Het apoptose-effect op leverkankercellen van gouden nanodeeltjes gemodificeerd met lithocholzuur

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van AuNP's

Eerst werd in water oplosbare AuNP@MPA bereid (schema 1). Afbeelding 1a toont de TEM-resultaten van de AuNP@MPA. Er wordt aangegeven dat de vorm en grootte van AuNP@MPA de zeer vergelijkbare bolvorm leek met een compact formaat van 4,0 ± 0,5 nm. Vervolgens werd de AuNP@MPA-PEG-LCA bereid (schema 1). En de morfologie van deeltjes werd ook geanalyseerd door TEM (figuur 1c). TEM-afbeeldingen lieten zien dat de morfologie van AuNP@MPA-PEG-LCA vergelijkbaar is met die van AuNP@MPA. En de diameters van AuNP@MPA-PEG-LCA waren ~ 16 nm door statistische analyse.

Schematische weergave van de synthese van de AuNP@MPA-PEG-LCA

TEM-afbeeldingen van a AuNP@MPA, b AuNP@MPA-PEG en c AuNP@MPA-PEG-LCA

De resultaten van cytotoxiciteit

Om de cytotoxiciteit van de AuNP's te onderzoeken, werden HepG2-, SMMC-7721-, QSG-7701- en MCF-7-cellen geselecteerd en 48 uur behandeld met AuNP's en AuNP@MPA. En de MTT-assay werd gebruikt om de celtoxiciteit van monsters te detecteren. De levensvatbaarheid van de cellen van de AuNP's en AuNP@MPA op verschillende cellen wordt getoond in Fig. 2. De resultaten suggereerden dat de cytotoxiciteit van AuNP@MPA in alle cellen erg laag is. De AuNP@MPA-PEG-LCA zou echter de groei van meerdere leverkankercellen effectiever kunnen remmen met toenemende nanodeeltjesconcentratie, maar minder schade toebrengen aan normale cellen en andere kankercellen. De antiproliferatieve activiteit van de AuNP@MPA-PEG-LCA tegen HepG2- en SMMC-7721-cellen was namelijk erg hoog in vergelijking met QSG-7701- en MCF-7-cellen.

Cellevensvatbaarheid van AuNP@MPA en AuNP@MPA-PEG-LCA (AuNP's) 48 uur geïncubeerd met HepG2-, SMMC-7721-, QSG-7701- en MCF-7-cellen

Inductie van apoptose

Apoptotische kernen is een veel voorkomende index van apoptose. Na behandeling met AuNP@MPA-PEG-LCA gedurende de aangegeven tijden, werden de cellen geïncubeerd met Hoechst 33342. Vervolgens werden de morfologische kenmerken van de celkern bekeken met behulp van confocale microscopie. Zoals getoond in Fig. 3 vertonen de controlecellen en de cellen geïncubeerd met AuNP@MPA intacte en homogene celkernkleuring; het aantal apoptotische cellen in HepG2-cellen die zijn behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA neemt echter geleidelijk toe met toenemende incubatietijd en de celkern vertoont typische apoptose-kenmerken, zoals gefragmenteerde kernen, gecondenseerd chromatine en vermindering van cellulair volume.

Morfologische kenmerken van celkern van HepG2-cellen gekleurd met Hoechst 33342. HepG2-cellen werden geïncubeerd met AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml) gedurende a 0 u, b 24 uur, en c 48 h, en d AuNP@MPA (0,5 mg/ml) 48 uur geïncubeerd. Apoptotische cellen vertoonden gecondenseerde en gefragmenteerde kernen en krimp van het celvolume; schaalbalk 20 μm

Zoals we allemaal weten, kan annexine V-kleuring de vroege stadia van apoptose onderscheiden van necrotische cellen. In het vroege stadium van apoptose kan annexine V binden aan het membraan fosfolipide fosfatidylserine (PS), dat wordt geëxternaliseerd van het binnenste naar het buitenoppervlak van het plasmamembraan [39]. Daarom hebben we het potentieel onderzocht om apoptose van AuNP@MPA-PEG-LCA te induceren door middel van annexine V-FITC-kleuringstesten. Zoals getoond in Fig. 4a, is er geen duidelijke groene fluorescentie in het celmembraan in de controle, maar er is duidelijke groene fluorescentie in het celmembraan van HepG2-cellen die zijn behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA. Dit fenomeen is een sterke indicator van apoptose in een vroeg stadium. Zoals we allemaal weten, bewezen de beelden van confocale microscopie alleen het optreden van apoptose; de flowcytometrie zou echter snel en gevoelig het optreden van apoptose kunnen meten en de snelheid van apoptose precies kunnen bepalen. Daarom hebben we de stadia van apoptose verder onderzocht met behulp van flowcytometrie. Figuur 4b toont de resultaten van de apoptosesnelheid door flowcytometrie. Het percentage apoptose was ongeveer 38,45% van de HepG2-cellen die waren behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA, maar het percentage apoptose was slechts ongeveer 8,16% in controlecellen. Het significante percentage apoptose suggereert dat de cel geïncubeerd met AuNP@MPA-PEG-LCA apoptose aanhield.

De apoptose-resultaten van a confocale beelden en b flowcytometriegegevens van HepG2-cellen behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 mg/ml). Cellen werden gekleurd met annexine V-FITC (excitatie bij 488 nm en emissie bij 500-560 nm); schaalbalk 20 μm

De afname van MMP

Mitochondriën spelen een belangrijke rol bij apoptose omdat het pro-apoptotische factoren kan afgeven, zoals cytochroom C en apoptose-inducerende factor [40,41,42]. Dus hebben we de verandering van MMP onderzocht met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie. Figuur 5a toont de fluorescentiebeelden van JC-1-gelabelde HepG2-cellen die zijn behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA door middel van confocale microscopie. We kunnen zien dat er duidelijke rode JC-1-fluorescentie en gezonde mitochondriën zijn in controle HepG2-cellen, wat wijst op de aanwezigheid van JC-1-aggregatie. Er is echter meer groene fluorescentie in de HepG2-cellen die zijn behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA, wat aangeeft dat het membraan is ingestort. De mitochondriale verstoring in apoptotische cellen geeft aan dat de JC-1 zich niet ophoopt in de mitochondriën, maar zich door de cel verspreidt. En als de monomere vorm fluoresceert de verspreide JC-1 die bestaat groen. Om de verandering van MMP verder te kwantificeren, evalueerden we de HepG2-cellen gekleurd met JC-1 door middel van flowcytometrie. Representatieve JC-1 rood / groen-verhoudingssignalen opgenomen in HepG2-cellen die zijn behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA en controlecellen door flowcytometrie worden getoond in Fig. 5b. We kunnen zien dat de verhouding rood/groen een significante afname vertoonde in cellen die waren behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA uit kwantitatieve analyse van JC-1-gekleurde cellen, terwijl die een significante toename had in controlecellen, wat suggereert dat AuNP@ MPA-PEG-LCA kan apoptose induceren in HepG2-cellen.

een Fluorescentiebeelden van JC-1-gelabelde cellen bekeken door confocale microscopie en b effecten van AuNP@MPA-PEG-LCA op MMP geanalyseerd met flowcytometrie

Effecten van AuNP@MPA-PEG-LCA op ROS

Zoals we allemaal weten, kan apoptose worden geactiveerd met verhoogde intracellulaire ROS-niveaus, wat ook een sterk bewijs is dat betrokken is bij de inductie van apoptose [43]. Om verder te onderzoeken of de mitochondriale disfunctie gerelateerd was aan het genereren van ROS, bepaalden we het ROS-niveau in HepG2-cellen gekleurd met H₂ DCF-DA met behulp van confocale microscopie en de flowcytometrische. Zoals weergegeven in Fig. 6a, is de intensiteit van groene fluorescentie van H₂ DCF-DA vertoont een significante toename van HepG2-cellen die zijn behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA in vergelijking met de controlecellen. Dat wil zeggen, het gehalte aan ROS in HepG2-cellen die waren behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA was significant verhoogd. Vervolgens werd de kwantitatieve analyse van het ROS-gehalte in cellen onderzocht met flowcytometrie. Zoals getoond in Fig. 6b, werd de hogere fluorescentie-intensiteit gedetecteerd in cellen die waren geïncubeerd met AuNP@MPA-PEG-LCA in vergelijking met de controlecellen, wat aangeeft dat het ROS-gehalte hoger is in de cellen die zijn behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA . De gegevens suggereerden dat de mitochondriale disfunctie misschien verband hield met het genereren van ROS. Deze resultaten geven voorlopig aan dat het genereren van ROS een belangrijke rol speelt bij het induceren van apoptose door AuNP@MPA-PEG-LCA.

Analyse van ROS-productie nadat HepG2-cellen 6 uur werden behandeld met AuNP@MPA-PEG-LCA. Het gehalte aan ROS in HepG2-cellen werd onderzocht door a confocale microscopie (excitatie bij 488 nm en emissie bij 530 nm) en b flowcytometrie (excitatie bij 488 nm en emissie bij 525 nm)