Depositie van antilichaam-gemodificeerde upconversie-nanodeeltjes op glas door een laserondersteunde methode om de prestaties van celcultuur te verbeteren

Resultaten en discussie

Karakterisatie van UCNP's/UCNPs-IgG vóór MAPLE-afzetting

IgG-antilichamen werden geconjugeerd aan amine-gemodificeerde UCNP's via amidebindingen. De UCNP's met/zonder IgG werden gekarakteriseerd door TEM. Figuur 3a is de TEM-microfoto van kubieke UCNP's. De gemiddelde grootte van de UCNP's wordt geschat op 50 ±  8 nm. De kleine inzet van figuur 3a is de microfoto van TEM met hoge resolutie (HRTEM). UCNP's hebben zeer kristallijne structuren. De gemeten interplanaire afstand tussen twee aangrenzende roostervlakken was 0,312 nm, wat overeenkomt met een (1 1 1) vlak van kubische fase NaGdF₄ (JCPDS 27-0697). Figuur 3b is de TEM-microfoto van UCNP's geconjugeerd met IgG (UCNPs-IgG). De met antilichamen gemodificeerde UCNP's behielden de kubische vorm en de gemiddelde deeltjesgrootte is ongeveer 54 ± 8 nm. De IgG-antilichamen die op UCNP's zijn gebioconjugeerd, kunnen direct door TEM worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 3b, gemarkeerd met een rode cirkel. De grootte van de IgG-antilichamen is ongeveer 10 ± 5 nm, wat vergelijkbaar is met de theoretische berekening en experimentele metingen [44, 45].

TEM-microfoto's van a UCNP's en b UCNPs-IgG vóór afzetting van MAPLE

De kristalstructuur van UCNP's (NaGdF₄ :Yb ³⁺ , Er ³⁺ ) werd onthuld door röntgenpoederdiffractie (XRD) patroon zoals getoond in Fig. 4. Vier pieken bij 32 °, 37 °, 54 ° en 65 ° in XRD-profiel worden toegeschreven aan (111), (200), ( 220), en (311) kristalvlakken, wat hetzelfde is met het standaard XRD-patroon van kubische fase NaGdF₄ (JCPDS 27-0697) en referenties [36, 37]. Zowel HRTEM- als XRD-metingen bevestigen de kristalstructuur van de UCNP's.

XRD-profiel van NaGdF₄ :Er ³⁺ , Yb ³⁺ opconversie nanodeeltjes

Om de bioconjugatie van IgG op UCNP's verder te onderzoeken, werd Fourier-transform infraroodspectroscopie (FTIR) gebruikt. Zoals getoond in Fig. 5, worden de buigtrillingsbanden van aminegroepen waargenomen bij 1515 cm ⁻¹ en 1511 cm ⁻¹ in de spectra van UCNP's en UCNP's-IgG, aangezien zowel de PEI- als IgG-antilichamen aminogroepen bezitten. De pieken op 2987 cm ⁻¹ , 2900 cm ⁻¹ , en 1400 cm ⁻¹ kan worden toegeschreven aan de uitrekkende trillingen van -CH₂ - en C-C bindingen, respectievelijk. De uitrekkende trillingsband van de hydroxylgroep (-OH) wordt waargenomen bij 3673 cm ⁻¹ in het spectrum van UCNPs-IgG vanwege de carboxylgroep van IgG. De piek op 1249 cm ⁻¹ en 1650 cm ⁻¹ worden toegeschreven aan de uitrekkende trillingsbanden van respectievelijk de koolstof-zuurstofbinding en amidebinding in het spectrum van de IgG-gemodificeerde UCNP's. Deze pieken onthullen de aanwezigheid van de IgG-antilichamen op het oppervlak van de UCNPs-IgG.

FTIR-spectra van respectievelijk UCNP's-IgG en UCNP's, gemaakt door een eenpotproces

Karakterisering van UCNP's met/zonder IgG na MAPLE-afzetting

UCNP's en UCNP's-IgG werden door het MAPLE-proces afgezet op celkweekschalen met de glazen bodem. Het oppervlak van glas voor en na de afzetting van respectievelijk UCNP's en UCNPs-IgG werd gekarakteriseerd door de energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDX). Figuur 6 toont de aanwezigheid van elementen van gadolinium (Gd), erbium (Er), ytterbium (Yb) en fluor (F) in glasmonsters gecoat met UCNP's (Fig. 6a) en UCNPs-IgG (Fig. 6b), respectievelijk. Bovendien werd de fotoluminescentie van UCNP's en UCNP's-IgG na de MAPLE-afzetting met een langere bestralingstijd gemeten. Zowel groene (540 nm) als rode (650 nm) emissies kunnen worden waargenomen onder de excitatie van 980 nm, zoals weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S1 in het ondersteunende bestand. Opgemerkt wordt dat de intensiteit van de emissie enigszins verschilt tussen monsters van UCNP's met en zonder IgG, wat kan worden veroorzaakt door de oppervlaktedefecten of de meetfout. Er zal verder onderzoek worden gedaan. Bijgevolg kan de MAPLE-afzetting de structuur en eigenschappen van UCNP's met/zonder IgG behouden.

EDX-spectra van a monsters na MAPLE-behandeling en b monsters zonder MAPLE-behandeling (kaal glas)

FTIR werd gebruikt om UCNPS- en UCNPs-IgG-coatings gemaakt met de MAPLE-techniek te onderzoeken in vergelijking met het blote glasmonster. De FTIR-spectra van de monsters die zijn gedeponeerd met UCNP's, UCNP's-IgG door de MAPLE-afzetting en een blanco monster (kaal glassubstraat) worden weergegeven in Fig. 7. De uitrekkende trillingsbanden van -OH-groepen op 3648 cm ⁻¹ wordt toegeschreven aan de carboxylgroep van IgG, die alleen wordt waargenomen in spectrum-1, d.w.z. UCNPs-IgG-coating. Dit resultaat geeft het bestaan ​​van de UCNP-IgG op het oppervlak van substraten aan. In spectrum-2 (UCNPs-coating), de buigtrillingsband bij 1575 cm ⁻¹ wordt toegeschreven aan de aminegroep die is gemodificeerd op de UCNP's, terwijl de buigende vibratieband van de aminegroep nauwelijks wordt waargenomen in spectrum-1 (UCNPs-IgG) vanwege de succesvolle bioconjugatie. Bijgevolg is de MAPLE-techniek in staat om de eigenschappen en microstructuren van met antilichamen gemodificeerde UCNP's te behouden.

FTIR-spectra van blank glas en glas gecoat met respectievelijk UCNP's-IgG en UCNP's

Vergeleken met het spectrum van het kale glas (spectrum-3), zijn de strekkende trillingsbanden van methyleengroepen ongeveer 2985 cm ⁻¹ en 2900 cm ⁻¹ in zowel spectrum-1 als spectrum-2 vanwege de op koolstof gebaseerde functionele groepen op het oppervlak van UCNP's. Opgemerkt wordt dat de pieken van coatings in Fig. 7 aanzienlijk zwakker zijn dan de pieken in Fig. 5 die worden veroorzaakt door de lage hoeveelheden nanodeeltjes die zijn afgezet op het substraatoppervlak, en de veranderingen van spectra bij 1250 cm -1 in Fig. 7 in vergelijking met Fig. 5 komt voort uit het effect van glassubstraat.

Celgedrag op de verschillende coatings

Traditionele methoden voor HUVEC-cellen vereisen het coaten van een eiwitlaag die wordt gebruikt als onze controle bij de studie van de celcultuurprestaties. Daarom zijn er in dit onderzoek drie verschillende coatings (1) controle (glas bedekt met gelatine), (2) glas bedekt met UCNP's en (3) glas bedekt met UCNP's-IgG. Figuur 8 presenteert de confocale Microscoop-microfoto's van cellen die 24 uur op verschillende oppervlakken zijn gekweekt. De hoeveelheden HUVEC's die groeien op het oppervlak dat is gecoat met respectievelijk UCNP's en UCNP's-IgG, zijn vergelijkbaar met die van controle. Het gedrag van HUVEC-cellen die groeien op de oppervlakken die zijn gemodificeerd met UCNP's-IgG, is echter dramatisch verbeterd in de eerste kweekperiode van 24 uur. Het celgroeigedrag binnen de kweekperiode omvatte het gebied van de cellen, de lengte van verbindingen, de lengte van cellen en het totale aantal cellen op het oppervlak van de monsters werden onderzocht en geanalyseerd.

Confocale microfoto's van HUVEC's op het oppervlak van a controle, b UCNP's en c IgG-gemodificeerde UCNP's

Figuur 9 toont de statistische analyse van het celgedrag na 24-uurs kweken op de drie verschillende oppervlakken. Het gebied van de cellen (Fig. 9a), de lengte van verbindingen (Fig. 9b), de lengte van cellen (Fig. 9c) en het aantal cellen (Fig. 9d) werden onderzocht door de ImageJ-software. De lengtes van de cellen worden gedefinieerd als de grootste lengtewaarde van deze cel. De lengte van de verbinding wordt gedefinieerd als de afstand tussen de rand van de uiteinden van de cel en de celkernen. Vergeleken met dat van cellen die groeien op een controlemonster, neemt het celoppervlak van HUVEC-cellen op het oppervlak gemodificeerd met UCNP's en UCNP's-IgG toe met respectievelijk 11,2% en 22,2%; de lengte van verbindingen van HUVEC-cellen op het oppervlak gemodificeerd met UCNP's en UCNP's-IgG neemt toe met 12,5% en 17,5%; en de lengte van HUVEC-cellen op het oppervlak gemodificeerd met UCNP's en UCNP's-IgG neemt toe met 8,2% en 17,3%. Bovendien laten de geanalyseerde resultaten van het aantal cellen zien dat de hoeveelheid cellen op het oppervlak van het op UCNP's gebaseerde monster ongeveer 8% hoger is dan dat van de controle. Deze resultaten geven aan dat zowel UCNPs-monsters als UCNPs-IgG-monsters biocompatibel zijn met de HUVECs-cellen die consistent zijn met de eerdere werken [38]. De groei van HUVEC-cellen gekweekt op het oppervlak afgezet met UCNP's en UCNP's-IgG is bevorderd in termen van celoppervlak, cellengte en de lengte van de verbinding. Eerdere studies geven aan dat nanostructuren endotheliale activering van HUVEC-cellen kunnen veroorzaken [2,3,4, 39]. Er is gemeld dat het vrijkomen van ontstekingsmediatoren en opregulatie van adhesiemoleculen van HUVEC's zou worden waargenomen bij blootstelling aan een verscheidenheid aan nanodeeltjes [40]. Ontstekingsmediatoren zouden de angiogenese- en pro-angiogenese-effecten kunnen bevorderen op basis van de eerdere onderzoeken [2, 41]. Bovendien geeft recent werk aan dat IgG de angiogenese-achtige transformatie van HUVEC's [3] zou kunnen bevorderen.

HUVEC's gekweekt op verschillende coatings, waaronder controle, UCNP's, UCNP's-IgG:a celgebied, b lengte celverbinding, c cellengte, en d aantal cellen

Effect van de coating van UCNP's met/zonder IgG op de levensvatbaarheid van cellen

De levensvatbaarheid van de cellen werd bestudeerd met behulp van HUVEC-cellen die op de verschillende oppervlakken waren gekweekt. Figuur 10 toont de relatieve levensvatbaarheid van de cellen op verschillende oppervlakken:controle (glas bedekt met gelatine), kaal glas, UCNP's afgezet op glassubstraten en UCNPs-IgG afgezet op glassubstraten. De relatieve levensvatbaarheid van de cellen van het kale glas, glas gecoat met UCNP's en glas gecoat met UCNP's-IgG waren respectievelijk 99,6%, 105,44% en 103,96%. Sommige onderzoeken tonen aan dat PEI met een hoge concentratie een toxisch effect kan hebben, vooral bij toepassing in hoge concentraties, maar het gebruik van PEI als ligand is acceptabel en vertoont een verwaarloosbare cytotoxiciteit [44,45,46,47]. Door het mechanisme van MAPLE is de hoeveelheid UCNPs/UCNPs-IgG op het substraatoppervlak veel lager dan de drempelwaarde (1 mg/ml). Het is duidelijk dat de afzetting van UCNP's en UCNP's-IgG op het glas door MAPLE geen toxische effecten op de HUVEC-cellen heeft. Opgemerkt wordt dat biocompatibele materialen normaal gesproken een relatieve cellevensvatbaarheid (>  85%) van cellen kunnen hebben. [8]

Levensvatbaarheid van de cellen van HUVEC-cellen die groeien op kaal glas, coatings met respectievelijk UCNP's en UCNPs-IgG en glas bedekt met gelatine dat als controle wordt gebruikt