Nucleoside-lipide-gebaseerde nanocarriers voor toediening van sorafenib

Abstract

Hoewel de toepassing van sorafenib, een kleine remmer van tyrosine-eiwitkinasen, voor kankerbehandelingen een wereldwijde optie blijft bij chemotherapie, zijn er nieuwe strategieën nodig om de problemen met de lage wateroplosbaarheid (<-5 μM), toxiciteit en bijwerkingen van dit medicijn aan te pakken. In deze context wordt momenteel het gebruik van nanodragers onderzocht om deze nadelen te ondervangen. In deze bijdrage rapporteren we een nieuw type op sorafenib gebaseerde nanodeeltjes gestabiliseerd door hybride nucleoside-lipiden. De vaste lipide-nanodeeltjes (SLN's) vertoonden negatieve of positieve zeta-potentiaalwaarden, afhankelijk van de nucleoside-lipidelading. Transmissie-elektronenmicroscopie van met sorafenib geladen SLN's onthulde parallellepipedumvormige nanodeeltjes van ongeveer 200 nm. Biologische onderzoeken die zijn uitgevoerd op vier verschillende cellijnen, waaronder lever- en borstkanker, lieten verbeterde antikankeractiviteiten van op sorafenib gebaseerde SLN's zien in vergelijking met het gratis medicijn. Belangrijk is dat contrastfasemicroscopiebeelden die zijn opgenomen na incubatie van kankercellen in aanwezigheid van SLN's in hoge concentratie in sorafenib (>-80 μM), in alle gevallen een totale kankerceldood aan het licht brachten. Deze resultaten benadrukken het potentieel van op nucleoside-lipiden gebaseerde SLN's als medicijnafgiftesystemen.

Achtergrond

Sorafenib, op de markt gebracht onder de naam Nexavar™, is een hydrofobe geneesmiddelkinaseremmer [1] die is goedgekeurd voor de behandeling van verschillende vormen van kanker bij de mens, waaronder gevorderd niercelcarcinoom (RCC) [2], hepatocellulair carcinoom (HCC) [3] en geavanceerd schildkliercarcinoom [3]. carcinoom. Sorafenib heeft meerdere bekende doelwitten voor proteïnekinase, waaronder transmembraanreceptoren en intracellulaire tyrosine- en serine-threoninekinasen, en er is ook aangetoond dat het apoptose induceert. Wat het werkingsmechanisme betreft, is gemeld dat sorafenib tumorgroei remt via meerdere doelen, direct op de tumor en/of op tumorangiogenese (door remming van VEGFR- en PDGFR-signalering) [4, 5]. De werkzaamheid ervan bij het remmen van de groei van kwaadaardige cellen is aangetoond bij veel histologische kankertypes zoals melanoom [6], schildklier [7], pancreas [5], hepatocellulair carcinoom en leukemie [8]. De lage oplosbaarheid in water, de toxiciteit en bijwerkingen beperken het gebruik van sorafenib in veel klinische toepassingen. Om deze problemen aan te pakken, worden momenteel verschillende sorafenib-formuleringen onderzocht [9, 10], waaronder vloeibaar-kristallijne nanodeeltjes [11], nano-emulsie [12], cyclodextrine-gemodificeerde poreuze siliciumnanodeeltjes [13], geneesmiddel-eluerende nanocomposieten [14], polyelektrolyt op basis van nanodeeltjes [15], of curcumine zelf-geassembleerde nanodeeltjes [16]. Lipidenanodeeltjes (LN's) geladen met sorafenib zijn echter slecht onderzocht [17, 18].

Hierin rapporteren we het eerste voorbeeld van op sorafenib gebaseerde vaste lipide-nanodeeltjes (SLN's) [19] gestabiliseerd door nucleoside-lipiden [20,21,22]. Chromatografische studies bereikt op positief en negatief geladen nucleolipiden (DOTAU en diC₁₆ dT, respectievelijk) geven aan dat deze amfifielen de gevraagde stabiliteit en zuiverheid bezitten voor hun gebruik in het kader van toepassingen voor medicijnafgifte [23, 24]. Een eenvoudige nanoprecipitatieprocedure maakt de vorming van SLN's mogelijk met ofwel positieve (SLN⁺ ) of negatieve ladingen (SLN⁻ ) (Figuur 1). Het is vermeldenswaard dat alle onderzochte SLN's het cytotoxische effect van sorafenib op verschillende menselijke carcinoom versterkten, wat aantoont dat SLN's de beperkingen van sorafenib kunnen overwinnen in termen van oplosbaarheid in water en antikankeractiviteiten.

Schema van SLN's formulering. Chemische structuren van een anionisch nucleotide-lipide, het thymidine 3′-(1,2-dipalmitoyl-sn -glycero-3-fosfaat) (diC₁₆ dT), een kationisch-nucleoside-lipide DOTAU (2′,3′-dioleyl-5′-deoxy-5′-trimethyl-ammonium-uridine) en sorafenib gebruikt in deze studie (links). Schematische tekening van SLN's met parallellepipedumvormen verkregen na nanoprecipitatie van een nucleolipide (ofwel diC₁₆ dT of DOTAU, leidend tot SLN⁻ en SLN⁺ , respectievelijk) met sorafenib (rechts). De schematische weergave is een bewerking van het transmissie-elektronische microscopie (TEM)-beeld met DOTAU-sorafenib-geladen nanodeeltjes (inzet, bar 500 nm)

Methoden

Chemische stoffen en reagentia

Methanol (MeOH), mierenzuur (FA) en ammoniumformiaat (AFNH₄ ) werden gekocht bij VWR Chemicals (Frankrijk) en waren allemaal van HPLC-kwaliteit (high-performance liquid chromatography). Water van HPLC-kwaliteit (minimale soortelijke weerstand van 18,2 MΩ) werd in eigen huis geproduceerd door het ELGA Millipore-systeem (Frankrijk). DOTAU (CAS-nummer:868226-06-6) en diC₁₆ dT (CAS-nummer:1160002-70-9) werden in het laboratorium gesynthetiseerd volgens het protocol gerapporteerd in Referenties [23,24,25]. Sorafenib, 4-[4-[[4-chloor-3-(trifluormethyl)fenyl]carbamoy-lamino]fenoxy]-N -methyl-pyridine-2-carboxamide (CAS-nummer:284461-73-0) werd gekocht bij SynVec http://synvec.fr (Ref# D114250414).

Chromatografie-onderzoeken

Er is een reversed-phase UHPLC-methode (ultra high-perfomance liquid chromatography) ontwikkeld voor nucleolipiden (DOTAU en diC₁₆ dT) en sorafenib-kwantificering in SLN's. Vóór injectie in HPLC werden waterige oplossingen van nanodeeltjes verdund met ethanol met factor 5 en 10, om respectievelijk nucleolipiden en sorafenib te kwantificeren.

Er werd gebruik gemaakt van een chromatografisch systeem UHPLC UltiMate 3000 van Dionex-Thermo Scientific (VS), bestaande uit een pomp met een quaternair klepsysteem voor kolomselectie, een gethermostateerde auto-sampler en een gethermostateerd kolomcompartiment. De scheiding werd uitgevoerd met de kolom Syncronis C18 50 x 2,1 mm, 1,7 m. De mobiele fase bestond uit 70/30 MeOH/25 mM ammoniumacetaat (pH = 7.4) (A) en 26.5 mM ammoniumacetaat in MeOH (pH = 7.9) (B). Er werd een stroomsnelheid van 0,2 ml / min gebruikt en het gradiëntprofiel was 0-2 min, 0-100% B; 2-20 min, 100% B. De kolomtemperatuur werd ingesteld op 25 °C. De detectie werd uitgevoerd bij 267 nm voor sorafenib en diC₁₆ dT en 257 nm voor DOTAU. Het geïnjecteerde volume was 1 μL, wat leidde tot kwantificatielimieten van 0,6 ng voor sorafenib en 15 ng voor zowel nucleolipiden als DOTAU en diC₁₆ dT.

Standaardcurves voor sorafenib, DOTAU en diC₁₆ dT in ethanol worden weergegeven in aanvullend bestand 1:respectievelijk figuren SI1, SI2 en SI3.

Bereiding van sorafenib-nanodeeltjes

Tien milligram sorafenib werd opgelost in 1 ml ethanol en 10 mg NLs (ofwel diC₁₆ dT of DOTAU) werd opgelost in 1 ml ethanol. Honderd microliter NL's, 100 μL sorafenib-oplossingen en 800 μL ethanol werden bij kamertemperatuur met elkaar gemengd en druppelsgewijs toegevoegd aan 10 ml gedestilleerd water onder magnetisch roeren. De oplossing werd gedurende 90 minuten bij 25°C in een ultrasoonbad geplaatst. Ethanol werd onder vacuüm bij 30°C verwijderd en het volume werd op 1 ml ingesteld. Deze oplossing werd tweemaal gesoniceerd met behulp van een ultrasone sonde van 6 mm (Vibracell 75186) gedurende 10 minuten bij 100% van de amplitude met een puls van 2 sec elke 5 sec. Eén milliliter werd gedialyseerd tegen 30 ml gedestilleerd water gedurende 3 × 15 min. Dit volume is aangepast op 2 ml en geconserveerd voor kwantificering van karakterisering en stabiliteitsstudies. Ook werden controle-experimenten gerealiseerd met hetzelfde protocol in afwezigheid van nucleolipiden.

Transmissie-elektronische microscopie (TEM en EDX)

Nanodeeltjes werden zichtbaar gemaakt door microscopie met negatieve kleuring. Tien microliter nanodeeltjes werd gedurende 10 minuten overgebracht naar een met koolstof gecoat koperen rooster. Het monster werd vervolgens gedroogd en gekleurd met 2,5% (w /w ) uranylacetaat gedurende 2 minuten in water. De monsters werden bekeken met een Hitachi H 7650 elektronenmicroscoop. Energie-dispersieve röntgenspectroscopie werd uitgevoerd met behulp van een TECNAI transmissie-elektronenmicroscoop in combinatie met Quantax-X-Flash SVE 6.

Bepaling van deeltjesgrootte en zeta

Zeta en grootte van de deeltjes werden bepaald met behulp van een Zetasizer NanoZS, Malvern. Er werden experimenten uitgevoerd met 40 μL van de nanodeeltjes verdund in 400 μL water en metingen werden uitgevoerd bij 25°C.

Cytotoxiciteitsanalyse

HuH7 en HepG2 werden in monolaag gekweekt in DMEM-Glutamax aangevuld met 10% foetaal kalfsserum. MDA-MB-134 en T-47D werden in monolaag gekweekt in RPMI aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (alleen voor T-47D, niet-essentiële AA 1X, glucose 0,45%, insuline 10 mg L⁻¹ en natriumpyruvaat 1X). Alle kweekreagentia waren van Invitrogen. 10⁴ cellen/putje in 90 μL compleet kweekmedium werden uitgeplaat in een plaat met 96 putjes en 24 uur geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO₂ , voordat u 10 μL SLN of sorafenib aan het kweekmedium toevoegt. Sorafenib (CAS-nummer:284461-73-0) werd opgelost in kweekmedium met 0,1% DMSO. Merk op dat in deze omstandigheden de maximale concentratie van sorafenib zonder precipitatie 5 M was, terwijl voor SLN's geladen met sorafenib de maximale geteste concentratie 120 μM was zonder DMSO. Na 4 dagen incubatie werd de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld met de op formazan gebaseerde proliferatietest (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay-kit, Promega), door toevoeging van 20 μL/well reagensoplossing. Na een incubatie van 30 minuten bij 37 °C, 5% CO₂ , werd de absorptie van elk putje gemeten bij een golflengte van 492 nm met behulp van een Berthold-spectrofotometer. Resultaten worden uitgedrukt als het percentage van \( \frac{{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{behandeld}\ \mathrm{cells}-{\mathrm{OD}}_ {492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{blank}}{\ {\mathrm{OD}}_{492}\mathrm{of}\ \mathrm{onbehandeld}\ \mathrm{cellen}-{\mathrm {OD}}_{492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{blank}} \).

Cell Viability Studies

HuH7 werden gekweekt zoals eerder beschreven in de sectie "Cytotoxiciteitsanalyse". De levensvatbaarheid van de cellen werd uitgevoerd na 4 dagen incubatie met SLN⁺ geladen met sorafenib in verschillende concentraties (0, 1, 5, 10, 25, 50 en 100 μM) met behulp van de levensvatbaarheidstest van levende/dode cellen (Invitrogen). In het kort werd het kweekmedium verwijderd en werden hechtende cellen eenmaal gewassen met Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS). Tweehonderd microliter HBSS met 2 μM calceïne-acetoxymethylester en 4 μM ethidiumhomodimeer-1 werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 45 minuten bij 37 °C en 5% CO₂ geïncubeerd . Na kleuring werden de cellen eenmaal gewassen met HBSS en microscopisch afgebeeld op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Het percentage dode cellen werd bepaald door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) analyse. Na kleuring met 4 μM ethidiumhomodimeer-1-oplossing, werden cellen behandeld met trypsine en tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugeren bij 1000 tpm gedurende 5 minuten. Gegevens werden verkregen op LSRFortessa-flowcytometer van Becton Dickinson en de resultaten werden geanalyseerd met behulp van DIVA-software. Een monster van dode cellen werd bereid met 70% methanol en gebruikt als controle.

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van SLN's

De niet-toxiciteit en de zelfassemblage-eigenschappen van de nucleolipiden maken ze ideale amfifiele adjuvantia voor het inkapselen van hydrofobe geneesmiddelen zoals sorafenib. In deze studie werd een eenvoudige nanoprecipitatieprocedure ontwikkeld om de lage wateroplosbaarheidseigenschappen van sorafenib aan te pakken en de antikankeractiviteit te verbeteren, wat in veel gevallen het klinische gebruik ervan beperkt. Met betrekking tot de oplosbaarheid in water veronderstelden we dat het hydrofobe karakter, de heterocycli en waterstofbindingsfuncties van sorafenib de interacties met nucleolipiden en de vorming van nano-objecten zouden bevorderen. Ook werd verwacht dat SLN's geladen met sorafenib de antitumoractiviteit zouden verhogen door de cellulaire opname van sorafenib te verbeteren. Inderdaad, in een van onze eerdere onderzoeken op cisplatine-nanodeeltjes, hebben we aangetoond dat de versterking van antitumoractiviteiten van cisplatine te wijten was aan een verhoogde hoeveelheid geneesmiddel die in kankercellen werd geïnternaliseerd [23] [1]. Ons nanoprecipitatieproces omvat drie stappen:(i) de solubilisatie van sorafenib in ethanol bij 40 °C (10 mg/ml sorafenib, 100 μL) en toevoeging van één equivalent nucleolipide (ofwel een anionische nucleotide-lipide, de diC₁₆ -3′-dT [thymidine 3′-(1,2-dipalmitoyl-sn -glycero-3-fosfaat)] of een kationisch nucleoside-lipide DOTAU [23] [2′,3′-dioleyl-5′ -deoxy-5′-trimethyl-ammonium-uridine], 100 L van een oplossing van 10 mg/ml in ethanol; (ii) 1 ml van de ethanoloplossing wordt druppelsgewijs bij kamertemperatuur toegevoegd aan 10 ml gedestilleerd water; en (iii) de resulterende suspensie werd verdampt om de overmaat ethanol te verwijderen en gesoniceerd.

Chromatografische onderzoeken

Om de capaciteiten voor het laden van geneesmiddelen van de nieuwe formuleringen te evalueren, werd een UHPLC-methode met omgekeerde fase ontwikkeld. Met behulp van deze HPLC-methode werd de gelijktijdige scheiding van sorafenib en nucleolipiden bereikt in 12 minuten, waardoor de individuele kwantisering van verbindingen in SLN's mogelijk werd (aanvullend bestand 1:figuur SI1-4).

Ladingsverhoudingen (massaverhoudingen van sorafenib/nucleolipiden in nanodeeltjes) van 50 en 80% en inkapselingsopbrengsten van sorafenib van ongeveer 55 en 75% werden verkregen voor formuleringen samengesteld uit sorafenib/DOTAU (SLN⁺ ) en sorafenib/diC₁₆ dT (SLN⁻ ), respectievelijk. Tijdens het controle-experiment dat werd uitgevoerd in afwezigheid van nucleolipide, ging ongeveer 90% van sorafenib verloren tijdens de verschillende stappen van de formulering, waarschijnlijk vanwege de lage oplosbaarheid van sorafenib in water. Dit resultaat toont aan dat nucleolipiden nodig zijn om sorafenib op te lossen en de SLN's te stabiliseren.

Fysisch-chemische studies

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) experimenten werden uitgevoerd om de vorming van SLN's te karakteriseren. Zowel negatieve als positieve nucleolipiden (diC₁₆ dT en DOTAU) vormen vergelijkbare niet-bolvormige nanodeeltjes met parallellepipedumvormen in een waterige oplossing met een monodispersiteit (polydispersiteitsindex, PDI = 0,202 en 0,289; grootte =respectievelijk 335,2 en 304,4 nm, figuur 2 en aanvullend bestand 1:figuur SI7). Zoals verwacht hangen de zeta-potentialen van op SLN gebaseerde objecten af van de nucleolipide poolkoppen (ζ = + 59,1 en − 54,9 mV voor SLN⁺ en SLN⁻ , zie Extra bestand 1:Afbeelding SI10). De aanwezigheid van sorafenib in de NP werd gevalideerd door TEM-beeldvorming en EDX-acquisities van een SLN− werden gerealiseerd met EDX-acquisities. Fig. 2e, f toont I- en II-spots. Vlek I in Fig. 2f vertoont de emissie van een chlooratoom (vlek I, Fig. 2e, f) wat wijst op de aanwezigheid van sorafenib (zie chemische structuur Fig. 2f). Merk op dat chloor alleen aanwezig is in plek I en niet in plek II (Fig. 2f).

Karakterisering van SLN's. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)-beelden die de morfologie van sorafenib-nanodeeltjes met DOTAU tonen (a ) en inzet (b ). Voorbeeld van een op DOTAU gebaseerde SLN met een grootte van 327 bij 172 nm (pijlen), die een gemiddelde grootte van 304 nm bevestigen, gemeten door DLS (d ). c Voorbeeld van een TEM-afbeelding met diC₁₆ dT-SLN's (respectievelijk pijlen 330 bij 500 nm). (e ) TEM-afbeelding van een SLN-. I &II-spots zijn de lokalisaties waar EDX-acquisities werden uitgevoerd. (f ) EDX-spectra op I &II-posities. Stippellijn benadrukte de emissie van chlooratoom, dat alleen aanwezig is in I. De chemische structuur van het sorafenib-molecuul wordt ook gepresenteerd. Beide spectra werden genormaliseerd met Cu-atoomemissie bij 8 keV (vanwege TEM Cu-raster)

Belangrijk is dat in controle-experimenten de nanopreciptatie van sorafenib in afwezigheid van nucleolipiden geen aanleiding gaf tot enig nano-object, wat aantoont dat de nucleolipiden de vorming en stabilisatie van de SLN's mogelijk maken.

Stabiliteitsonderzoeken

Colloïdale stabiliteit van SLN⁺ en SLN⁻ werden gemeten door DLS en zeta-potentiaal bij twee temperaturen (Fig. 3a en Aanvullend bestand 1:Figuur SI10). In het geval van diC₁₆ dT-gebaseerde formuleringen, de grootte van SLN⁻ werd niet gewijzigd na 30 dagen bij zowel 4 als 37 ° C, wat wijst op een hoge stabiliteit van die nanodeeltjes (aanvullend bestand 1:figuur SI9). Een dergelijke stabiliteit kan worden verklaard door de aard van de interacties (met H-bindingen, π -π stapelen, lading/lading interactie) optredend tussen de diC₁₆ dT en sorafenib. Voor op DOTAU gebaseerde formuleringen geldt echter SLN⁺ waren slechts 30 dagen stabiel bij 4 ° C, zoals onthuld door DLS-onderzoeken (Fig. 3a), terwijl bij 37 ° C een toename van zowel de grootte als de PDI werd waargenomen (Fig. 3a). Deze relatieve instabiliteit waargenomen bij 37 °C in het geval van SLN⁺ kan worden verklaard door afstotelijke coulomb-interacties die optreden tussen de positieve ladingen van zowel sorafenib als DOTAU. Interessant is dat de colloïdale stabiliteitsstudies aangeven dat het mogelijk is om de stabiliteit te moduleren, vandaar de afgifte van sorafenib van de SLN's aan de fysiologische omgeving, afhankelijk van het nucleolipide dat wordt gebruikt voor de stabilisatie van de SLN's. De stabiliteitsmodulatie kan aantrekkelijk zijn, afhankelijk van de benodigde kinetiek van afgifte.

Stabiliteitsstudies van SLN's. Colloïdale stabiliteit van SLN⁺ (een ) en chemische stabiliteit van sorafenib en DOTAU in SLN⁺ versus tijd bij 4 en 37 °C (b ). PDI, polydispersiteitsindex

Parallel aan de colloïdale stabiliteit, is de chemische stabiliteit van sorafenib, DOTAU en diC₁₆ dT in de op SLN gebaseerde formuleringen werd onderzocht als functie van de tijd bij 4 en 37 ° C met behulp van een nieuwe chromatografische methode (zie aanvullend bestand 1:figuur SI4). Kinetische studies bij beide temperaturen worden getoond in Afb. 3b en Aanvullend bestand 1:SI5 voor DOTAU-SLN's en diC₁₆ dT-SLN's, respectievelijk. De resultaten laten zien dat sorafenib en diC₁₆ dT-moleculen in formuleringen blijven ten minste 1 maand stabiel, wat wijst op een langdurige chemische stabiliteit bij beide temperaturen in het geval van SLN⁻ . Er werd echter een afname van DOTAU gedurende de tijd waargenomen in de SLN⁺ formuleringen. Eerst werden bij 4 °C verliezen gemeten van ongeveer 12% over 7 dagen en 20% over 30 dagen. Bij het verhogen van de temperatuur nam de DOTAU-stabiliteit af met een verlies van 55% over 7 dagen en tot 95% over 30 dagen bij 37 °C. Dergelijke verschillen in chemische stabiliteit tussen nucleolipiden werden al aangetoond tijdens eerdere stabiliteitsonderzoeken (zie aanvullend bestand 1:figuur SI6).

Biologische studies

SLN-cytotoxiciteit werd beoordeeld aan de hand van metabolismeactiviteiten en morfologieën van cellen. MTT-assay maakte het mogelijk om vrije sorafenib (in 0,1% van DMSO) en SLN's geladen met het medicijn (Fig. 4) te vergelijken op vier cellijnen, waaronder twee hepatocarcinomen (HuH7 en HepG2) en twee luminale borstkankers (MDA-MB-134 en T- 47D). Ten eerste bij concentraties die dicht bij de maximale oplosbaarheid van vrij sorafenib liggen (5 M sorafenib in 0,1% DMSO, 2,8 μM voor sorafenib/DOTAU en 4 μM voor sorafenib/diC₁₆ dT-nanodeeltjes), remden beide SLN's de levensvatbaarheid van de cellen beter dan vrij sorafenib. Zoals getoond in Fig. 4b, gaf een cellevensvatbaarheidsonderzoek uitgevoerd op MDA-MB-134-cellen aan dat de activiteit van vrij sorafenib wordt beperkt door zijn oplosbaarheid in water (100% van de levensvatbaarheid van de cellen bij [sorafenib] = 5 μM), terwijl IC₅₀ waarden van 15 en 50 μM werden waargenomen voor SLN⁺ en SLN⁻ , respectievelijk (Fig. 4b). In een FACS-onderzoek op HuH7, een IC₅₀ van ongeveer 50 μM werd verkregen (aanvullend bestand 1:Figuren SI12 en SI13). Beelden van fasecontrastmicroscopie tonen inderdaad een verminderde dichtheid van de cellagen behandeld met ofwel SLN⁻ en SLN⁺ vergeleken met onbehandelde of met sorafenib behandelde cellen zonder wijziging van de celmorfologie (aanvullend bestand 1:Afbeelding SI11). Ten tweede werden vergelijkbare experimenten uitgevoerd bij hogere concentraties SLN's ([sorafenib] = 120 en bij 84 μM voor SLN⁻ en SLN⁺ , respectievelijk) en vergeleken met vrij sorafenib bij zijn oplosbaarheidsgrens (concentratie van 5 μM). In deze omstandigheden vertonen beide SLN's een sterk cytotoxisch effect op de vier kankercellijnen, zoals weergegeven in Fig. 5. Zoals blijkt uit de fasecontrastmicroscopiebeelden, werd celafval waargenomen voor beide SLN⁻ (Fig. 5C1-4) en SLN⁺ (Fig. 5D1-4) waaruit celdood blijkt, terwijl cellen in leven blijven in het geval van vrij sorafenib (Fig. 5B1-4). Het is vermeldenswaard dat sterke cytotoxische effecten voor beide SLN's werden waargenomen in het geval van luminale B-borstkankercellen (Fig. 5C1–2 en D1–2). Een dergelijk antitumoreffect, dat niet eerder zo werd gerapporteerd, opent een nieuwe mogelijke therapeutische toepassing van sorafenib dankzij de SLN's.

Cytotoxiciteitseffect van sorafenib of SLN's. een ) Vergelijking van de cytotoxiciteit met vrije sorafenib of SLN's van sorafenib in 4 cellijnen (2 luminale B-borstkanker en 2 hepatocarcinomen) na kwantificering met MTS-assay op 3 putjes bij 5 μM vrij sorafenib, 2,8 μM NP's Sorafenib/DOTAU (SLN+ ) en 4 μM NP's Sorafenib/diC16dT (SLN-). b ) Cellevensvatbaarheidstest (MDA-MB-134-cellen) in aanwezigheid van vrij sorafenib (beperkte oplosbaarheid), SLN+ (grijs) of SLN- (zwart)

Vergelijking van celmorfologieën tussen controle, gratis sorafenib of SLN's. Fasecontrastmicroscopiebeelden die cytotoxiciteit tonen in verschillende omstandigheden op vier menselijke carcinoomcellijnen (de hepatocarcinomen, HuH7, HepG2 en het luminale borstcarcinoom MDA-MB-134, T-47D). A) Bij afwezigheid van sorafenib (controle-experimenten, A1 –A4 voor respectievelijk MDA-MB-134, T-47D, HuH7, HepG2, cellijnen). B) Cellen werden gedurende 4 dagen geïncubeerd in aanwezigheid van 5 μM vrij sorafenib. C en D) cellen geïncubeerd in aanwezigheid van SLN⁻ en SLN⁺ bij respectievelijk 84 en 120 μM in concentratie van sorafenib

Conclusie

We rapporteren een nieuwe benadering op basis van nucleolipiden die de efficiënte inkapseling en afgifte van sorafenib mogelijk maakt. Onze onderzoeken tonen de vorming aan van twee soorten vaste lipide-nanodeeltjes (SLN's) die sterk beladen zijn met sorafenib. Deze SLN's, die ofwel negatieve ofwel positieve zeta-potentialen tonen, hebben parallellepipedumvormen. Zoals onthuld door de DLS- en HPLC-onderzoeken, kan de stabiliteit van de SLN's worden gemoduleerd, afhankelijk van het gebruikte nucleolipide. Belangrijk is dat zowel SLN⁺ en SLN⁻ formuleringen kunnen de oplosbaarheid in water van sorafenib drastisch verbeteren (concentraties hoger dan 120 μM). Dergelijke SLN's vertonen betere antitumorale activiteiten op vier kankercellijnen (lever- en borstkankers) in vergelijking met vrij sorafenib, dat beperkt is vanwege zijn gebrek aan oplosbaarheid in water. Contrastfasemicroscopiebeelden, opgenomen op de vier kankercellijnen, vertonen een drastische celsterfte wanneer ze worden geïncubeerd met 120 μM SLN⁻ of 84 μM SLN⁺ . Daarom zou dit medicijn kunnen worden gebruikt als de nieuwe therapeutische opties in het geval van leverkanker (gebruik van sorafenib bij intra-arteriële chemotherapie bijvoorbeeld) of borstkanker. Voor zover wij weten, is dit rapport het eerste voorbeeld van een onderzoek met sorafenib tegen luminale B-borstkankers die het nut van de SLN-benadering aantoont. Al met al benadrukken de resultaten die in deze bijdrage worden gerapporteerd het potentieel van op nucleoside-lipiden gebaseerde SLN's als medicijnafgiftesystemen.

Afkortingen

AFNH₄ :: Ammoniumformiaat
DLS:: Dynamische lichtverstrooiing
FA:: Mierenzuur
HCC:: Hepatocellulair carcinoom
HPLC:: Krachtige vloeistofchromatografie
LN's:: Lipide nanodeeltjes
MeOH:: Methanol
PDI:: Polydispersiteitsindex
RCC:: Niercelcarcinoom
SLN's:: Vaste lipide nanodeeltjes
UHPLC:: Ultra high-performance vloeistofchromatografie

Onderzoek naar het weerstandsschakelgeheugen op meerdere niveaus en de van de geheugentoestand afhankelijke fotospanning in Pt/Nd:SrTiO3-knooppunten Mesoporeuze nikkeloxide (NiO) nanopetals voor ultragevoelige glucosewaarneming

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal