnrode / roze-rode kleurwisseling, waarbij de kleurverandering op verschillende tijdstippen in elk geval werd geregistreerd, afhankelijk van de hoeveelheid reductiemiddel en goudvoorloper. De verkregen nanocomposieten werden gezuiverd door te centrifugeren bij 12.000g gedurende 30 min (Fig. 2c–f).

Nanocomposietkarakterisering

Infraroodspectroscopie

Chitosan gebruikt voor CO-AuNP's, geacyleerde chitosan voor Acyl-CO-AuNP's en chitosan-oligosaccharide voor reeksen COS@n-AuNP's werden gekarakteriseerd door FTIR-spectrometrie (Spectrum One, Perkin Elmer) om de acylering van Acyl-CO-polymeer te bevestigen door de intensiteit van karakteristieke banden van functionele groepen tussen monsters. Substitutiegraad (SD) werd geschat op basis van IR-spectra-informatie, volgens Remant Bahadur et. al. [6].

ξ-Potential

Zetasizer (Nano Z, Malvern) werd gebruikt om het composietoppervlaktepotentieel te evalueren. Positief potentieel wordt verwacht voor nanocomposieten voor succesvolle hechting aan DNA om complexen te vormen. ξ- Het potentieel werd voor en na complexvorming geëvalueerd om veranderingen na DNA-adhesie te bevestigen. 1,5  ml geschikte verdunde monsters werden gebruikt voor oppervlaktepotentiaalmetingen, met behulp van een capillaire cel (DTS 1060, Malvern).

UV-Vis-spectroscopie

UV-Vis-spectra (UV-1800 m, Shimadzu), in een bereik van 400 tot 700 nm, werden verkregen voor voorlopige bevestiging van de vorming van gouden nanodeeltjes door middel van de oppervlakteplasmonresonantieband rond 530 nm. Complementair werden de spectra van vers bereide nanocomposieten gebruikt om de fotostabiliteit van monsters kwalitatief te evalueren; dit werd gedaan door vergelijking met spectra verkregen uit dezelfde monsters 150 dagen na synthese, door veranderingen rond de oppervlakte-plasmonresonantieband te volgen, één monster voor elke methode te kiezen en COS@2-AuNP's te gebruiken als de meest representatieve voor COS@n-AuNP serie. Kwartscel werd gebruikt als de container van het monster en gedeïoniseerd water als blanco.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

TEM-microscopie (JEM 1010, JEOL) werd gebruikt voor het bepalen van vorm en deeltjesgrootteverdeling. Voor TEM-afbeeldingen werden nanocomposietmonsters bereid door 10  μl oplossing over 200 mesh koperen roosterondersteuning te deponeren, bedekt met formvar en 15 min bij kamertemperatuur te drogen. Voor elk monster werden drie afbeeldingen geselecteerd en geanalyseerd met behulp van een zelfgemaakt beeldverwerkingsprogramma dat is ontwikkeld met Matlab®-software.

Complexvorming en hechtingsgraad

Nanocomposiet-pDNA

pSV-β-Gal (6,82 kb) en pIRES2-EGFP (5,3 kb) (pDNA) werden geïsoleerd uit getransformeerde DH5α Escherichia coli . Plasmidezuivering werd uitgevoerd door alkalische lysis, met behulp van Mo Bio® UltraClean Microbial DNA Isolation Kit. Agarosegelelektroforese werd gebruikt om de structurele integriteit van plasmiden te verifiëren, met behulp van een krachtige ultraviolette transilluminator, waarbij beelden werden verkregen met een Kodak Gel Logic 100 Digital Imaging System. Plasmide-DNA-concentratie en zuiverheid werden gevalideerd met Synergy™ 2 Multi-Detection Microplate Reader met behulp van het Gen5-programma. Complexen werden verkregen door plasmide-DNA (pDNA) te mengen met elk type goud-chitosan nanodeeltjes nanocomposieten in geen serum Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich) in plasmidehoeveelheden tussen 200 en 400 ng. pDNA-adhesie aan nanocomposiet werd geëvalueerd door elektroforese met behulp van agarosegel bij 0,8% en een spanning van 90 V gedurende 60 min.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection in HEK-293 Cells

Celcultuur

HEK-293 Homo sapiens (humane)-epitheliale morfologie-embryonale nier-foetuscellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium met foetaal runderserum (SFB, Sigma-Aldrich) bij 37°C onder 5% CO₂ -houdende atmosfeer. Voor pDNA-transfectie werden HEK-293-cellen gezaaid met 12.000 cellen per putje in een plaat met 96 putjes en gedurende 24 uur bij 37 ° C in 5% CO₂ geïncubeerd. -houdende atmosfeer, waardoor 90% samenvloeiing wordt verkregen.

Transfectie-efficiëntie met pIRES2-EGFP

In vitro pDNA-nanocomposiet-functionalisatie werd uitgevoerd door kweekmedium uit putjes te gieten totdat de cellen nauwelijks bedekt waren en de complexe oplossing aan elk putje toe te voegen (15 l nanocomposieten en 200  ng DNA), gedurende 2 uur onder dezelfde kweekomstandigheden te incuberen. Daarna werd 500  μl compleet DMEM toegevoegd voor 48   uur incubatie. pIRES2-EGFP-transfectie werd direct geëvalueerd door fluorescentiemicroscopie (Axio Vert.A1, Carl Zeiss).

Transfectie-efficiëntie met pSV-β-Gal

X-gal-histochemie werd gebruikt om de -galactosidase-activiteit te evalueren door pSV-β-Gal-plasmide-expressie op HEK-293-cellijn te modificeren; bij deze methode werden de getransfecteerde cellen blauw. In vitro pDNA-nanocomposiet-functionalisatie werd uitgevoerd zoals hierboven uitgelegd, gedurende 2 uur incuberen onder dezelfde kweekomstandigheden. Daarna werd 500  μl compleet DMEM toegevoegd voor incubatie gedurende 24 h, medium verversen en incuberen voor nog eens 24 h. Putjes werden twee keer gewassen met 50  μl steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1 x na verwijdering van kweekmedium, vervolgens werden cellen gefixeerd met 2% formaldehyde en 0,2% glutaaraldehyde-mengsel gedurende 5 min; daarna werden ze twee keer gewassen met 50 l PBS 1×. Fixeermiddel werd verwijderd voordat tweemaal gewassen werd met 50  μl PBS 1x en vervolgens met een mengsel van 0,4  mg/ml X-gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, Sigma-Aldrich) verdund in 5 mM kaliumferrocyanide (Meyer) en magnesiumchloride 2 mM (Meyer) op PBS 1×. Vervolgens werden de cellen 24 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. -galactosidase-expressie werd waargenomen door helderveldmicroscopie (AE2000, Motic), waarbij 5 velden per putje met een ×  40-doelstelling werden genomen, in de verwachting dat de getransfecteerde cellen blauw zouden worden. De transfectie-efficiëntie werd geëvalueerd door cellen met β-galactosidase-expressie (blauw gekleurd) te vergelijken met het totale aantal cellen per veld. LipofectAMINE ^TM 2000 (30 l) werd gebruikt als positieve controle voor elke test.

Levensvatbaarheid van cellen door middel van kleurstofuitsluiting

Microculturen werden 24 uur na celpassage gebruikt. Kweekmedium werd verwijderd en cellen werden gewassen met PBS 1 x voordat 40  μl complexe oplossing werd toegevoegd. Daarna werden de cellen gedurende 2  uur bij 37 ° C en 5% CO₂ . geïncubeerd -houdende atmosfeer. Voor kleurstofuitsluiting werd de complexe oplossing van cellen gewassen met 50 l PBS 1x en 20  μl Trypan-blauw (0,2% op PBS 1x) werd opgenomen. Met dit laatste mengsel werden de cellen 10 min geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO₂ -houdende atmosfeer. Na deze laatste incubatie werd de kleurstof uit de putjes verwijderd en gereinigd door tweemaal te wassen met 50  μl PBS 1x. Cellen werden waargenomen met helderveldmicroscopie, waarbij blauw geverfde cellen (dood of beschadigd) werden geteld tegen het totale aantal cellen per veld. Cellevensvatbaarheidstesten werden verkregen voor verschillende complexe concentraties op water, van 0,1 mM tot 3 mM, CO-AuNP's en Acyl-CO, bij 3 mM; COS@3-AuNP's en COS@4-AuNP's, bij 0,5 mM; en de laagste concentratie (0,1 mM) voor COS@1-AuNP's en COS@2-AuNP's.

Software Afbeelding J (Open source-software (OSS ) licentie ) samen met de plug-in Image-based Tool for Counting Nuclei-ICTN werden gebruikt om cellen te tellen voor transfectie- en levensvatbaarheidstests.

Resultaten en discussies

Nanocomposietsynthese en karakterisering

Van de drie soorten complexen die in dit werk zijn gesynthetiseerd, verdient COS@n-AuNP speciale aandacht omdat ze werden gesynthetiseerd zonder het gebruik van giftige reagentia, zoals natriumboorhydride of cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB). Er is gemeld dat chitosan geschikt is als reductie- en stabilisator en optimale concentratie voor het synthetiseren van AuNP-complexen in de gewenste grootte en vorm, afhankelijk van meerdere factoren:reactietijd, temperatuur en mate van deacetylering van chitosan en het molecuulgewicht ervan, onder andere [38] , 40]. Onder deze overweging werd het molecuulgewicht van chitosan constant gehouden op 5 kDa voor de vier COS@n-AuNP-syntheses, waarbij HAuCl₄ ∙3H₂ O- en chitosan-oplossingen in verschillende concentraties.

Figuur 3 toont UV-Vis-absorptiespectra van AuNPs-chitosan-nanocomposieten die in dit werk zijn gesynthetiseerd. Plasmonbanden gecentreerd op 534 nm voor chitosan (CO-AuNP's), 507 nm voor geacyleerd chitosan (Acyl-CO-AuNP's) en voor de verschillende chitosan-oligosacchariden op 533 nm (COS@1-AuNP's), 530 nm (COS@2 -AuNP's), 535 nm (COS@3-AuNP's) en 536 nm (COS@4-AuNP's) bevestigen de aanwezigheid van gouden nanodeeltjes. Inzetstukken in deze afbeelding tonen afbeeldingen van de verkregen nanocomposieten waarvan de kleur afhangt van de concentratie, grootte, vorm en oppervlaktefunctionaliteit van de nanodeeltjes.

UV-Vis-spectra voor nanocomposieten. Waarden in de inzetstukken komen overeen met de maximale golflengte van de gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie. Deze maxima waren als volgt:voor CO-AuNP's bij 534 nm (0,1 M NaBH₄ ) (een ), voor Acyl-CO-AuNP's bij 507 nm (b ), en voor COS-@n-AuNP chitosan-oligosaccharide bij 533, 530, 535, 536 nm voor elk bij 1-4 nanocomposietpreparaten met verschillende diktes (c )

Stabiliteit van nanocomposieten

Figuur 4 toont de vergelijking tussen UV-Vis-absorptiespectra van vers gesynthetiseerde nanocomposieten en 150 dagen na synthese; zoals kan worden waargenomen, blijven de twee spectra voor elk geval in wezen hetzelfde, geen significante verschuiving van het maximum van resonantiebanden en geen bewijs van extra pieken. Deze resultaten suggereren kwalitatief een hoge stabiliteit van de verkregen nanocomposieten.

Stabiliteit van gouden nanodeeltjes nanocomposieten door UV-Vis absorptiespectra verkregen 150 dagen na synthese:chemisch gesynthetiseerde CO-AuNP's (a ) en Acyl-CO-AuNP's (b ) en groen/eenpotssynthese voor COS@2-AuNP's (c )

Infraroodspectroscopieën voor de drie verschillende chitosan-monsters worden getoond in Fig. 5. Deze techniek werd gebruikt voor de identificatie van het geacyleerde chitosan door de absorptiebanden in het infrarood (IR) gebied (die kenmerken zijn van de chemische structuur) te vergelijken met de IR databank. Enkele karakteristieke IR-banden zijn het vermelden waard:chitosan (50-190 kDa, 75% deacetyleringsgraad) banden bij 1656 cm ⁻¹ , 1593 cm ⁻¹ , en 1373 cm ⁻¹ komen overeen met amidegroepen (respectievelijk amiden I, II en III); de band op 2895 cm ⁻¹ komt overeen met C-H-bindingen, en die tussen 3200-3500 cm ⁻¹ aan N-H- en O-H-bindingen. Voor geacyleerd chitosan werden IR-banden verkregen bij 1651 cm ⁻¹ , 1591 cm ⁻¹ , en 1369 cm ⁻¹ komen overeen met amidegroepen (respectievelijk amiden I, II en III), en die binnen 3200-3500 cm ⁻¹ corresponderen met N-H- en O-H-bindingen. Chitosan-acylering werd bevestigd volgens IR-spectroscopiegegevens [7]:de band op 1591 cm ⁻¹ was lager voor geacyleerd chitosan in vergelijking met natuurlijk chitosan vanwege een groter aantal secundaire amiden op geacyleerd chitosan. Banden binnen 3200-3500 cm ⁻¹ , kenmerkend voor N-H- en O-H-vibraties in natuurlijk chitosan, verdwijnt voor geacyleerd chitosan en chitosan-oligosaccharide als gevolg van primaire amidereductie.

FT-IR-spectra van chitosan, acyl-chitosan en chitosan-oligosacharide. Band op 1591 cm ⁻¹ komt overeen met secundaire amiden; 3200-3500 cm ⁻¹¹ regio's komen overeen met N-H en O-H trillingen

De mate van substitutie voor geacyleerd chitosan werd geschat, volgens Bahadur et. al. [6], door de volgende uitdrukking:

$$ \% DS=\left(\left(\frac{A_{1651}}{A_{3350}}\right)-0.25\right)\times 100=75.16781\% $$

waar A ₁₆₅₁ = 1.973965 en A ₃₃₅₀ =-1,977278 komt overeen met absorptie (respectievelijk voor amide I- en OH-vibratie) van geacyleerd chitosan bij 1631 cm ⁻¹ en 3350 cm ⁻¹ , respectievelijk, en de 0,25 komt overeen met de groepen vrije aminen. Er werd een N-acyleringsgraad van 75% verkregen.

ξ Potentieel

ξ-potentiaalwaarden werden als volgt voor elke composiet verkregen (tabel 2, kolom "ξ-potentiaal"):43,3 mV (CO-AuNP's), 40,2 mV (Acyl-CO-AuNP's), 52,2  mV (COS@1-AuNP's) , 55,3 mV (COS@2-AuNP's), 51,6 mV (COS@3-AuNP's) en 46,3 mV (COS@4-AuNP's). Potentieel voor alle nanocomposieten was positief vanwege de aminegroepen van chitosan zoals gepland om DNA-complexvorming door elektrostatische krachten te bereiken. Na complexvorming bevestigde verlaging van de ξ-potentiaalwaarden de succesvolle adhesie van DNA (tabel 2, kolom 'ξ-potentiaal/DNA').

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

Figuur 6 toont de representatieve TEM-microfoto's voor elke nanocomposiet, samen met histogrammen van nanodeeltjesgrootte voor de berekening van de grootteverdeling. Grootteverdelingen voor elke nanocomposiet werden als volgt verkregen:drie TEM-afbeeldingen voor elk monster werden verkregen en geanalyseerd met zelfgemaakte beeldverwerkingssoftware ontwikkeld met Matlab® en het aantal nanodeeltjes was 500 voor Acyl-CO-AuNP's, 1000 voor CO-AuNP's , en 100 voor de COS@n-AuNP-serie. De gemiddelde grootte voor elk monster is samengevat in tabel 2, kolom 'Gemiddelde TEM-diameter (nm)'. Het is de moeite waard om erop te wijzen dat AuNP's gesynthetiseerd met chitosan-oligosaccharide bolvormig resulteerden, met een betere grootteverdeling in vergelijking met vergelijkbare verkregen met andere groene synthesemethodologieën die in de literatuur zijn gerapporteerd [36, 38, 41,42,43].

TEM-microfoto's van a 4.7 nm geacyleerde chitosan AuNP's, b 3,5 nm chitosan AuNP's (0,1 M NaBH₄ ), c 7.4 nm oligosacharide chitosan AuNP's (COS@1), d 15,6-nm oligosacharide chitosan AuNP's (COS@2), e 10 nm oligosacharide chitosan AuNP's (COS@3) en f 14 nm oligosacharide chitosan AuNP's (COS@4)

Complexvorming en hechtingsgraad:nanocomposiet-pDNA

Elektroferogrammen van alle pDNA-complexen en zuiver DNA werden uitgevoerd, waarbij verschillende concentraties van het plasmide werden genomen; resultaten worden getoond in Fig. 7. Figuur 7a toont de overeenkomstige elektroferogrammen voor het zuivere plasmide en alle complexen gedragen met 200 en 300 ng van het plasmide. De verdeling van nanocomposietmonsters voor dit elektroferogram gaat als volgt:Acyl-CO-AuNP's (300 en 200 ng) op lanen 1 en 2, CO-AuNP's (300 ng) op laan 3, COS@1-AuNP's (300 en 200 ng) bij 4 en 5, COS@2-AuNPs (300 en 200 ng) bij 6 en 7, COS@3-AuNPs (300 en 200 ng) bij 8 en 9, COS@4-AuNPs (300 en 200 ng) bij 10 en 11, en 300 ng zuiver pDNA in baan 12. Voor alle tests werd 10 l complexe oplossing gebruikt. Deze figuur laat zien dat alleen het pDNA in de gel reist (zoals blijkt uit laan 12) en de andere pDNA-complexen in hun overeenkomstige putjes achterblijven, wat op deze manier de pDNA-adhesie op alle complexen bevestigt. Dit komt door de interactie van de positieve ladingen van de aminogroepen van chitosan, die op het gouden nanodeeltjesoppervlak achterblijven, en de negatieve ladingen van de fosfaatgroepen van DNA-helixen.

een Elektroferogrammen voor nanocomplexen met pDNA-concentraties van 200 en 300 ng. Baan 12 komt overeen met zuiver pDNA. b CO-AuNP's en Acyl-CO-AuNP's met 300 ng pDNA, puur pDNA op baan 3. c COS@2-AuNPs nanocomplex met 300 en 350 ng DNA, 400 ng puur pDNA op baan 3. d same CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs at 1:10 dilution, with respectively pure DNA control at lane 3

To evaluate the retention ability of COS@2 complexes, eletropherograms for the corresponding pDNA complex were carried out with the same COS@2 concentration but different pDNA concentrations (300 ng, 350 ng, and 400 ng); the results are shown in Fig. 7b. Lanes 1, 2, and 3 on this figure correspond to plasmid concentration of 300 ng, 350 ng, and 400 ng, respectively; results in lane 1 is in perfect agreement with the corresponding result in Fig. 7a (lane 7) and, both results in lane 2 and 3 of Fig. 7b, indicate that retention power of this complex is below 350 ng of the plasmid.

Chitosan-Gold Nanoparticle-pDNA Complex Transfection into HEK-293 Cells

As it was pointed out before, two different tests were made in order to evaluate pDNA transfection, taking advantage of the X-galactosidase activity of the pSV-β-Gal plasmid and the fluorescence activity for the case of the piRES2-EGFP plasmid. Figure 8 shows the micrographs of transfection test in HEK-293 cells by X-galactosidase activity on pSV-β-Gal; blue cells in this figure (pointed out by arrows) are some of the transfected cells, according to the corresponding methodology. On the other hand, Fig. 9 shows the fluorescence micrographs of transfected HEK-293 cells; this technique was used to evaluate transfection efficiency with pIRES2-EGFP plasmid. For both figures, (a) shows pure cells and (b) shows cells using LipofectAMINE ^TM 2000 as a positive control. Corresponding transfections rates with each conjugate are shown as follows:(c) CO-AuNP, (d) Acyl-CO-AuNPs, (e) COS@1-AuNPs, (f) COS@2-AuNPs, (g) COS@3-AuNPs, and (h) COS@4-AuNPs. Transfection efficiency percentages obtained with the different complexes were as follows:CO-AuNP 27%, Acyl-CO-AuNP 33%, COS@1-AuNP 48%, COS@2-AuNP 60%, COS@3-AuNP 45%, and COS@4-AuNP 52%. Figure 10 shows the histograms for the transfection percentages obtained with each complex. Transfection efficiency was evaluated by comparing cells presenting pDNA expression against total cells per well. The highest transfection efficiencies were obtained with conjugates from COS@2-AuNP complexes; this can be explained by the highest chitosan/gold ratios used for this green method of synthesis. These results may complement those reported by Köping-Höggård et. al. [40], which suggests that the use of DNA conjugates with chitosan oligomers of different length affects the stability and transfection efficiency. The present work deserves additional consideration since the transfection efficiencies were improved in this case using low molecular weight chitosan oligosaccharides complexed with gold nanoparticles.

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pSV-β-Gal). een HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

HEK-293 Homo sapiens (human)-epithelial morphology-embryonic kidney-fetus cell transfection tests (pIRES2-EGFP).a HEK-293 cells, b positive control:LipofectAMINE ^TM 2000, c CO-AuNP, d Acyl-CO-AuNPs, e COS@1-AuNPs, f COS@2-AuNPs, g COS@3-AuNPs, and h COS@4-AuNPs. Arrows point to transfected cells

Transfection efficiency percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293-transfected cells

Dye Exclusion Test

Figure 11 (inset) shows the micrographs for cell viability evaluation. Blue dyed cells (dead or damaged) were compared against total cells per field. The highest cell viability was obtained with COS@1-AuNPs and COS@2-AuNPs, with 93.53% and 93.46%, respectively. It is interesting to note that COS@2-AuNPs also showed the best transfection efficiency. Among COS@n-AuNP series, COS@4-AuNPs showed lower viability (78.23%). As expected, tests with LipofectAMINE ^TM 2000 and CO-AuNPs presented the lowest viability (61.45% and 77.85% respectively). Finally, viabilities with Acyl-CO and COS@3-AuNPs were 90.75% and 92.08 % respectively.

Cell viability percentages obtained with the different nanocomplexes (pSV-β-Gal and pIRES2-EGFP test). HEK-293 cells

Conclusions

Chitosan, acylated chitosan, and chitosan oligosaccharide nanocomposites with gold nanoparticles, featuring positive charges, were synthesized. They presented good stability in colloidal solution; this confirms the viable use of chitosan as a stabilizer and chitosan oligosaccharide as both reducing agent and stabilizer, and positive charges by its amino groups improved affinity with plasmid DNA. Size distributions of the synthesized gold nanoparticles were in a range of 3 to 15 nm. Gel electrophoresis and ξ-potential studies showed that plasmid DNA was successfully incorporated to the nanoparticles by interaction with the positive charges from chitosan at the surface of the nanocomposites. The best transfection efficiency, with 93.46% viability, was obtained with the COS@2-AuNP complexes, possibly due to its relatively high chitosan/gold ratio (1.96/0.003); this means larger effective surface for the anchoring of the plasmids by means of the electrostatic interaction of its phosphate groups with the chitosan amine functional groups. The COS@n-AuNP complexes obtained by the green/one-pot synthesis described in this work showed high transfection efficiency, as compared with those obtained with traditional chemical synthesis (CO-AuNPs and Acyl-CO-AuNPs), and can be proposed as promising green route-synthesized pDNA vehicles without the inconvenience of using toxic chemical reagents. Moreover, chitosan oligosaccharide as a reducing agent can be considered as a green synthesis method for AuNPs and renders spherical nanoparticles with good size distribution. This kind of safe and non-toxic routes of synthesis for nanocomplexes, like the ones proposed in this work, deserve further research in the search of obtaining more safe plasmid carriers for gene therapy applications.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

All datasets on which the conclusions of the manuscript rely are presented in the main paper.

Afkortingen

Acyl-CO:

Acylated chitosan

AuNP's:

Gouden nanodeeltjes

CO:

Chitosan

COS:

Chitosan oligosaccharide

DMEM:

Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium

FTIR:

Fourier-transform infrarood

PBS:

Phosphate-buffered saline

pDNA:

Plasmid Deoxyribonucleic acid

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie