5-aminolevulinezuur-squaleen nanoassemblages voor tumorfotodetectie en therapie:in vitro studies

Abstract

Protoporfyrine IX (PpIX) als natuurlijke fotosensibilisator afgeleid van toediening van 5-aminolevulinezuur (5-ALA) is klinisch gebruikt voor fotodiagnose en fotodynamische therapie van verschillende vormen van kanker. Een breder gebruik van 5-ALA in de oncologie wordt echter belemmerd door zijn lading en polariteit, wat resulteert in een verminderd vermogen om biologische barrières te passeren en het tumorweefsel te bereiken. Geavanceerde platformen voor medicijnafgifte zijn nodig om de biodistributie van 5-ALA te verbeteren. Hier rapporteren we een nieuwe aanpak voor de levering van 5-ALA. De squalenoyleringsstrategie werd gebruikt om 5-ALA covalent te conjugeren aan squaleen, een natuurlijke voorloper van cholesterol. 5-ALA-SQ nanoassemblages werden gevormd door zelfassemblage in water. De nanoassemblages waren monodispers met een gemiddelde grootte van 70 nm, een polydispersiteitsindex van 0,12 en een ζ-potentiaal van +-36 mV. Ze vertoonden een goede stabiliteit gedurende enkele weken. De geneesmiddelbelading van 5-ALA was zeer hoog met 26%. In menselijke prostaatkankercellen PC3 en menselijke glioblastomacellen U87MG, werd de PpIX-productie in vitro gevolgd na incubatie met nanoassemblages. Ze waren efficiënter in het genereren van PpIX-geïnduceerde fluorescentie in kankercellen in vergelijking met 5-ALA-Hex bij 1,0 tot 3,3 mM bij korte en lange incubatietijden. Vergeleken met 5-ALA vertoonden ze superieure fluorescentieprestaties na 4 uur, die na 24 uur verminderden. 5-ALA-SQ presenteert een nieuw nano-afleveringsplatform met een groot potentieel voor de systemische toediening van 5-ALA.

Achtergrond

Medische nanotechnologie heeft veelbelovende nieuwe platforms voor medicijnafgifte geïntroduceerd. Ze zijn samengesteld uit biocompatibele en biologisch afbreekbare nanomaterialen die de chemische stabiliteit en het farmacokinetische profiel van farmacologisch actieve verbindingen helpen verbeteren, terwijl ze zorgen voor een gecontroleerde afgifte op de plaats van actie [1,2,3]. Tot nu toe zijn er echter nog maar weinig nanodeeltjessystemen op de markt. De belangrijkste valkuilen van bestaande nanodeeltjes (NP's) zijn voornamelijk hun slechte medicijnbelading (meestal minder dan 5%) en "burst-release-effect", dat een voortijdige afgifte van een aanzienlijk deel van het medicijn veroorzaakt voordat het de doellocatie bereikt. Dit veroorzaakt nadelige bijwerkingen en kan leiden tot toxiciteit en verlies van farmacologische activiteit [4].

Squaleen (SQ) is een lineair triterpeen met de chemische formule C₃₀ H₅₀ en een voorloper van cholesterol en andere steroïden [5]. In het menselijk lichaam wordt squaleen gesynthetiseerd in de lever en in de huid en getransporteerd door lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) en lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL) in het bloed [6]. In de context van tumortherapie vertoonde squaleen een sterk versterkend effect op bepaalde chemotherapeutische middelen [7]. Omdat het in de natuur algemeen wordt aangetroffen en veilig is, heeft squaleen zijn toepassingen gevonden in de farmaceutische technologie als hulpstof bij de bereiding van lipide-emulsies voor de afgifte van vaccins, verschillende actieve verbindingen en genen [6, 8, 9]. Squaleen is geschikt bevonden voor de covalente conjugatie aan verschillende geneesmiddelen. Geavanceerde nanosystemen die op deze manier zijn gemaakt, bevatten squaleen geconjugeerd aan chemotherapeutische middelen zoals gemcitabine [10,11,12], paclitaxel [13], cisplatine [14] of doxorubicine [15]. Deze benadering wordt "squalenoylatie" genoemd en omvat een prodrug-strategie met de vorming van de nano-colloïdale systemen waar het actieve bestanddeel covalent wordt gebonden [16, 17]. Op squaleen gebaseerde nanoassemblages (NA's) worden gevormd door zelfassemblage van functionele componenten in waterige media en worden gekenmerkt door een inherente hoge medicijnbelading [18]. Van squalenoylering is gevonden dat het de stabiliteit van het geneesmiddel verbetert en de oplosbaarheid van slecht in water oplosbare geneesmiddelen verhoogt, waardoor de biologische beschikbaarheid verbetert en de halfwaardetijd van het geneesmiddel in de systemische circulatie wordt verlengd [14, 16]. In de meeste gevallen vertonen dergelijke zelf-geassembleerde NA's een betere farmacologische activiteit dan het oorspronkelijke medicijn [16, 19]. Bovendien biedt squalenoylatie een middel om NA's te construeren die zowel een therapeutische als een beeldvormende modaliteit bevatten [20]. Vergelijkbare theranostische NA's zijn gemeld door Couvreur en collega's door een MRI-agens op te nemen in squalenoyl-gemcitabine (SQgem) nanoassemblages [14]. Dit soort multifunctionele systemen kan van groot belang zijn bij de ontwikkeling van nieuwe theranostische middelen voor gepersonaliseerde geneeskunde.

In de context van kankertheranostica heeft de toediening van een klein molecuul 5-aminolevulinezuur (5-ALA) (Fig. 1) geleid tot het klinische gebruik van 5-ALA voor fotodynamische therapie (PDT) [21,22,23] , fotodiagnose (PD) [24] en fluorescentiegeleide tumorresectie bij glioompatiënten met hersenkanker [25,26,27]. De theranostica wordt bereikt door het metabolisme van 5-ALA en selectieve accumulatie van protoporfyrine IX (PpIX) in het kankerweefsel als gevolg van de omzeilde feedbackremming van de heemcyclus [22]. De werkzaamheid van 5-ALA PD en PDT wordt echter ernstig belemmerd door de zwitterionische aard ervan bij neutrale pH die in de bloedbaan wordt aangetroffen. Er zijn verschillende pogingen gedaan om de stabiliteit en het farmacokinetische profiel van 5-ALA te verbeteren. Zowel het amino- als het carboxyl-uiteinde van 5-ALA zijn gemodificeerd door verschillende benaderingen [28]. De verestering van de carboxylgroep van 5-ALA heeft geleid tot 5-ALA-methylester (Metvix®) [29] en wordt gebruikt bij de plaatselijke behandeling van actinische keratose, basaalcelcarcinoom en acute acne. Hexylester van 5-ALA (5-ALA-Hex) (Hexvix®) heeft een handelsvergunning gekregen voor de fotodiagnose (PD) van blaaskanker [30, 31] en wordt experimenteel gebruikt voor de behandeling van baarmoederhalskanker en ernstige acne [32] ,33,34].

Chemische structuren van NA-bouwsteenelementen. 5-ALA (een ), 5-ALA-Hex (b ), squaleen (c ), en 5-ALA-SQ (d )

Met uitzondering van Gliolan™ is het klinische gebruik van 5-ALA en zijn derivaten echter meestal beperkt tot plaatselijke toediening. Dit beperkt het gebruik ervan bij belangrijkere vormen van kanker, zoals borst-, colorectale, long- en prostaatkanker. Pogingen om het gebruik van 5-ALA te verbreden hebben amino-end gemodificeerde fosfatase-gevoelige derivaten van 5-ALA die recent een zeer veelbelovende activiteit hebben laten zien [35, 36]. Verder zijn er pogingen ondernomen om 5-ALA in verschillende nanosystemen in te kapselen, waaronder polymere NA's [37,38,39] of liposomen [40,41,42,43] en de conjugatie ervan in dendrimeren [44, 45] of gouden NP's [46] , 47]. Hoewel sommige van deze oplossingen hebben geholpen om de stabiliteit van 5-ALA en het farmacokinetische profiel ervan te verbeteren, heeft geen van de bovengenoemde pogingen geresulteerd in een succesvolle klinische kandidaat op het gebied van nanogeneeskunde voor kanker.

Het doel van dit werk was het ontwerp en de synthese van 5-ALA-squaleen (5-ALA-SQ) geconjugeerde bouwsteen (Fig. 1d) die zichzelf assembleert in waterige media en een hoge medicijnbelading van 5-ALA bevat, een vereiste voor farmacologische activiteit bij kankers. De NA's werden getest op twee verschillende kankercellijnen op hun fluorescentie-PD-mogelijkheden. Gecombineerd met recente rapporten van op squaleen gebaseerde NA's die plasmalipoproteïnen exploiteren om indirecte kankertargeting [48] te bereiken, breidt deze 5-ALA-nanotechnologiebenadering het gebruik van 5-ALA voor PD en PDT van verschillende kankers uit, zoals prostaatkanker die in deze studie wordt gebruikt .

Resultaten en discussie

5-ALA-SQ synthese van bouwstenen

Een efficiënte convergerende chemische strategie werd gebruikt om de 5-ALA-SQ-bouwsteen uit squaleen en 5-ALA te synthetiseren (figuur 2). 5-ALA werd eerst aan het amino-uiteinde beschermd met N -Boc-beschermende groep met behulp van standaardomstandigheden. Nanoassemblage-inducerende squaleenalcohol (3 ) werd gesynthetiseerd uit squaleen in vier synthetische stappen volgens procedures beschreven in de literatuur [49]. Boc-5-ALA (2 ) en squaleenalcohol (3 ) werden vervolgens gekoppeld in aanwezigheid van EDC en DMAP om het beschermde esterderivaat op te leveren (4 ) met een goede opbrengst. De laatste Boc-ontscherming moest worden uitgevoerd onder milde zure omstandigheden om elektrofiele toevoeging aan de squaleensteiger te voorkomen. Het eindproduct werd gezuiverd door reverse-phase HPLC om de NA-bouwsteen met een goede opbrengst op te leveren.

5-ALA-SQ bouwsteensynthese. 5-ALA-SQ werd gesynthetiseerd in vier synthetische stappen met behulp van convergente synthese van 5-ALA en SQ

5-ALA-SQ nano-assemblages

Om een efficiënte afgifte van een actieve verbinding door nanodeeltjes (NP's) aan de plaats van actie te bereiken, spelen parameters zoals de grootte, vorm en oppervlaktelading van nanodeeltjes een belangrijke rol en bepalen ze de farmacokinetiek van nano-afgiftesystemen in het lichaam [ 50]. In het bijzonder bepaalt de deeltjesgrootte verschillende farmacokinetische verschijnselen zoals NP-halfwaardetijd in de systemische circulatie, sekwestratie door macrofagen en de extravasatie door lekkende vasculatuur naar de plaats van actie [51]. Vorm en grootte van nanodeeltjes reguleren hun vermogen om te extravaseren door de fenestraties in het vaatstelsel [50, 51]. Grootte en vorm zijn ook erg belangrijk voor actieve targeting en opname in cellen, aangezien kleinere NP en sferische vormen een kleiner oppervlak hebben, dus veel beperkte contactpunten in vergelijking met grotere niet-sferische nanodeeltjessystemen [51].

De zelfassemblage van 5-ALA-SQ-bouwsteen vond spontaan plaats in waterige media. De NA's werden gevormd door nanoprecipitatie. 5-ALA-SQ-conjugaat werd opgelost in organische oplosmiddelen en druppelsgewijs toegevoegd aan water. Totale verdamping van de organische oplosmiddelen leverde een waterige oplossing van NA's op. 5-ALA-SQ NA's waren monodispers met een lage polydispersiteitsindex van 0,12. Elektroforetische mobiliteitsmetingen gaven een ζ-potentiaal van 36 mV en dynamische lichtverstrooiing (DLS) onthulde monodisperse distributie van NA's met een gemiddelde grootte van 70 nm (figuur 3). Het NA-maatbereik biedt een goed potentieel voor langdurige circulatie in de bloedbaan [50]. Niettemin zijn 5-ALA-SQ NA's aanzienlijk kleiner dan eerder gerapporteerde SQ-composieten die variëren tussen 100 en 300 nm, wat wijst op een andere supramoleculaire rangschikking [19].

Karakterisering van 5-ALA-SQ NA's. Laag (een ) en hoog (b ) vergroting cryo-TEM-beelden, DLS-analyse (c ), en stabiliteit bij 4 °C (d )

De kleinere omvang kan te wijten zijn aan positief geladen aminogroepen en een relatief klein 5-ALA-molecuul in vergelijking met de SQ-groep. Er is aangetoond dat de variatie van kleine moleculen die aan squaleen zijn gehecht veranderingen in zelfassemblage en pakking van verbinding-squaleenconjugaten introduceert, waardoor de vorm en grootte van NA's [16] verandert. Het is mogelijk dat de zeer positief geladen aminogroep van 5-ALA zich oriënteert naar het bulkwater, terwijl de lipofiele ketens het binnenste van deze NA's innemen; de exacte supramoleculaire structuur moet echter nog worden opgehelderd. Ondanks het aanzienlijk kleinere formaat in vergelijking met andere squaleen-nanocomposieten, vertonen de NA's een uitstekende houdbaarheid, waarbij de grootte en PDI gedurende meerdere weken constant blijven.

Een ander belangrijk aspect van de nieuwe 5-ALA-SQ NA's is dat ze een medicijnbelading van 26% bereiken, wat hoog is in vergelijking met andere gerapporteerde 5-ALA-nanodeeltjessystemen waar de lading veel minder efficiënt was [37, 38, 41]. Het laden van medicijnen is erg belangrijk bij de afgifte van NP's, omdat bij arme NP's met veel medicijnen de toegediende dosis mogelijk niet voldoende is om een farmacologisch actieve concentratie in doelweefsels te bereiken [4]. De belasting kan worden bepaald door een eenvoudige berekening, waarbij rekening wordt gehouden met de molecuulgewichten van 5-ALA en 5-ALA-SQ, aangezien 5-ALA covalent is gebonden aan de squaleensteiger in een molaire verhouding van 1:1.

PpIX-fluorescentiekinetische metingen in kankercellen

Tijdsafhankelijke vorming van PpIX werd geëvalueerd in menselijke PC3-prostaatkankercellen en U87MG-glioblastoom geïncubeerd met 5-ALA-SQ NA's en 5-ALA-Hex als referentie. Afbeelding 4 geeft de PpIX-vorming weer in menselijke PC3-prostaatkankercellen die gedurende 24 uur zijn blootgesteld aan toenemende concentraties van 5-ALA-SQ NA's of 5-ALA-Hex.

Kinetische fluorescentiemetingen van PpIX-accumulatie in PC3-cellen. De cellen werden geïncubeerd met toenemende concentraties 5-ALA-SQ NA's (a ) of 5-ALA-Hex (b )

Concentratie-afhankelijke PpIX-fluorescentieprofielen werden waargenomen voor 5-ALA-SQ NA's. Bij 1,0 en 2,0 mM nam de PpIX-fluorescentie gestaag toe gedurende 24 uur terwijl een plateau werd bereikt na 8 uur incubatie voor lagere concentraties. Aan de andere kant induceerde 5-ALA-Hex de hoogste accumulatie van PpIX in een lager concentratiebereik tussen 0,10 en 0,30 mM, zoals eerder gerapporteerd [35, 52]. Echter, 5-ALA-Hex bij concentraties boven 1 mM bleek toxisch te zijn voor cellen, wat de algehele waargenomen fluorescentie vermindert en het gebruik ervan belemmert [36].

Vervolgens werd dosisafhankelijke PpIX-accumulatie in menselijke glioblastoma-kankercellen van PC3 en U87MG uitgevoerd met als doel de optimale NA-dosering te schatten. Fluorescentie-intensiteit bij 4 en 24 uur incubatie met 5-ALA-SQ NA's en 5-ALA-Hex wordt getoond in Fig. 5. Heel belangrijk is dat 5-ALA-SQ NA's de PpIX-productie in beide cellijnen induceerden. Bovendien zijn de maximale fluorescentieniveaus vergelijkbaar met ALA-Hex-controle in beide cellijnen. Er kan ook worden opgemerkt dat in PC3-cellen 1,0 en 2,0 mM-concentraties van 5-ALA-SQ NA's optimaal waren voor het induceren van de hoogste accumulatie van PpIX. In U87MG-cellen waren er geen significante verschillen tussen verschillende concentraties van 5-ALA-SQ NA's voor korte incubatietijden (figuur 5c). Na 24 uur bleek PpIX-accumulatie afhankelijk te zijn van de concentratie van 5-ALA-SQ NA's of 5-ALA-Hex vergelijkbaar met PC3-cellen. Een afname in PpIX-inductie, enigszins vergelijkbaar met ALA-Hex, werd gevonden na een langere incubatieperiode bij hogere concentraties 5-ALA-SQ NA's die gevoeliger waren voor de aanwezigheid van NA's.

Dosis-responscurves. Concentratieafhankelijke PpIX-accumulatie met 5-ALA-SQ NA's (blauw) en 5-ALA-Hex (rood) in PC3 (a , b ) en U87MG (c , d ) cellen na 4 uur (links) en 24 uur (rechts) incubatie

Figuur 5 laat zien dat na 24 uur de PpIX-productiecurves klokvormig zijn in zowel PC3- als U87MG-cellen. Terwijl een concentratie van 1 mM 5-ALA-SQ NA's de hoogste PpIX-accumulatie in PC3-cellen induceerde, tolereerden U87MG-cellen hogere concentraties en werd de toename in PpIX-fluorescentie waargenomen tot 2 mM 5-ALA-SQ NA's. Over het algemeen waren hogere concentraties van 5-ALA-SQ NA's nodig om de biosynthese van PpIX efficiënt te induceren in vergelijking met 5-ALA-Hex, vermoedelijk vanwege de verschillende splitsingssnelheden van de esterbindingen in de kankercellen. Een afname van de PpIX-productie werd waargenomen wanneer concentraties hoger dan 1 mM 5-ALA-Hex werden gebruikt vanwege de niet-specifieke toxiciteit van 5-ALA-Hex. Dit effect was veel minder uitgesproken voor de 5-ALA-SQ waar de fluorescentie niveaus begonnen pas af te nemen bij de hoogste geteste concentratie (3,3 mM) en verlengde incubatietijden (Fig. 5b, d). De fluorescentieniveaus waren echter vergelijkbaar voor beide verbindingen zonder enige fluorescentievertraging waargenomen voor de NA's.

De NA's werden ook getest in U87MG-glioblastoom tegen 5-ALA-controle die op de markt wordt gebracht voor PD van glioblastoom tijdens chirurgische resectie. Figuur 6 toont de fluorescentie van U87MG-cellen na 4 en 24 uur. 5-ALA-SQ NA's induceerden een significant hogere fluorescentie na 4 uur in vergelijking met 5-ALA, wat zeer relevant is in een klinische setting. Na 24 uur verschuift het fluorescentieprofiel in het voordeel van 5-ALA bij lagere concentraties, aangezien de langzame, actieve opname van 5-ALA voldoende 5-ALA-hoeveelheden in de cellen oplevert. NA's vertonen nog steeds vergelijkbare fluorescentieniveaus als 5-ALA bij optimale 1,0 en 2,0 mM-concentraties van NA's (Fig. 6b).

Dosis-responscurves. Concentratieafhankelijke PpIX-accumulatie in U87MG-cellen na 4 uur (a ) en 24 u (b ) incubatie met 5-ALA-SQ NA's (blauw) en 5-ALA (groen)

In de klinische praktijk wordt 5-ALA topisch of oraal toegediend, maar vanwege de geladen aard komt slechts een klein deel van de initiële dosis de doelcellen binnen via endogene peptidetransporters zoals PEPT1, PEPT2 of BETA-transporters, afhankelijk van het celtype [40, 53]. Recente onderzoeken naar NA's van een SQgem-derivaat geven aan dat de celinvoer wordt bepaald door albumine-versterkte diffusie van bouwstenen uit één molecuul en het bleek sterk afhankelijk te zijn van de aanwezigheid van extracellulaire eiwitten [54, 55]. Verder toonden verrood fluorescerende NA's die we onlangs rapporteerden ook een snelle internalisatie, en 5-ALA-SQ fluorescentiekinetische experimenten en de dosis-responscurves bevestigen de internalisatie van enkele moleculen bouwstenen en een efficiënt daaropvolgend metabolisme om fluorescerende PpIX op te leveren.

Conclusies

In deze in vitro proof-of-concept-studie werd een convergerende chemische strategie gebruikt om de 5-ALA-SQ-bouwsteen uit squaleen en 5-ALA te synthetiseren. De 5-ALA-SQ NA's werden bereid door spontane nanoprecipitatie in water. NA's waren monodispers en stabiel met een gemiddelde grootte van 70 nm, een polydispersiteitsindex van 0,12, een positieve ζ-potentiaal van 36 mV en een hoge 5-ALA-lading van 26%. PpIX-productie werd in vitro geëvalueerd in twee kankercellijnen door de fluorescentietoename in de tijd te meten en te vergelijken met 5-ALA en 5-ALA-Hex. De resultaten toonden aan dat SQ-ALA NA's zeer efficiënt zijn in het induceren van de PpIX-productie in PC3- en U87MG-kankerceltypen. Ze presteren beter dan 5-ALA-Hex bij fluorescentie-inductie bij hogere concentraties bij incubatietijden van 4 en 24 uur in vitro; in vergelijking met 5-ALA vertonen ze echter superieure fluorescentie-inductie bij kortere incubatietijden. In het kader van deze bevindingen kunnen we concluderen dat 5-ALA-SQ NA's een aantrekkelijke nanotechnologische oplossing vormen voor het overwinnen van de farmacokinetische nadelen van 5-ALA. Verder zullen in vivo experimenten hun potentieel voor de systemische afgifte van 5-ALA voor fluorescentie PD en PDT-therapie van tumoren evalueren.

Methoden/experimenteel

Reagentia werden gekocht bij commerciële leveranciers Sigma-Aldrich (Bucks, Zwitserland) en Acros Organics (Basel, Zwitserland) en gebruikt zonder verdere zuivering. Gedeutereerde NMR-oplosmiddelen werden verkregen van Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, VS). Tetrahydrofuraan (THF) en dichloormethaan (CH₂ Cl₂ ) werden verkregen uit een droogsysteem op basis van een watervrij Engineering-aluminakolom. Alle andere gebruikte oplosmiddelen waren van HPLC-kwaliteit. N,N-dimethylformamide (DMF), methanol (CH₃ OH), diethylether (Et₂ O) en aceton werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Buchs, Zwitserland). Ethylacetaat (AcOEt) werd gekocht bij Biosolve (Dieuze, Frankrijk); acetonitril (CH₃ CN) werd geleverd door Carlo Erba Reagents (Balerna, Zwitserland). Hexaan ≥ 95% n-hexaan werd gekocht bij Fisher Chemical (Basel, Zwitserland). Het water dat voor de preparaten werd gebruikt, werd gedeïoniseerd door een Milli-Q laboratoriumwatersysteem (Millipore, Molsheim, Frankrijk). Chemische reacties werden uitgevoerd met behulp van standaard injectiespuit-septa met positieve argondruk om watervrije omstandigheden te garanderen.

Dunnelaagchromatografie (TLC) werd uitgevoerd met silicaplaten met aluminium achterkant (Merck-Keiselgel 60 F254) met een geschikte mobiele fase en werd gevisualiseerd met behulp van een UV-fluorescentielamp (254 en 366 nm) en/of ontwikkeld met ninhydrine, 20% zwavelzuur. zuur of fosfomolybdeenzuur (PMA). Flash-chromatografie werd uitgevoerd op een geautomatiseerde PuriFlash® 4100-machine van Interchim (Montlucon, Frankrijk) met behulp van Interchim-silicakolommen puriFlash® HP 30 m uitgerust met een PDA-detector (200-800 nm) en geautomatiseerde fractiecollector. Het elutieprofiel werd gevolgd met behulp van Flash Interchim-softwareversie 5.0x. Semi-preparatieve HPLC-kolom werd uitgevoerd op een Waters Symmetry 300TM - 5 μm (19 x 150 mm), C8-kolom (Baden-Dättwil, Zwitserland). Analytische UPLC werd uitgevoerd met behulp van Macherey-Nagel EC50/2 Nucleodur Gravity 1,8 m kolom (50 × 2,1 mm) gemonteerd op een watersysteem uitgerust met een Waters PDA-detector (Baden-Dättwil, Zwitserland). Buffer A = CH₃ CN + 0,1% mierenzuur) en buffer B = H₂ O + 0,1% Mierenzuur. Debiet =400,0 L/min bij 25 °C. ¹ H en ¹³ C NMR-spectra werden opgenomen op Varian Gemini 300 MHz, Varian Innova 500 MHz of Bruker Avance III Cryo 600 MHz spectrometers bij 298 K. Chemische verschuivingen (δ) worden aangegeven in delen per miljoen (ppm) en koppelingsconstanten (J) zijn in hertz (Hz). s voor singlet, d voor doublet, dd voor doublet van doubletten, t voor triplet, q voor kwartet en m voor multiplet. Resterende oplosmiddelpieken werden gebruikt als de interne referentie voor de chemische verschuivingen van protonen en koolstof. NMR-spectra werden verwerkt met het softwarepakket Mnova versie 10.0.2. Lage resolutie massaspectrometrie (LRMS) werd uitgevoerd op een HTS PAL-LC10A – API 150Ex instrument in ESI (positieve modus). Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) werd uitgevoerd op een QSTAR Pulsar (AB/MDS Sciex) instrument in ESI (positieve modus). Chemische structuren werden getekend en benoemd volgens de IUPAC-nomenclatuur met behulp van het ChemBioDraw Ultra-softwarepakket 14.0.0.117. De pH werd gemeten op een Metrohm 691 pH-meter met behulp van een speerpuntelektrode (Zofingue, Zwitserland), gekalibreerd met Metrohm-buffers. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 6, 2016, (GraphPad Software) -software. P waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Synthese van SQ-ALA-bouwsteen

5-(tert-Butoxycarbonylamino)-4-oxopentaanzuur (2)

Boc-5-ALA werd gesynthetiseerd volgens de gepubliceerde procedure. De spectroscopische gegevens zijn identiek aan de literatuur [56]. ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12,12 (s, 1H), 7,06 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 3,76 (d, J = 5,9 Hz, 2H), 2,61 (t, J = 6,6 Hz , 2H), 2,40 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H). ¹³ C NMR (151 MHz, DMSO) 206,62, 174,07, 156,21, 78,54, 49,97, 40,38, 40,24, 40,11, 39,97, 39,83, 39,69, 39,55, 34,22, 28,64. [M+H]⁺ 232.1, gevonden 232,7.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaeen-1-ol (3)

Squaleenalcohol 3 werd gesynthetiseerd uit squaleen in vier synthetische stappen met een opbrengst van 23,7% als kleurloze olie volgens de gerapporteerde procedures [49]. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5,17-5,06 (m, 5H, CH), 3,62 (q, J =6,3 Hz, 2H, CH₂ -OH), 2,17 – 1,92 (m, 18H, CH₂ ), 1,67 (s, 3H, CH₃ ), 1,59 (m, 17 H, CH₃ en CH₂ ). ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃ ) 135.35, 135.17, 135.14, 134.81, 131.49, 125.05, 124.64, 124.60, 124.47, 63.07, 39.98, 39.95, 39.89, 36.24, 30.92, 28.48, 26.98, 26.88, 26.78, 25.94, 17.92, 16.23. LRMS (ESI):m/z berekend voor [M+NH₄ ]⁺ 404,4, gevonden 404,8.

(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-pentamethyldocosa-4,8 ,12,16,20-pentaeen-1-yl 5-((tert-butoxycarbonyl)amino)-4-oxopentanoaat (4)

Squaleenalcohol (3 ) (100 mg, 0,26 mmol), EDC (74 mg, 0,38 mmol) en DMAP (94 mg, 0,78 mmol) en 5-(tert-Butoxycarbonylamino)-4-oxopentaanzuur (2) (77 mg, 0,34 mmol) werden opgelost in DCM (15 ml). Na een nacht roeren bij omgevingstemperatuur werd het oplosmiddel onder verlaagde druk verdampt en het ruwe product gezuiverd door middel van Flash-chromatografie met gebruikmaking van een DCM/ethylacetaat (EA)-gradiënt, waarbij een kleurloze olie werd verkregen (108 mg, 0,18 mmol, 70%). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H), 1,41 (s, 9H). ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 204.46, 172.65, 135.30, 135.16, 135.09, 133.75, 131.43, 125.34, 124.60, 124.57, 124.48, 124.45, 64.81, 50.53, 39.96, 39.93, 39.87, 35.92,52. , 28.43, 28.24, 28.02, 26.97, 26.86, 25.92, 23.11, 17.90, 16.25, 16.21, 16.06. LRMS (ESI):m/z berekend voor [M+NH₄ ]⁺ 617.5, gevonden 617.8.

Trifluorazijnzuurzout van 5-amino-(((4E,8E,12E,16E)-4,8,13 ,17,21-pentamethyldocosa-4,8,12,16,20-pentaeen-1-yl)oxy)-4-oxopentanoaat (5)

Samengestelde 4 (34 mg, 57 mmol) werd opgelost in DCM (2,0 ml). Trifluorazijnzuur (TFA) (200 L) werd toegevoegd en het reactiemengsel werd bij omgevingstemperatuur geroerd. Na 10 minuten werden de oplosmiddelen onder vacuüm bij lage temperatuur verdampt en werden sporen TFA verwijderd door gelijktijdige verdamping met EA (3 × -10 ml). Het ruwe product werd gezuiverd door middel van RP-HPLC met gebruikmaking van volledige H₂ O/AcN (0,025% TFA) gradiënt die kleurloze olie oplevert (25 mg, 74%). %). ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ 5,31 – 5,20 (br s, 1H), 5,13 – 5,07 (m, 5H), 4,09 – 3,95 (m, 4H), 2,75 – 2,53 (m, 4H), 2,02 – 1,95 (m, 20H), 1,64 ( s, 3H), 1,63 – 1,50 (m, 19H). LRMS (ESI):m/z berekend voor [M+H]⁺ 500,4, gevonden 500,6.

Voorbereiding van nanoassemblages

NA's werden bereid door nanoprecipitatie die elders in detail wordt beschreven [20]. Kortom, bouwsteen 5 (1,2 mg, 2,0 μmol) werd opgelost in een 50/50 V /V mengsel aceton/ethanol (500 L). De organische fase werd vervolgens druppelsgewijs toegevoegd met behulp van een micro-spuit in MilliQ-water (1,25 ml) met 100 μL / min onder magnetisch roeren. Na 5 min roeren werd de magnetische roerstaaf verwijderd en de organische oplosmiddelen en de overmaat water verwijderd met behulp van een roterende verdamper bij 30°C. De uiteindelijke concentratie van nanosamenstellingen was 2,00 mM.

Karakterisering van 5-ALA-SQ NA's

5-ALA-belading van 5-ALA.SQ NA werd als volgt berekend uit de respectieve bijdragen van de molecuulgewichten van 5-ALA en van 5-ALA-SQ-conjugaat [19]:

$$ \mathrm{Bezig met laden}\ \left(\%\right)=\frac{\mathrm{MW}\ \left(5-\mathrm{ALA}\right)}{\mathrm{MW}\left(5 -\mathrm{ALA}-\mathrm{SQ}\right)}\times 100 $$

De hydrodynamische diameter van NA's werd gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) met behulp van een NANO ZS-instrument uit Malvern (Worcestershire, VK) met de ZetaSizer 7.01-software. De analyses werden uitgevoerd met 4 mW He-Ne Laser (633 nm) bij een verstrooiingshoek van 173° bij 25°C in polystyreen (PS) microcuvette van Brand (Wertheim, Duitsland). Zeta-potentiaal (ZP) werd bepaald met hetzelfde Nano ZS-instrument van Malvern in gevouwen capillaire cellen DTS 1070 van Malvern. Grootteverdeling en grootte gemiddelde diameter werden berekend uit de gegevens. De stabiliteit van bij 4 °C opgeslagen NA's werd gedurende een periode van 1 maand op regelmatige tijdstippen door DLS getest.

De morfologie van NA's werd beoordeeld met een cryogene transmissie-elektronenmicroscoop (cryo-TEM) met behulp van TECNAI® G² Sphera-microscoop (FEI, Thermo Fisher Scientific) uitgerust met 2000 bij 2000 pixels hoge resolutie digitale camera TCL (Gräfelfing, Duitsland). De verglaasde ijsmonsters werden bereid met behulp van de Virtobot-cryo-plunjer (FEI, Thermo Fisher Scientific). NA's (2,0 L, 2,0 mM) werden aangebracht op Quantifoil Cu/Rh 200 mesh R3.5/1 roosters (SPI, West Chester, VS) en verglaasd met vloeibaar ethaan.

Celcultuur

Menselijke prostaatkankercellen PC3 (ATTC® CRL-1435™) en menselijke glioblastoomcellen U87MG (ATTC® HTB-14™) werden gekweekt en onderhouden door seriële passage in F-12K-voedingsmix (21127-022, Thermo Fisher Scientific) of minimaal Essential Media (31095-029, Thermo Fisher Scientific), respectievelijk. Celmedia werden aangevuld met foetaal kalfsserum (10%, CVFSVF00-01, Eurobio), streptomycine (100 L / ml) en penicilline (100 IE / ml, 15140-122, Thermo Fisher Scientific). Cellen werden gekweekt bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 95% lucht en 5% CO_2.

In vitro PpIX fluorescentiekinetische metingen

Menselijke prostaatkankercellen PC3 (12.000 cellen/putje) en glioblastomacellen U87MG (10.000 cellen/putje) werden uitgezaaid in platen met 96 putjes (zwarte plaat met heldere bodem, 3603, Corning). De volgende dag werden cellen blootgesteld aan toenemende concentraties van 5-ALA-SQ NA's, 5-ALA-Hex en 5-ALA in serumvrije media. PpIX-fluorescentie werd op verschillende tijdstippen opgenomen met een plaatlezer (Safire, Tecan, Zwitserland). De excitatiegolflengte was ingesteld op 405 nm en de emissiegolflengte op 630 nm. Gemiddelde waarden en sd. voor elke concentratie op elk tijdstip per plaat werd afgetrokken van de referentiewaarde (geen behandeling) en uitgezet voor elke cellijn.

Onderzoek naar het effect van het beïnvloeden van richting op het schurende nanometrische snijproces met moleculaire dynamiek Opeenvolgend door damp gegroeid hybride perovskiet voor vlakke heterojunctie zonnecellen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal