Antitumoreffect van 131I-gelabelde anti-VEGFR2 gerichte mesoporeuze silica-nanodeeltjes bij anaplastische schildklierkanker

Abstract

Anaplastische schildklierkanker (ATC) omvat ongeveer 2% van alle schildklierkankers en de mediane overlevingskans blijft laag vanwege de resistentie tegen conventionele therapie. Vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGFR)-gerichte therapeutisch geladen mesoporeuze silica-nanodeeltjes vertegenwoordigen een belangrijke vooruitgang voor angiogenese-beeldvorming en remming bij dodelijke kankers. In de huidige studie wilden we beoordelen of ¹³¹ I-gelabelde anti-VEGFR2 gerichte mesoporeuze silica nanodeeltjes zouden antitumor werkzaamheid hebben in een ATC-tumordragend naakt muismodel. Met behulp van in-vitro- en in-vivo-onderzoeken hebben we het verhoogde vermogen tot richten en de retentietijd in de anti-VEGFR2-doelgroep onderzocht met behulp van confocale microscopie en een γ-teller. De radioactiviteit van tumorweefsel van de anti-VEGFR2-doelgroep was 24 en 72 uur na intratumorale injectie significant hoger dan die van de niet-doelgroepen (alle P < 0.05). Bovendien ontdekten we dat radioactieve accumulatie zelfs 3 weken na injectie duidelijk was in de anti-VEGFR2-doelgroep via computertomografie met enkelvoudige fotonenemissie/computertomografie, die 3 dagen na injectie niet werd waargenomen in de Na¹³¹ ik groepeer. Ondertussen, vergeleken met de niet-doelgroep, werd de tumorgroei in de beoogde groep significant geremd, zonder duidelijke systemische toxische effecten te veroorzaken. Bovendien was de mediane overlevingstijd in de getargete groep (41 dagen) significant verlengd in vergelijking met die in de niet-getargete (34 dagen) of Na¹³¹ I (25 dagen) groepen (beide P < 0,01). Onze gegevens ondersteunen de opvatting dat de as-ontwikkelde ¹³¹ I-gelabelde anti-VEGFR2 gerichte mesoporeuze silica nanodeeltjes toonden veelbelovende resultaten in ATC tumordragende muismodel en een dergelijke benadering zou een nieuwe therapeutische optie voor ATC kunnen zijn.

Achtergrond

Anaplastische schildklierkanker (ATC) is slechts verantwoordelijk voor ongeveer 2% van alle schildklierkankers; het is echter een lokaal agressief type tumor met een hoog aantal metastasen op afstand. Over het algemeen is de mediane overleving van patiënten met ATC ongeveer 6 maanden, waarbij slechts 20% van de patiënten 1 jaar na diagnose overleeft vanwege een vasculaire catastrofe en instorting van de luchtwegen veroorzaakt door agressieve regionale ziekte die nekweefsel en lymfeklier- en/of longmetastasen binnendringt [1 , 2]. Radiojood-131 (¹³¹ I) speelt een belangrijke rol bij de diagnose en behandeling van gedifferentieerde schildklierkanker (DTC) metastasen [3,4,5]. De conventionele ¹³¹ I-behandelingsmodaliteit is niet geschikt voor ATC vanwege de niet-jodiumconcentrerende eigenschap [6].

Angiogenese is een belangrijke factor die bijdraagt aan de overleving, groei, migratie en metastase van kankercellen. Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) is een cruciaal regulerend cytokine bij angiogenese en speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van ATC. De gevestigde rol van VEGF in angiogenese betekent dat radioactief gelabelde liganden, zoals bevacizumab, die zich richten op de VEGF-receptor (VEGFR), met succes zijn ontwikkeld voor vroege en gevoelige laesiedetectie met behulp van positronemissietomografie (PET) en computertomografie met enkelvoudige fotonenemissie ( SPECT) beeldvormende technieken. VEGFR-2 oefent de meeste functies van VEGF uit in endotheelcellen van bloedvaten en is verantwoordelijk voor proliferatie door de activering van de door mitogeen geactiveerde proteïnekinaseroute, migratie van endotheelvaten en de bevordering van angiogenese en vasculaire groei [7, 8 ]. VEGF-expressie wordt opgereguleerd in ATC-cellen van epitheliale oorsprong vergeleken met die in normaal schildklierweefsel [9,10,11]. Er zijn anti-VEGF-strategieën ontwikkeld om de groei van nieuwe bloedvaten te remmen en tumoren van noodzakelijke zuurstof en voedingsstoffen te verhongeren. Verschillende preklinische onderzoeken hebben met verschillende mate van succes geneesmiddelen ontwikkeld die zich richten op VEGFR2 in ATC [12,13,14,15]. Een van de grootste uitdagingen met betrekking tot deze geneesmiddelen tegen kanker is echter hun lage biologische beschikbaarheid en inefficiënte afgifte aan de doellocatie. Veel geneesmiddelen tegen kanker zijn hydrofoob en hebben biocompatibele medicijnafgiftesystemen nodig om hun biologische beschikbaarheid te verbeteren en gemakkelijker intraveneuze toediening te vergemakkelijken.

Nanodeeltjes, waaronder op metaal, polymeer en lipiden gebaseerde nanodeeltjes, kunnen worden gebruikt om een therapeutisch middel te combineren met een beeldvormend middel. Gerichte liganden/groepen, zoals peptiden, antilichamen, radionucliden of antilichaamfragmenten, kunnen aan nanodeeltjes worden gehecht om hun therapeutische werkzaamheid te verbeteren. Voor de behandeling van kanker zouden nanodeeltjes zich in het tumorgebied kunnen ophopen via een verbeterde permeabiliteit en retentie-effect, met het vermogen om therapeutische middelen op een meer gelokaliseerde manier af te leveren. Gedurende vele jaren wordt silica in materiaalwetenschappen en engineering beschouwd als een veelzijdig en relatief veilig materiaal vanwege de verscheidenheid aan beschikbare fysische en chemische modificaties die het biedt, evenals zijn goede biocompatibiliteit [16]. De Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) erkent silica als "algemeen veilig" [17, 18]. Van de verschillende materialen op silicabasis onderscheiden mesoporeuze silica-nanodeeltjes (MSN's) zich als een klasse van nanomaterialen met veel onderscheidende voordelen, zoals hun niet-toxische aard, goede oppervlaktepermeabiliteit, groot oppervlak, afstembare poriestructuren, uitstekende fysisch-chemische stabiliteit, en chemisch aanpasbare oppervlakken, die ze allemaal potentiële gastheren maken voor verschillende chemische agentia en/of therapeutische geneesmiddelen [19]. Evenzo is aangetoond dat mesoporeuze koolstofnanomaterialen uitstekende nanodragers zijn bij de afgifte van geneesmiddelen [20,21,22]. In de afgelopen jaren zijn de inspanningen op het gebied van MSN's gericht geweest op het combineren van therapeutische en beeldvormende mogelijkheden. Het labelen van nanodeeltjes met beeldvormende sondes is een waardevol hulpmiddel om hun in vitro en in vivo tracking mogelijk te maken. Momenteel vormen gerichte behandelingsmodaliteiten een bemoedigende strategie voor ATC-behandeling [23, 24].

Geïnspireerd door de centrale rol van gerichte therapie en moleculaire beeldvorming tegen VEGFR in kankeronderzoek en de voordelen die MSN's bieden, ontwikkelden we in deze studie een anti-VEGFR2 gericht op potentieel theranostisch nanoplatform op basis van oppervlakte-engineering van MSN's voor gelijktijdige niet-invasieve SPECT-beeldvorming en een in vivo verbeterde ¹³¹ Ik therapeutisch effect. We wilden bepalen of ¹³¹ Met I-gelabelde anti-VEGFR2 gerichte MSN's zouden antitumorwerking hebben in een ATC-tumordragend naakt muismodel, gevolgd door uitgebreide in vivo, in vitro en ex vivo onderzoeken.

Materialen en methoden

Materialen

Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM), 0, 25% trypsine-EDTA en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht bij Gibco (CA, VS). Antibiotica (penicilline G, streptomycine en nystatine) werden gekocht bij Dingguo Biotechnology Co. Ltd. (Beijing, China). Hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB), tetraethylorthosilicaat (TEOS), 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES), dimethylsulfoxide (DMSO), 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC), N -hydroxysuccinimide (NHS) en fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Duitsland). Na¹³¹ Ik ben gekocht bij Atomic Hitech (Beijing, China). Anti-VEGFR2-antilichamen werden gekocht bij Abcam Co. Ltd. (VK).

Karakteriseringen

De nanodeeltjes werden gedispergeerd in ethanol, waarbij een suspensie werd gevormd, afgezet op een met koolstof bedekt koperen rooster en gedurende ten minste 24 uur gedroogd. De morfologie van de nanodeeltjes werd bepaald met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (JEOL-100CXII, Japan) bij een versnellingsspanning van 200 kV. De zeta-potentialen en hydrodynamische diameters van de monsters werden gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) met behulp van een Zetasizer (Nano ZS90, VK). De poriegrootteverdelingen en oppervlakten van MSN's werden gekarakteriseerd door Brunauer-Emmett-Teller (BET) en Barrett-Joyner-Halenda (BJH) analyses (ASAP2020M, VS).

Celcultuur

De menselijke ATC-cellijn FRO [25] (gekocht bij het Cell Resource Center, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Beijing Medical College in Peking, Volksrepubliek China) werd gekweekt bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een mengsel van 5% CO₂ en 95% lucht en aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Het medium werd om de dag vervangen en de cellen werden door trypsine gepasseerd nadat confluentie was bereikt. De cellen werden voor elk experiment voorgekweekt totdat ongeveer 80% confluentie was bereikt.

Voorbereiding en oppervlaktemodificatie van silica-nanodeeltjes

Synthese van MSN's en aminering

De MSN's zijn gesynthetiseerd zoals eerder gemeld [26]. In het kort werd 50 mg CTAB toegevoegd aan een mengsel van 25 ml water, 5 ml ethanol en 100 μL 2 M NaOH-oplossing in een rondbodemkolf onder continu roeren bij 70 ° C. Vervolgens werd 200 L TEOS aan het mengsel toegevoegd en gedurende 1 uur gereageerd. De reactieoplossing werd vervolgens gecentrifugeerd en vijf keer gewassen met ethanol bij 10.000 rpm. Vervolgens werden de producten opnieuw gesuspendeerd in 10 ml ethanol. Na verwijdering van de CTAB-template werd het product vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 5 ml DMSO en 100 μL APTES, dat druppelsgewijs aan het resulterende mengsel werd toegevoegd om het silica-oppervlak door aminering te modificeren. Na een nacht roeren werden de precipitaten gescheiden door centrifugeren, vijf keer gewassen met ethanol en vervolgens de MSNs-NH₂ zijn verkregen.

Synthese van BSA-MSNs-Anti-VEGFR2

Vijf milligram runderserumalbumine (BSA) en 50 μL anti-VEGFR2-antilichamen werden toegevoegd aan het bovenstaande product (MSNs-NH₂ , 50 mg) en reageerde onder roeren gedurende 2 uur. Het mengsel werd vijf keer gewassen met water, waarna 1,1 mg NHS en 1,6 mg EDC aan het mengsel werden toegevoegd en een nacht bij kamertemperatuur in 5 ml water werd geroerd. De precipitaten werden gescheiden door centrifugatie, vijf keer gewassen met water, wat met succes de BSA-MSN's-anti-VEGFR2 verkreeg.

¹³¹ I Radiolabeling van nanodeeltjes

De geproduceerde nanodeeltjes werden radioactief gelabeld met ¹³¹ Ik gebruik de Chloramine-T-methode (aangeduid als ¹³¹ I-BSA-MSN's en ¹³¹ I-BSA-MSN's-anti-VEGFR2, respectievelijk) [27]. In het kort, ongeveer 100 μg BSA-MSN's of BSA-MSN's-anti-VEGFR2 werd verdund met 100 μL fosfaatbuffer (PB) en 74 MBq ¹³¹ Ik werd toegevoegd. Vervolgens werd chlooramine-T (100 L; 5 mg/ml in PB) aan het mengsel toegevoegd. Na 60 seconden schudden en incuberen werd de reactie gestopt door 100 μL natriummetabisulfiet (5 mg/ml in PB) toe te voegen. De centrifugebuis werd gebruikt om gelabelde BSA-MSN's en BSA-MSN's-anti-VEGFR2 te scheiden van verbindingen met een laag molecuulgewicht. De labelingssnelheid en de radiochemische zuiverheid van ¹³¹ Gelabelde nanodeeltjes werden bepaald met behulp van dunnelaagchromatografie.

In vitro cellulaire opname:onderzoek naar confocale microscopie

Ten eerste werden de MSN's-anti-VEGFR2 en MSN's gelabeld met FITC [28]. In het kort, MSNs-NH₂ (100 mg) werden toegevoegd aan 1 ml FITC-alcoholoplossing (1 mg/ml), onder roeren gedurende 4 uur. FITC-gelabelde MSN's (FITC-MSN's) werden verkregen door centrifugeren en onder vacuüm gedroogd. FITC-MSNs-anti-VEGFR2 kan ook worden verkregen met dezelfde methode.

FRO-cellen werden overnacht in platen met 6 putjes gezaaid en vervolgens 5 × 10⁵ cellen per putje werden respectievelijk 1 en 6 uur bij 37 ° C geïncubeerd met FITC-MSN's en FITC-MSN's-anti-VEGFR2. Cellen werden driemaal gewassen met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) en vervolgens 20 minuten gefixeerd met 70% ethanol. Verder werden de cellen drie keer gewassen met PBS en werden de kernen 45 minuten gekleurd met 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) en vervolgens gefixeerd met paraformaldehyde (4% in PBS). Confocale microscopiebeelden werden verkregen met behulp van een confocale laser scanning microscopie (CLSM) (Zeiss LSM 510, VS).

Tijdsafhankelijke cellulaire opname

Om de tijdsafhankelijke cellulaire jodium-131-opname van de nanodeeltjes te meten, 1 × 10⁵ cellen per putje werden gekweekt met 3,7 MBq/ml vrij Na¹³¹ Ik, ¹³¹ I-BSA-MSN's, of ¹³¹ I-BSA-MSN's-anti-VEGFR2 respectievelijk. De cellen werden vervolgens zo snel mogelijk gewassen met 1 ml Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) -bufferoplossing, losgemaakt met trypsine en opnieuw gesuspendeerd in 1 ml HBSS gedurende 1, 2, 3, 5, 7 en 9 uur. Radioactiviteit werd gemeten met behulp van een -teller (LKB gamma 1261, Australië). Alle experimenten werden drie keer uitgevoerd om exacte gegevens te verkrijgen.

Dierenmodel

Balb/c naakte muizen (vrouwtjes, ongeveer 4 weken oud, met een gewicht van 15-20 g) werden gekocht bij het Beijing Experimental Animal Research Center van Peking Union Medical College en onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden, met een relatieve vochtigheid (30-70). %) en temperatuurgecontroleerde (20-24 °C) omgeving in het Laboratory Animal Center, Tianjin Medical University, China. Alle procedures voor het hanteren van dieren waren in overeenstemming met een protocol dat was goedgekeurd door de ethische commissie van het Tianjin Medical University General Hospital. FRO-tumorxenotransplantaten werden geïnduceerd door subcutane injectie van 5 × 10⁶ FRO-cellen in 50 μL PBS in de rechterschouder van de muizen.

In vivo beeldvorming

Toen de tumordragende naakte muizen 1-2 weken werden gevoerd en het tumorvolume een diameter van ongeveer 10 mm had bereikt, werden de muizen willekeurig in drie groepen verdeeld (Na¹³¹ Ik, ¹³¹ I-BSA-MSN's en ¹³¹ I-BSA-MSN's-anti-VEGFR2). Elke groep ontving 7,4 MBq ¹³¹ I via intratumorale injectie om de orgaanlokalisatie van ¹³¹ . te beoordelen I-gelabelde nanodeeltjes. Scintigrafische beeldvorming werd uitgevoerd op 1, 2, 3, 7, 14 en 21 dagen na de respectieve medicijninjectie. Naakte muizen werden vóór elke scan verdoofd met 4% chloraalhydraat (150 L), in buikligging geplaatst en vervolgens afgebeeld met een SPECT/CT-scanner (Discovery NM/CT 670, VS). Om blootstelling van schildklierweefsel aan ongewenste straling en beeldvorming te voorkomen, werd 1 dag voor het experiment natriumperchloraat (0,05 mg/ml) aan het drinkwater voor alle muizen toegevoegd en gedurende 1 week gehandhaafd.

Weefselverdeling

24 en 72 uur na intratumorale injectie van 7,4 MBq ¹³¹ I-gelabelde nanodeeltjes, de muizen in elke groep (n = 3/groep) werden opgeofferd door cervicale dislocatie en het hart, de milt, de nier, de lever, de darm, de long en de tumorweefsels werden verwijderd en gewogen. Radioactiviteit in verschillende organen werd gemeten met een γ-teller (LKB gamma 1261, Australië) en de radioactiviteit werd uitgedrukt als percentage van de geïnjecteerde dosis per gram weefsel (%ID/g).

In vivo ¹³¹ Ik Therapie

Net als bij in vivo beeldvorming werden de muizen van de drie groepen intratumoraal geïnjecteerd met een dosis van 74 MBq (50 μL) ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, ¹³¹ I-BSA-MSN's en Na¹³¹ I, respectievelijk, toen het tumorvolume een diameter van ongeveer 10 mm had bereikt. Hetzelfde volume normale zoutoplossing werd toegediend als een controlegroep. Het tumorvolume werd geschat met behulp van de volgende formule:volume = 4π/3 (1/2 lengte × 1/2 breedte × 1/2 hoogte) [15, 29]. Het tumorvolume en het lichaamsgewicht van het dier werden elke 3 dagen gemeten. Muizen werden geëuthanaseerd als ze meer dan 20% van hun lichaamsgewicht verloren of stervende waren.

Histologisch onderzoek

Toen het experiment voorbij was, werden de muizen opgeofferd en werden de tumor en normale weefsels van de vier groepen, waaronder het hart, de lever, de milt, de nier en de long, geïsoleerd om hun histopathologie te bestuderen. In het kort werden 5 mm dikke paraffinesecties van was ontdaan met behulp van twee xyleen-incubaties (gedurende 30 minuten elk bij 56 ° C) en vervolgens opnieuw gehydrateerd in ethanol. De coupes werden vervolgens een nacht geweekt in 10% sucrose in gedestilleerd water. Daarna werden de coupes gewassen in 0,1 M PBS, pH 7,4, 30 minuten geïncubeerd in 1,2% waterstofperoxide in methanol en 15 minuten gespoeld in 0,1 M PBS, pH 7,4. De objectglaasjes van de tumoren werden vervolgens een nacht bij kamertemperatuur in een vochtige kamer geïncubeerd met anti-VEGFR2-antilichamen, verdunning 1:100. Na drie keer wassen met PBS werden de objectglaasjes 60 minuten geïncubeerd met het DAKO-REALTM En-Vision™-detectiesysteem, vervolgens zichtbaar gemaakt met diaminobenzidine en tegengekleurd met Mayer's hematoxyline. Alle afbeeldingen zijn gemaakt met een Olympus-microscoop.

Statistische analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), en statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 12.0 voor Windows (SPSS, Chicago, IL, VS). Gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van Kaplan-Meier-curven en de log-rank-test. Alle statistische tests waren tweezijdig en een P waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

De kenmerken van nanodeeltjes

De kenmerken van nanodeeltjes werden geanalyseerd en bepaald door TEM en DLS (Fig. 1a-c). Het TEM-beeld toonde aan dat de MSN's een uniforme sferische morfologie hadden, en het DLS-beeld toonde aan dat de MSN's uniform waren met een grootte van 108 ± 5.9 nm. BSA-modificatie en/of anti-VEGFR2-targeting veranderde de morfologie van de nanodeeltjes niet en resulteerde slechts in een lichte neiging om in oplossing te aggregeren in vergelijking met niet-gemodificeerde MSN's, wat mogelijk is veroorzaakt door het grotere oppervlak van de nanocomplexen. De diameter van de BSA-MSN's-anti-VEGFR2 nam iets toe tot 163 ± 4,6 nm, en de gemiddelde zeta-potentiaal van MSN's was -23,91 mV, wat veranderde in 28,45 mV voor BSA-MSN's-anti-VEGFR2. De verandering in zeta-potentiaal en de toename in grootte na oppervlaktemodificatie suggereerde de succesvolle toevoeging van BSA en anti-VEGFR2 op het oppervlak van de MSN's bij elke stap (tabel 1). De textuurkarakterisering van de MSN's werd verder bevestigd door de stikstofadsorptie-desorptie-isotherm. De MSN's hebben een goed gedefinieerde mesoporeuze structuur met een oppervlakte van 630,2 m² /g, en een gemiddelde poriediameter van 2,8 nm (Fig. 1d). De stabiliteit van BSA-MSN's-anti-VEGFR2-nanodeeltjes werd gedurende meerdere weken gevolgd en er werd geen duidelijke aggregatie waargenomen. Het aandeel van ¹³¹ Ik labelde was ongeveer 50-75%.

De kenmerken van nanodeeltjes. Kenmerken van MSN's (a ), BSA-MSN's (b ), BSA-MSNs-anti-VEGFR2 (c ), en stikstofadsorptie-desorptie-isotherm en Barrett-Joyner-Halenda (BJH) poriegrootteverdelingscurven van MSN's (d ). De transmissie-elektronenmicroscopiebeelden laten zien dat ze allemaal een regelmatige (uniforme bolvormige) morfologie hadden. De dynamische lichtverstrooiingsbeelden laten zien dat ze allemaal uniform waren, met gemiddelde afmetingen van respectievelijk 108 nm, 139 nm en 163 nm. BET- en BJH-analyses toonden typische type IV-isothermen aan, consistent met een mesoporeuze structuur

Opname van geconstrueerde nanodeeltjes

De binding van BSA-MSN's en BSA-MSN's-anti-VEGFR2 aan menselijke ATC-cellijn FRO-cellen werd getest met behulp van confocale microscopie (Fig. 2). Immunofluorescentie toonde aan dat zowel gerichte als niet-gerichte MSN's efficiënt konden binden aan FRO-cellen. Na 1 uur incubatie met BSA-MSN's of BSA-MSN's-anti-VEGFR2 was zichtbare fluorescentie aanwezig in de cellen, en die werd gehandhaafd en versterkt na 6 uur incubatie. Vergeleken met BSA-MSN's-anti-VEGFR2 konden BSA-MSN's ook aan cellen binden, maar we ontdekten dat de tumorcelretentie minimaal was en het groene fluorescentiesignaal zwak was. Dit resultaat suggereerde dat het doelgerichtheidsvermogen van de nanodeeltjes werd verbeterd door modificatie met het anti-VEGFR2-antilichaam.

Opname van geconstrueerde nanodeeltjes. Confocale laserscanningmicroscoopbeelden toonden cellulaire internalisatie van verschillende formuleringen na 1 en 6 uur voor BSA-MSN's en BSA-MSN's-anti-VEGFR2. Het fluorescerende signaal na 1 uur werd voor beide groepen na 6 uur verhoogd. Bovendien was de bindende groene fluorescentie in de anti-VEGFR2-gerichte groep sterker dan die in de niet-gerichte groep op beide tijdstippen

Tijdsafhankelijke cellulaire opname

Om de opname van radioactief jodium van Na¹³¹ . te bepalen Ik, ¹³¹ I-BSA-MSN en ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 naarmate de tijd verstreek, ¹³¹ I-getimede activiteitsmetingen werden verkregen in FRO-cellen. Zoals weergegeven in Afb. 3a, is de ¹³¹ De opname in deze cellijn bereikte zijn maximale niveau na 3 uur incubatie met ¹³¹ I-BSA-MSN's en na 5 u met ¹³¹ I-BSA-MSN's-anti-VEGFR2. Bovendien is de opname van radioactief jodium van ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 was hoger dan die van ¹³¹ I-BSA-MSN's.

Tijdsafhankelijke cellulaire opname en weefseldistributie. een De gegevens over tijdsafhankelijke cellulaire opname worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD van drie groepen. b Vergelijking van de gegevens over de biodistributie van ¹³¹ I in de tumor en belangrijke organen van ATC-tumordragende muizen 24 en 72 uur na intratumorale injectie van Na¹³¹ Ik, ¹³¹ I-BSA-MSN's en ¹³¹ I-BSA-MSN's-anti-VEGFR2. De radioactiviteit van tumorweefsel van de anti-VEGFR2-doelgroep 24 en 72 uur na intratumorale injectie (respectievelijk 32,2 ±-2,8% ID/g en 23,0 ± 1,8% ID/g) was significant hoger dan die van de niet-gerichte groep (26,1 ± respectievelijk 2,5% ID/g en 12,3 ±1,2% ID/g) (alle P < 0.05). Gegevens worden ook weergegeven als de gemiddelde ± SD voor de drie groepen

Weefselverdeling

De weefselverdeling van ¹³¹ I in naakte muizen werd gemeten met een γ teller op 24 en 72 uur na intratumorale injectie met de respectieve geneesmiddelen (figuur 3b). De resultaten onthulden dat de drie groepen een vergelijkbare accumulatie van straling in de normale weefsels hadden na 24 en 72 uur. De radioactiviteit voor alle groepen nam met de tijd geleidelijk af en werd meestal in de tumor opgehoopt. Bovendien is de accumulatie in het tumorweefsel 24 en 72 uur na injectie in de twee groepen met ¹³¹ I-gelabelde nanodeeltjes waren veel hoger dan die in de Na¹³¹ I-groep, die na 24 uur 11,6 ± 0,9% ID/g was en na 72 uur dramatisch daalde tot 2,1 ± 0,08% ID/g. De concentratie in de tumor van de anti-VEGFR2-doelgroep 24 en 72 uur na injectie was echter respectievelijk 32,2 ±-2,8% ID/g en 23,0 ±-1,8% ID/g, wat significant hoger was dan die van niet- doelgroep (respectievelijk 26,1 ± 2,5% ID/g en 12,3 ± 1,2% ID/g, allemaal P < 0.05).

In vivo beeldvorming

De ¹³¹ . bepalen Ik opname en distributie van nanodeeltjes en observeer de verblijftijd van ¹³¹ I in het tumorweefsel in vivo werden representatieve SPECT / CT-beelden van FRO-tumordragende muizen verkregen op verschillende tijdstippen na intratumorale injectie met de respectieve geneesmiddelen (figuur 4a). De resultaten toonden aan dat de radioactieve accumulatie in de Na¹³¹ I-groep werd 2 dagen na injectie snel uit de tumor uitgescheiden en werd 3 dagen na injectie niet gezien. De twee groepen met ¹³¹ . daarentegen I-gelabelde nanodeeltjes hadden een langzamere bloedklaring en een hogere accumulatie in het tumorweefsel, zelfs 2 weken na injectie, vooral in de anti-VEGFR2-doelgroep. Met name 3 weken na injectie was de radioactiviteit in de beoogde groep duidelijk sterker dan die in de niet-gerichte groep.

In vivo beeldvorming, in vivo ¹³¹ Ik therapie en overlevingsanalyse. een SPECT/CT-fused en driedimensionale beelden van ATC-tumordragende muizen verkregen op verschillende tijdstippen na intratumorale injectie met de respectieve geneesmiddelen. De radioactieve accumulatie in de Na¹³¹ I-groep werd 3 dagen na injectie niet gezien, maar was zelfs 3 weken na injectie duidelijk zichtbaar in de anti-VEGFR2-doelgroep. Tumorvolume (b ), lichaamsgewicht (c ) veranderingen en Kaplan-Meier-overlevingscurven (d ) in de FRO ATC-xenotransplantaatmodellen (n = 6/groep). Tumorgroei en verlies van lichaamsgewicht in de beoogde groep waren significant geremd in vergelijking met die in de niet-gerichte, Na¹³¹ I, of zoutgroep, respectievelijk. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SD van drie groepen en ze waren allemaal P < 0,05. Bovendien was de mediane overlevingstijd in de getargete groep (41 dagen) significant verlengd in vergelijking met die in de niet-getargete (34 dagen) of Na¹³¹ Ik (25 dagen) groepeer (alle P < 0,01)

In vivo ¹³¹ Ik Therapie

Figuur 4b toont het gemiddelde tumorvolume in de tijd in de vier groepen. Het tumorvolume vóór injectie werd als initiële referentie gebruikt. Behalve in de ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2-groep, de tumoren groeiden geleidelijk in alle groepen, vooral in de Na¹³¹ I en zoutgroepen. Op dag 24 was het gemiddelde tumorvolume in de Na¹³¹ De groepen I en zoutoplossing waren respectievelijk 296,6 ± 24,2% en 278,3 ± 19,3%, vergeleken met 198,7 ± 13,2% in de ¹³¹ I-BSA-MSNs-groep op dag 30. Interessant genoeg zagen we dat het volume in de anti-VEGFR2-doelgroep langzaam afnam na dag 9 na injectie en bijna daalde tot de oorspronkelijke referentie aan het einde van de observatie.

Figuur 4c toont de veranderingen in het lichaamsgewicht van de vier groepen. Het lichaamsgewicht nam geleidelijk af in de Na¹³¹ I en zoutgroepen tijdens de observatieperiode. De andere twee groepen verloren echter alleen gewicht in de eerste week, wat op latere tijdstippen werd herwonnen, vooral voor de anti-VEGFR2-doelgroep.

Overlevingsanalyse

In deze studie gebruikten we de overlevingskans als een andere maatstaf om de therapeutische effecten van ¹³¹ . te evalueren I-gelabelde nanodeeltjes. Afbeelding 4d toont de Kaplan-Meier-overlevingscurves na behandelingen met zoutoplossing, Na¹³¹ Ik, ¹³¹ I-BSA-MSN's, of ¹³¹ I-BSA-MSN's-anti-VEGFR2 in het ATC-tumordragende naaktmuismodel. Tumoren vorderden snel in de zoutoplossing en Na¹³¹ I-groepen, en de mediane overlevingstijd was respectievelijk 27 en 25 dagen. Analyse met een log-rank test toonde aan dat de mediane overlevingstijd in de ¹³¹ I-BSA-MSNs-groep (34 dagen) was significant langer in vergelijking met die in de Na¹³¹ Ik groepeer (P < 0,001). Bovendien vonden we dat de behandeling in de anti-VEGFR2-doelgroep (mediane overlevingstijd 41 dagen) resulteerde in significant betere overlevingsresultaten dan die in de niet-gerichte groep (P < 0.01).

Histopathologische analyse

Om het antitumoreffect van ¹³¹ . te evalueren I-gelabelde nanodeeltjes en test de potentiële toxiciteit van MSN's bij muizen, de belangrijkste organen en tumoren werden verzameld voor hematoxyline- en eosinekleuring na radiotherapie. Er werden geen significante pathologische veranderingen in de vitale organen waargenomen bij de tumordragende muizen na behandeling met ¹³¹ I-gelabelde nanodeeltjes (Fig. 5a). Dit gaf aan dat er geen duidelijke systemische toxiciteit was opgetreden binnen de observatieperiode. Bovendien waren de tumoren die werden behandeld met ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 vertoonde degeneratie en massale necrose van tumorcellen, wat duidelijker was dan dat in de ¹³¹ I-BSA-MSNs-groep. De tumor die werd behandeld met Na¹³¹ I of zoutgroep zat vol met levensvatbare tumorcellen. Immunohistochemische analyse van de tumor onthulde zichtbare expressie van VEGFR (Fig. 5b).

Histopathologische analyse. een Histopathologische analyse van belangrijke organen van FRO ATC tumordragende muizen na behandeling met ¹³¹ I-gelabelde nanodeeltjes. Er werden geen significante pathologische veranderingen in het hart, de lever, de longen en de nieren waargenomen. b Pathologisch onderzoek (H &E-kleuring) en immunohistochemische analyse van tumoren bij muizen. Grote fragmenten van de degeneratie en necrose van tumorcellen in de anti-VEGFR2-gerichte groep en kleine stukjes necrose met lage dichtheid in de ¹³¹ I-BSA-MSN's-groep worden weergegeven. Daarentegen werden alleen levensvatbare tumorcellen waargenomen in de Na¹³¹ I en zoutgroepen. Microfoto van immunohistochemische analyse toonde zichtbare expressie van VEGFR. Bar = 200 μm

Discussie

De prognose van ATC blijft slecht en er zijn tot nu toe geen effectieve behandelingsopties [1, 2, 6]. Gerichte moleculaire therapie, als een nieuwe therapie, heeft de morbiditeit en mortaliteit van veel kankers verbeterd [23, 24]. VEGFR is crucial to microvascular formation, which facilitates the growth of most malignancies, and allows continued tumor expansion [9, 10]. In this study, we evaluated the efficacies of Na¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs, and ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 for the treatment of ATC in tumor-bearing nude mouse models. The results demonstrated that both anti-VEGFR2 targeted and non-targeted nanoparticles labeled with ¹³¹ I were effective in delaying the tumor growth of ATC and that the ¹³¹ I-labeling anti-VEGFR2 targeted MSNs was the most effective agent to inhibit the tumor growth in nude mice and prolonging median survival. This treatment modality might represent a novel therapeutic option for ATC.

VEGFR targeting with nanoparticles is rarely reported in the literature. Goel S et al. [19] confirmed that VEGFR targeting using VEGF₁₂₁ conjugated, anti-VEGFR therapeutics-loaded MSNs represented a major advance for angiogenesis imaging and inhibition in human glioblastoma. A study performed by Gule indicated that inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) and VEGFR2 in ATC using vandetanib causes significant tumor growth inhibition in vivo in an orthotopic xenograft model [15]. In the present study, using confocal microscopy, we found that both targeted and non-targeted nanoparticles could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells, and further confirmed that the targeting ability of the nanoparticles was enhanced via modification with the anti-VEGFR2 antibody, which result was consistent with that of the time-dependent cellular uptake experiment. Additionally, after intratumoral injection with the respective drugs, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I in the tumor-bearing nude mice at 24 and 72 h for the different groups. The radioactivity for all groups was mostly accumulated in the tumor and gradually decreased with time. Moreover, we found that the radioactivity in anti-VEGFR2 targeted group could be retained for longer time in the tumor in comparison with non-targeted group, which was also consistent with the results observed by confocal microscopy.

SPECT/CT is a powerful tool to provide both structural and functional imaging information for diseases, and can monitor the metabolism of radioactive drugs at different times post injection [30,31,32]. In the present study, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I using SPECT/CT. The results showed that radioactive accumulation in the Na¹³¹ I group was not seen at 3 day post-injection. However, higher accumulation in the tumor tissue was observed at 2 weeks post-injection for the two groups with ¹³¹ I-labeled nanoparticles, and at 3 weeks the radioactive signal in the anti-VEGFR2 targeted group was apparently stronger than that in the non-targeted group. We hypothesized that the passive tumor targeting of MSNs, which relies on unpredictable tumor extravasation and enhanced permeability retention effect, and positive targeting linked with anti-VEGFR-2, associated with VEGFR2 overexpression in ATC, played a key role in enhancing the retention of the nanoparticles in the tumors. This finding revealed that anti-VEGFR2 modification prolonged the retention time of ¹³¹ I in the tumor tissue compared with that of free Na¹³¹ I and ¹³¹ I-BSA-MSN, which was also similar to the tissue biodistribution of ¹³¹ I measured by γ counter.

In the present study, we monitored the body weight change of nude mice after intratumoral injection with a single dose of 2 mCi ¹³¹ I, which showed that the body weight in the ¹³¹ I-labeled nanoparticle groups gradually increased at 1 week post-injection, especially for the anti-VEGFR2 targeted group. Similarly, we also observed the changes in tumor volume and found that the tumors in the Na¹³¹ I or saline group grew rapidly, while the volume in ¹³¹ I-BSA-MSNs group increased slowly. Interestingly, the tumors in anti-VEGFR2 targeted group gradually decreased after 1 week post-injection, which was contrary to the body weight change. These results indicated that the anti-VEGFR2 modification could effectively inhibit the increase in tumor volume and thereby enhanced the efficiency of ¹³¹ I therapy. We considered that the tumor necrosis was caused by the beta rays emitted from ¹³¹ I, which resulted in tumor shrinkage and indirectly led to an increase in body weight. This effect, we speculated, began to appear mainly 1 week after injection of ¹³¹ I.

Our findings indicated that the treatment mediated by intratumorally injected ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 resulted in significant tumor growth delay, which was confirmed increased structural damage and massive necrosis in tumor tissue compared with that in the ¹³¹ I-BSA-MSNs group. Significantly, this higher antitumor activity was achieved without causing apparent systemic toxic effects, as indicated by the lack of significant pathological changes in the vital organs observed in tumor-bearing nude mice. Although further studies are needed to document both the acute and chronic toxicological effects, ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 exhibited several properties that made them a promising candidate for minimally invasive therapy for ATC.

In our pre-experiment, injection into the tail vein was performed and the results showed that the radioactivity was mainly distributed in the phagocytosis system. Intratumoral injection was used in some studies [29, 33, 34], and the operation is more convenient. Therefore, we used intratumoral injection as the injection method and also achieved better results. MSNs offer a promising approach to overcome the insolubility issue and deliver large payloads of hydrophobic small molecule drugs. Currently, we are investigating the potential for loading targeted anti-cancer drugs using MSNs. We will provide the results in the future publication.

Conclusions

In the present study, we successfully synthesized BSA-MSNs-anti-VEGFR2, with uniform spherical morphology, and which were radiolabeled with ¹³¹ I using the Chloramine-T method. The results showed that both targeted and non-targeted MSNs could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells. The radioactivity in ATC tumor-bearing nude mouse model was mostly accumulated in the tumor and could be retained a longer time in the ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 group. Additionally, the tissue distribution of ¹³¹ I could be also imaged and validated using SPECT/CT. Moreover, tumor growth in the ATC tumor-bearing nude mouse model was significantly inhibited by the anti-VEGFR2 targeted MSNs compared with that achieved using non-targeted MSNs and the ¹³¹ I treatment with anti-VEGFR2 targeting MSNs significantly prolonged the survival of ATC tumor-bearing mice. Our data supported the view that such an approach may represent a more effective means to treat ATC.