Een nieuw contrastmiddel op basis van magnetische nanodeeltjes voor cholesteroldetectie als biomarker voor de ziekte van Alzheimer

Abstract

Achtergrond

Gezien de hoge incidentie van de ziekte van Alzheimer onder de wereldbevolking door de jaren heen, en de kosten die de ziekte in hygiënische en sociale termen voor landen met zich meebrengt, is het noodzakelijk om niet-invasieve diagnostische tests te ontwikkelen waarmee vroege biomarkers van de ziekte kunnen worden opgespoord. Binnen de vroege diagnosemethoden wordt de ontwikkeling van contrastmiddelen voor magnetische resonantiebeeldvorming bijzonder nuttig.

Accumulerend bewijs suggereert dat cholesterol een rol kan spelen in de pathogenese van de ziekte van Alzheimer, aangezien abnormale afzettingen van cholesterol rond seniele plaques zijn beschreven in transgene diermodellen en patiënten met de ziekte van Alzheimer. In vivo experimenten hebben ook aangetoond dat door voeding geïnduceerde hypercholesterolemie de intraneuronale accumulatie van β-amyloïde eiwit, vergezeld van microgliose, versterkt en de afzetting van β-amyloïde in de hersenen versnelt.

Presentatie van de hypothese

In de huidige studie stellen we voor de eerste keer de synthese voor van een nieuw nanoconjugaat bestaande uit magnetische nanodeeltjes gebonden aan een anti-cholesterolantilichaam, om de abnormale afzettingen van cholesterol waargenomen in seniele plaques bij de ziekte van Alzheimer te detecteren door middel van magnetische resonantiebeeldvorming. Het nanoplatform zou ook de afname van cholesterol kunnen onthullen die wordt waargenomen in neuronale plasmamembranen geassocieerd met deze pathologie.

De hypothese testen

Experimenteel ontwerp om de hypothese te testen zal eerst in vitro worden gedaan en vervolgens in ex vivo en in vivo studies in een tweede fase.

Implicaties van de hypothese

Het ontworpen nanoplatform zou daarom cholesterolafzettingen op cerebraal niveau kunnen detecteren. De detectie van deze biomarker in gebieden die samenvallen met opeenhoping van seniele plaques zou vroege informatie kunnen verschaffen over het begin en de progressie van de ziekte van Alzheimer.

Achtergrond

Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat de aanwezigheid van een geschikte hoeveelheid cholesterol (CHO) in het neuronale plasmamembraan een sleutelrol speelt bij de bescherming van zenuwcellen tegen de toxiciteit van β-amyloïde-eiwit bij de ziekte van Alzheimer (AD), door de overmatige productie van dit eiwit tegen te gaan [1,2,3]; neuronen verrijkt met CHO zijn beter bestand tegen oxidatieve stress en de toxiciteit van β-amyloïde eiwit [4, 5].

Daarom kan worden aangenomen dat de hoeveelheid CHO die aanwezig is in het neuronale plasmamembraan, en niet alleen de plasmaspiegels, een rol kan spelen bij de pathogenese van neurodegeneratieve ziekten [6]. In feite ondersteunen experimentele gegevens het idee dat een optimale hoeveelheid CHO in celmembranen nodig is om een beschermende barrière tegen giftige stoffen te creëren. Een verminderde hoeveelheid cellulair CHO in het plasmamembraan verandert deze beschermende barrière, waardoor de bescherming tegen toxische stoffen, waaronder het β-amyloïde eiwit [7] vermindert. Interessant is dat neuronen in de hersenschors van transgene AD-muizen minder CHO in het plasmamembraan bevatten dan die van wildtype muizen [8].

Mori et al. [9] toonde aan dat zowel bij mensen als bij transgene amyloid precursor protein (APP) muizen, CHO abnormaal wordt geaccumuleerd in rijpe amyloïde plaques, maar niet in diffuse of onrijpe plaques, wat suggereert dat CHO een rol zou kunnen spelen bij de vorming en progressie van seniele plaques. Andere vervolgstudies vonden dat CHO en apolipoproteïne E in een vroeg stadium in de kern van de fibrillaire plaques aanwezig waren, maar niet in de diffuse plaques. In meer gevorderde stadia van de ziekte werd een hoger aantal fibrillaire plaques beschreven die immunopositief waren voor cholesteroloxidase [10]. De hoeveelheid vrij CHO per seniele plaque, bepaald met massaspectrometrie, was vergelijkbaar met de -amyloïde eiwitbelasting [8]. Deze wederzijdse toename van de concentratie van CHO en seniele plaques bij AD zou een nieuw pathogeen mechanisme van de ziekte kunnen suggereren [11]. Bovendien zijn in de hersenweefsels van AD-patiënten lipideafzettingen beschreven die samen met fibrillaire seniele plaques co-lokaliseren met behulp van anti-Stokes Raman-verstrooiing en 2-fotonfluorescentiemicroscopie in met Thioflavine-S gekleurde monsters [10]. Er kunnen twee lipidemorfologieën worden waargenomen:lamellaire structuren en samenvloeiende macro-aggregaten van submicrongroottes. Aangezien de lipidensamenstelling/-organisatie door de plaques heen varieert, is er duidelijk bewijs van een nauw samenspel van amyloïde-lipiden in fibrillaire seniele plaques, waardoor ze een meer dynamische samenstelling hebben dan eerder werd gedacht [12].

Verder, om biomarkers van AD in vroege stadia van de ziekte te detecteren, hebben verschillende onderzoeken het gebruik voorgesteld van gefunctionaliseerde magnetische ijzeroxide-nanodeeltjes (MNP's) als specifieke contrastmiddelen voor magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) voor seniele plaques [13,14, 15] en ferritine-eiwit [16] detectie. Het hypointense effect dat deze deeltjes vertonen in T2- en T2*-gewogen sequenties zorgt voor een groter contrast in MRI-beelden. Daarom is het gebruik van MNP's als contrastmiddelen voor MRI een veelbelovende methode voor de vroege diagnose van AD.

Het huidige werk presenteert de hypothese van het gebruik van een nieuw contrast op basis van biogefunctionaliseerde MNP's, voor de detectie door MRI van abnormale ophopingen van CHO in de seniele plaques, die kunnen worden gebruikt als een potentiële biomarker van AD.

Het huidige werk presenteert voor het eerst, voor zover wij weten, het ontwerp van een nieuw contrastmiddel op basis van biogefunctionaliseerde MNP's voor de detectie door MRI van abnormale ophopingen van CHO in de seniele plaques, die kunnen worden gebruikt als een potentiële biomarker van AD .

De hypothese

Vanwege de hoge incidentie van AD onder de wereldbevolking door de jaren heen [17], en de bijbehorende kosten van pathologie in gezondheids- en sociale termen voor landen [17], is het dringend noodzakelijk om niet-invasieve instrumenten te ontwikkelen die de detectie van vroege biomarkers voor diagnose en evolutie van de ziekte.

Binnen de vroege diagnosemethoden wordt de ontwikkeling van contrastmiddelen voor moleculaire beeldvorming (MI) bijzonder nuttig. MI combineert conventionele beeldvormingstechnologieën met moleculaire sondes, die zijn ontworpen om aspecten van biochemie en celbiologie te detecteren die ten grondslag liggen aan ziekteprogressie en behandelingsrespons [18,19,20].

We stellen de synthese voor van een contrastmiddel op basis van MNP's bedekt met polyethyleenglycol (PEG) en gefunctionaliseerd met streptavidine (Fig. 1a) om de directionele koppeling mogelijk te maken van een gebiotinyleerd antilichaam dat specifiek de CHO herkent die aanwezig is in de seniele plaques (NANOCHOAD) ( Afb. 1b). Het antilichaam zal ook de CHO herkennen die aanwezig is in het cellulaire plasmamembraan en zo de afname van CHO in neuronale plasmamembranen detecteren. MNP's zullen worden gecoat met PEG-ketens om de colloïdale stabiliteit van het nanoplatform te verbeteren, de verspreiding ervan in de bloedbaan en de doorgang door de bloed-hersenbarrière (BBB) [21] te vergemakkelijken.

Schematisch diagram van het ontworpen nanoplatform en zijn werkingsmechanisme. een de structuur van MNP, en functionalisering met anti-CHO antilichaam (NANOCHOAD), b strategieën voor penetratie van het nanoplatform via BBB, c Kruisingsmechanisme door de BBB van NANOCHOAD. d nanoconjugaat anti-CHO-MNP gericht op CHO-afzettingen op amyloïde plaques

De BBB vertegenwoordigt een van de meest exclusieve biologische barrières die men tegenkomt bij de behandeling en diagnose van neurologische ziekten, waardoor de toegang van de meeste diagnostische en therapeutische middelen tot de hersenen via de systemische route wordt beperkt [22, 23]. Daarom is de uitdaging bij de diagnose en behandeling van een groot aantal hersenaandoeningen het overwinnen van de moeilijkheid om therapeutische en contrastmiddelen via de BBB te leveren om zich op concrete hersengebieden te richten. Gelukkig vertonen capillaire endotheelcellen van de hersenen enkele specifieke receptor-gemedieerde transportmechanismen. Er is gedocumenteerd dat een groot aantal transferrinereceptoren tot expressie wordt gebracht door capillaire endotheelcellen van de hersenen, die betrokken zijn bij receptor-gemedieerde transcytose via de BBB [24].

Om het probleem van het passeren van het contrastmiddel door de BBB op te lossen, stellen we daarom drie alternatieve strategieën voor:(i) om de anti-CHO-MNP's te conjugeren met transferrine [25], waardoor het door BBB zou kunnen gaan; (ii) de intranasale toediening van het anti-CHO-MNP-conjugaat. De intranasale route, die niet-invasief is en de BBB omzeilt, is een alternatieve route voor het afleveren van nanoconjugaten aan de hersenen [26, 27]; en (iii) de toepassing van externe magnetische velden om het nanoconjugaat te vergemakkelijken om de BBB te passeren (figuur 2c). Deze nieuwe toedieningstechniek kan klinisch relevante dosering aan de hersenen (olfactorische regio, cortex, hippocampus ...) leveren via BBB [28,29,30] (Fig. 1c). Bovendien zou de passage van het nanoconjugaat door de BBB ook worden bevorderd door zowel het gebruik van PEG-gecoate MNP's als de verslechtering van de BBB als gevolg van pathologie zelf. Het nanoconjugaat zal specifiek abnormale afzettingen van CHO in seniele plaques herkennen, door de antigeen-antilichaamaffiniteit (Fig. 1c, d). De accumulatie van nanodeeltjes in pathologische structuren in het hersenparenchym als seniele plaques zou wijzen op veranderingen van CHO-lokalisatie in AD-hersenparenchym. Daarom zal de aanwezigheid van anti-CHO-MNP's geassocieerd met de seniele plaques hypointense signalen vertonen in T2*-gewogen MRI, waardoor de CHO kan worden gedetecteerd die geassocieerd is met andere gevestigde kenmerken van de AD, zoals seniele plaques, en dus MR-beeldvorming van hersenen CHO zou een nieuwe biomarker van de ziekte kunnen worden. Bovendien worden veranderingen in MRI verwacht als gevolg van een afname van het CHO-plasmamembraan.

Experimenteel ontwerp om de hypothese te testen. Ten eerste, in vitro (a ):bepaling van de biocompatibiliteit van het gesynthetiseerde nanoconjugaat. Ex vivo-test (b ):testen van de specificiteit van anti-CHO-MNP's nanoconjugaat door incubatie van nanoplatform op vaste hersenplakjes van 5XFAD transgene muizen. In-vivo-onderzoeken (c ):het nanoplatform zal intraveneus of via alternatieve routes worden geïnjecteerd als intranasale toediening/externe magnetische veldtoepassing, en de effectiviteit (targeting) zal worden geëvalueerd door MRI

De klaring van het contrastmiddel uit het hersenparenchym zou kunnen worden bereikt door de internalisering van de MNP's door microgliale cellen en hun daaropvolgende lysosomale verwerking, zoals aangetoond in eerdere onderzoeken [16, 31, 32]. MNP's zullen worden geëlimineerd via de gebruikelijke routes die worden gebruikt voor het metabolisme van endogeen ijzer. Desalniettemin zullen de eliminatieroutes van de contrastmiddelen, op basis van hun grootte en oppervlaktelading, en hun potentiële toxiciteit worden bepaald tijdens de ontwikkeling van de voorgestelde hypothese, zoals hieronder beschreven.

De hypothese testen

Synthese en karakterisering van magnetische nanodeeltjes

De synthese van ijzeroxide nanodeeltjes zal worden uitgevoerd met behulp van een gecontroleerde co-precipitatiemethode, door het mengen van ferro-ionen (Fe2+) en ferri-ionen (Fe3+) in alkalische oplossing volgens het werk van Predescu et al. [33]. MNP's zullen worden gecoat met een PEG-schaal volgens het protocol dat eerder is vastgesteld door Liu et al. [34].

De structuur, morfologie en magnetisme van de met PEG gecoate ijzeren nanodeeltjes zullen worden onderzocht met behulp van röntgendiffractie (XRD), scanning elektronenmicroscopie (SEM), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), Fourier-transform infraroodspectroscopie (FTIR), en supergeleidende kwantuminterferentie-apparaat (SQUID) magnetometrie.

Na karakterisering van het gesynthetiseerde magnetische nanomateriaal, zal het gefunctionaliseerd worden met (1) streptavidine-eiwit volgens de NHS/EDC-methode. Hierna wordt het gekoppeld aan een gebiotinyleerd anti-CHO-antilichaam en (2) transferrine-eiwit. Transferrineconjugatie zal worden uitgevoerd door de carboxylgroep die aanwezig is op het oppervlak van de ligand en de hydroxylgroep die aanwezig is op de PEG-coating te koppelen [35].

In vitro testen

In een eerste stap zal de biocompatibiliteit van het nanoplatform in vitro worden getest (Fig. 2a). Het nanoconjugaat zal worden toegevoegd aan co-culturen van neuronen en astrocyten en aan endotheelcelculturen [36] om de compatibiliteit van het nanoconjugaat met typische hersencellen te bepalen. Als de cytocompatibiliteit van de gefunctionaliseerde MNP's correct is, zal de effectiviteit van het systeem worden getest in een ex vivo model van de ziekte (Fig. 2b). Het geselecteerde model is een APP/(preseniline-1) PS1 dubbele transgene muis die vijf familiale AD-mutaties (5XFAD) tot co-expressie brengt en een amyloïde plaque-pathologie vertoont die vergelijkbaar is met die gevonden in AD [37].

De accumulatie van CHO rond de seniele plaques in het 5XFAD transgene model zal worden geëvalueerd door middel van immunohistochemie.

Als het model geldig is, wordt voorgesteld om, zodra de accumulatie van CHO in de seniele plaques is aangetoond, de specificiteit van het gesynthetiseerde nanoconjugaat te testen. Hiervoor zullen eerst vaste hersenplakjes worden verkregen van de 5XFAD transgene muizen, en vervolgens zal het op hen worden geprobeerd de vereniging van het nanoconjugaat, waarbij de anti-CHO-MNP's op de vaste hersensecties van 5XFAD-muizen worden geïncubeerd. De specificiteit van het nanoconjugaat zal worden bepaald door de colokalisatie van de anti-CHO-MNP's met de CHO-afzettingen en de seniele plaques die aanwezig zijn in de 5XFAD-hersensecties te evalueren, waarbij de toegewezen controles worden uitgevoerd. In het geval dat er geen duidelijke cholesterolophopingen in 5XFAD werden gedetecteerd, een alternatieve Zweedse mutatie op het muismodel van het amyloïde precursoreiwit (APP_sw ), muismodel van AD, zal worden gebruikt, aangezien in dit model een accumulatie van CHO duidelijk geassocieerd met amyloïde plaques is beschreven in de hippocampus [9].

In vivo testen

Zodra de specificiteit van het conjugaat is aangetoond, zullen de biocompatibiliteitsanalyses van het nanocojugaat in vivo worden uitgevoerd. Het nanoplatform zou intraveneus worden geïnjecteerd in verschillende doses (variërend van 25 tot 100 mg/kg [38]) (Fig. 2c), en de subacute toxiciteit in de loop van het onderzoek zal worden geanalyseerd door het observeren van mortaliteit, bewijzen van atrofie , congestie, ontsteking of grove gedragsveranderingen bij muizen. De gewichtscoëfficiënt van elk orgaan ten opzichte van het lichaam wordt berekend. Niertoxiciteit zal worden bepaald door de niveaus van ureumstikstof en creatinine in het bloed. De niveaus van totaal bilirubine en alkalische fosfatase in het bloed zouden kunnen worden getest als een maat voor de lever- en galfunctie. Daarnaast zullen de niveaus van urinezuur en hematologische studies worden bepaald om veranderingen in de niveaus van rode bloedcellen, witte bloedcellen en hemoglobine te beoordelen. Ten slotte zal, om meer in detail te zoeken naar mogelijke toxische effecten, histologisch onderzoek van verschillende weefsels (nier, lever, milt, hersenen of longen) worden uitgevoerd [39]. De locatie van de gefunctionaliseerde MNP's in bloed, urine en verschillende organen zou worden geanalyseerd 24 uur, 72 uur, 1 week, 2 weken en 1 maand na injectie met anti-CHO-MNP's.

Zodra de juiste concentratie van MNP's is bepaald, wordt het nanoplatform geïnjecteerd in controle- en 5XFAD-muizen, en de effectiviteit ervan zal worden geëvalueerd door MRI (figuur 2c). Als het antilichaam van nanoplatform het antigeen in het in vivo systeem niet herkent, dan kunnen de MNP's worden gefunctionaliseerd met fenyl-diyne cholesterol, een verbinding waarvan in eerdere onderzoeken is aangetoond dat ze in vivo kan binden aan CHO-ophopingen [40] . De biocompatibiliteit van dit nanoconjugaat zal worden beoordeeld zoals hierboven beschreven voor het MNP-CHO nanoconjugaat. Als de intraveneuze toedieningsroute niet effectief is bij het passeren van de BBB, worden alternatieve toedieningsroutes voorgesteld als intranasale toediening of toepassing van externe magnetische velden (Fig. 2c).

Implicaties van de hypothese

Het gebruik van bio-gefunctionaliseerde MNP's om AD in vivo te detecteren met MRI is op grote schaal aangetoond in tal van eerdere onderzoeken, door de MNP's te conjugeren aan verschillende peptiden:Aβ 1-40 [41], Aβ1-30 [42], Aβ1-42 [15] en anti-Aβ-1-42-antilichamen [43]. Na intraveneuze toediening in diermodellen van AD werden zowel seniele plaques als vasculaire amyloïde afzettingen (congofiele angiopathie) gedetecteerd door MRI. Deze nanoconjugaten zijn echter op zichzelf toxisch aangezien de gebruikte fragmenten van het amyloïde peptide neurotoxisch zijn (Aβ1-40, Aβ 1-42). Bovendien vereisen ze vanwege hun grootte de gelijktijdige toediening van verbindingen die hun doorgang door de BBB vergemakkelijken.

NANOCHOAD zou werken als een contrastmiddel dat gelijktijdige lokalisatie van twee AD-specifieke biomarkers mogelijk zou maken:amyloïde plaques en verlies van CHO in de witte stof van de hersenen [44], waardoor toxiciteit wordt vermeden. Vanwege de aanwezigheid van PEG in zijn structuur zou het ook de doorgang van het nanoplatform door BBB [43] vergemakkelijken.

Zoals te zien is, zijn de meeste onderzoeken naar deze kenmerken gericht op de detectie van seniele plaques, een van de belangrijkste biomarkers van AD, maar niet de enige. Onlangs is een paper gepubliceerd waarin ferritine en dus ijzerafzettingen werden gedetecteerd door nanoconjugaten op basis van MNP's [16]. Dit contrastmiddel voor de detectie van ferritine heeft echter een lage gevoeligheid omdat het niet wordt gedetecteerd door MRI en alleen door kwantificering op specifieke locaties van de hersenen. Het verlies van witte stof in de hersenen is een enorm fenomeen [44], niet gelokaliseerd; daarom wordt aangenomen dat het voorgestelde contrastmiddel gevoeliger zou kunnen zijn voor de vroege detectie van AD-biomarkers. Het is noodzakelijk om de ontwikkeling van nieuwe contrastmiddelen te bevorderen die op efficiënte wijze andere biomarkers geassocieerd met AD in vroege stadia van de ziekte kunnen detecteren.

Aan de andere kant zou de samenstelling van het voorgestelde nanoconjugaat twee van de belangrijkste obstakels kunnen oplossen om de werkzaamheid van intraveneus geïnjecteerde contrastmiddelen te overwinnen:de colloïdale stabiliteit in de bloedbaan en het vermogen om met succes de BBB te passeren om het doelwit te bereiken. De functionalisering van het nanoplatform met PEG-ketens zal zorgen voor de colloïdale stabiliteit van de nanoconjugaten in de bloedbaan [15, 21]. Aan de andere kant, als een strategie om BBB te kruisen, zal de conjugatie van de MNP's met het peptide transferrine [25] de herkenning van transferrine door specifieke receptoren in de BBB vergemakkelijken, waardoor het nanoconjugaat de BBB kan passeren en aan zijn uiteindelijke doelwit kan binden. . Dit feit, gecombineerd met de kleinere omvang van het nanosysteem en de wijziging van de BBB bij patiënten met AD, zou de doorgang van het nanoconjugaat door de BBB vergemakkelijken.

Vanwege de nieuwigheid in het ontwerp van het beschreven nanoconjugaat, zal het nodig zijn om de biocompatibiliteit en de toegediende dosis van het nanoplatform grondig te bestuderen, vooral om de eliminatieroutes van het contrastmiddel van het organisme te bepalen.

Afkortingen

AD:: Ziekte van Alzheimer
BBB:: Bloed-hersenbarrière
CHO:: Cholesterol
MI:: Moleculaire beeldvorming
MNP's:: Magnetische ijzeroxide nanodeeltjes
MRI:: Magnetische resonantie beeldvorming
PEG:: Polyethyleenglycol

Fotothermisch effect van modulerende laserbestraling op de thermische diffusie van Al2O3-nanovloeistoffen Efficiënte polarisatiebundelsplitser op basis van volledig diëlektrisch metaoppervlak in zichtbare regio

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal