Verbeterde antitumorwerking en farmacokinetiek van bufalin via gePEGyleerde liposomen

Methoden

Chemische stoffen en reagentia

Bufalin (≥ 98% in zuiverheid) werd gekocht bij BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (Baoji, Shaanxi, China). L-α-fosfatidylcholine, cholesterol en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout; DSPE-PEG₂₀₀₀ ) werden gekocht bij Sigma Chemical Co., Ltd. (St. Louis, MO, VS) (de molecuulformules van deze stoffen werden weergegeven in aanvullend bestand 1:figuur S1). Het gebruikte acetonitril was van spectroscopische kwaliteit en gekocht bij Honeywell (Amerika). Chloroform en alcohol (analytische kwaliteit) werden gekocht bij Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (China). Alle chemicaliën waren van analytische of hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) kwaliteit. En het water werd gedeïoniseerd met behulp van het Millipore-waterzuiveringssysteem (Milford, MA, VS) en gefilterd met een membraan van 0,22 m.

Dieren en cellen

Deze studie is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health. Het protocol is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de vierde militaire medische universiteit (Shaanxi, China) (goedkeuring 2015-1013-R). Alle operaties werden uitgevoerd onder narcose met natriumpentobarbital en er werd alles aan gedaan om het lijden tot een minimum te beperken. Mannelijke Sprague-Dawley-ratten, die aanvankelijk 250 ± 20 g wogen, werden verkregen van de Vierde Militaire Medische Universiteit (Xi'an, China). SW620-, PC-3-, MDA-MB-231-, A549-, U251-, U87- en HepG2-cellijnen werden respectievelijk gekocht bij Shanghai Cell Bank of het Experimental Animal Center van de Vierde Militaire Medische Universiteit, gekweekt in RPMI 1640 aangevuld met 10% ( v /v ) foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica (100 E/ml penicilline G en 0,1 mg/ml streptomycine). De cellen werden in hun exponentiële groeifase gehouden in een atmosfeer van 5% CO₂ en 90% relatieve vochtigheid bij 37 °C.

Synthese van met bufalin geladen liposomen

Liposomen werden bereid als een batchgrootte van 10 ml met behulp van hogedrukhomogenisatie. De gebruikte hoeveelheid bufaline was in alle liposomen gelijk. In het kort werden met bufaline beladen gewone liposomen bereid met een samenstelling van bufaline, cholesterol en L-a-fosfatidylcholine in een molaire verhouding van 10:30:60; met bufaline geladen PEGylated liposomen werden gesynthetiseerd met een samenstelling van bufaline, cholesterol, L-α-fosfatidylcholine en DSPE-PEG₂₀₀₀ in een molverhouding van respectievelijk 10:30:55:5.

De bovenstaande fosfolipidemengsels werden volledig gedispergeerd in 3 ml chloroform en vervolgens werd de chloroform volledig vervluchtigd door een roterende verdamper bij 50°C onder decompressieconditie. Vervolgens werd het resterende oplosmiddel (indien aanwezig) gedroogd door een nacht in een vacuümexsiccator te plaatsen, en vervolgens werd de bereide droge dunne film gerehydrateerd met behulp van een vortex in 10 ml voorverwarmd gedeïoniseerd water van 50 °C bij 10 mmol/ml fosfolipide gedurende 15 minuten. Het aldus gevormde mengsel werd verder verwerkt met homogenisatie onder hoge druk. De druk en tijd van homogenisatie werd geoptimaliseerd, wat 500 bar bij 35 ° C bleek te zijn, en het proces is 10 keer gerecycled. De resulterende liposoomsuspensie werd onmiddellijk tweemaal geëxtrudeerd met een Lipex-extruder (ATS, Canada) met behulp van polycarbonaatmembranen (0,2 μm poriegrootte, Whatman, Maidstone, VK) om unilamellaire liposomen te vormen. Blanco liposomale suspensie is ook bereid met dezelfde methode als eerder beschreven door de stap van toevoeging van bufaline weg te laten.

Karakterisering van met bufalin geladen liposomen

Deeltjesgrootte en zeta-potentieel

De deeltjesgrootte en zeta potentiaal van de liposomen werd bepaald door dynamische lichtverstrooiingstechniek met behulp van de zeta potentiaalanalysator (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, Californië, VS). Alle bufalineliposomen werden verdund met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een geschikte concentratie voordat de grootteverdeling en zeta werden bepaald. potentieel. De metingen zijn uitgevoerd in de volautomatische modus.

Hoge resolutie transmissie-elektronenmicroscopie

De bufalineliposomen werden verder gekarakteriseerd met hoge resolutie transmissie-elektronenmicroscopie (HR-TEM) studies. De bufaline liposomale suspensie ondersteund op een 300 mesh koperen rooster werd negatief gekleurd met 1% (w /v ) fosfowolfraamzuur. De directe beeldvorming van de morfologie werd uitgevoerd bij acceleratiespanningen van 200 kV met behulp van een TEM (Hitachi H-7650, Tokyo, Japan).

Entrapment-efficiëntie

Het bufalinegehalte werd geanalyseerd met de HPLC-methode. Het Shimadzu HPLC-systeem (Kyoto, Japan) was uitgerust met een LC-20AT-pomp, SPO-M20A diode-arraydetector, CTO-10AS VP-kolomoven en SIL-10AF autosampler. Alle scheidingen werden uitgevoerd op een SinoChrom ODS-BP C18-kolom (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, Yillite) (Yillite, Dalian, China). Het injectievolume was 20 L en het kolomeffluent werd gecontroleerd bij 296 nm. Gegevens werden verkregen en verwerkt met behulp van ClassVP-software. De mobiele fase bestond uit een mengsel van acetonitril:0,1% kaliumdiwaterstoffosfaat (met fosforzuur om de pH-waarde van 3,8 aan te passen) met gradiëntelutie (50:50, v) /v ). Chromatografie werd uitgevoerd met een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. Voor het bepalen van de invangefficiëntie werd 1,0 ml bufaline-liposomale suspensie toegevoegd aan de Sephadex G50-kolom en geëlueerd met PBS. Het blauwachtige deel van het effluent werd opgevangen en aangevuld tot 10,0 ml (het eindvolume) door PBS toe te voegen. Het bedrag (W ₁ ) van bufaline in de liposomale suspensie werd bepaald met de HPLC-methode. PBS werd toegevoegd aan de andere portie van 1,0 ml bufaline liposomale suspensie, om het uiteindelijke volume te bereiken tot 10,0 ml, en de hoeveelheid (W ₂ ) bevatte bufaline werd op dezelfde manier bepaald. Het percentage bufaline dat in bufaline-liposomen is opgesloten, werd berekend met de formule:

In vitro stabiliteitsonderzoek

De invangefficiëntie getest met de Sephadex-chromatografiemethode en de deeltjesgrootte bepaald met zeta potentiaalanalysator werden toegepast om het stabiliteitsprofiel te beoordelen na opslag bij 4 ° C op dagen 0, 7, 15, 30 en 90. Op de vijf tijdstippen werd 200 μL liposoomsuspensie opgezogen voor het bepalen van de liposomale lekkageverhouding. Onmiddellijk werd vrij bufaline van 200 μL liposoomsuspensie gescheiden met behulp van Sephadex G50-kolomchromatografie en werd de hoeveelheid vrij bufaline bepaald met de HPLC-methode. De liposomale lekkageverhouding werd berekend met de formule:

In vitro afgifte van bufalin

Het in vitro afgiftegedrag van bufaline uit liposomen werd uitgevoerd met behulp van dialysezaktechniek bij 37 ° C zoals eerder beschreven met enige wijziging. PBS (pH =7,4) met 10% foetaal kalfsserum werd gebruikt als afgiftemedium. Het vrije geneesmiddel werd uit de bufalineliposomen verwijderd door uitputtende dialyse gedurende 4 uur tegen PBS-buffer bij 4 ° C. In het kort werd 1,0 ml bufaline-liposomale suspensie gepipetteerd in een dialysebuis (Spectrumlabs, VS; MWCO 30 kDa) onder zacht horizontaal schudden (120 tpm/min) bij kamertemperatuur. De dialysebuis werd bewaard in 50 ml PBS (pH =7,4) met 10% foetaal kalfsserum en de temperatuur werd op 37 °C gehouden. Het dialysaat werd uit het medium gehaald en vervangen door een gelijk volume verse PBS op verschillende tijdsduren, nl. uur 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 en 48. De concentratie van vrijgekomen bufaline werd gemeten met HPLC zoals eerder beschreven.

Cytotoxiciteit

In vitro cytotoxiciteitsonderzoeken werden uitgevoerd met behulp van MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide)-assay op verschillende soorten tumorcellijnen, waaronder SW620, PC-3, MDA-MB- 231, A549, U251, U87 en HepG2. Bovendien werden U87- en U251-cellen geselecteerd om de cytotoxische effecten van met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen op glioomtumorcellen te meten. U87- en U251-cellen werden respectievelijk uitgezaaid in microtiterplaten met 96 putjes bij 1,0 × 10 ⁵ cellen/putje en laten hechten (37 °C, 5% CO₂ ) gedurende 24 uur, waarna het medium werd opgezogen en vervangen door 0,1 ml vers medium. Bufaline-entiteit, blanco liposomen, blanco gePEGyleerde liposomen, met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen werden verdund in compleet medium en toegevoegd aan cellen in een totaal volume van 0,1 ml om de gewenste eindconcentratie te bereiken; voor de controle werd geen testoplossing toegevoegd. De blanco liposomen en blanco gePEGyleerde liposomen werden geëvalueerd om de toxiciteit te testen van hulpstoffen die gebruikt werden bij de bereiding van bufaline liposomen. Na 24 uur werd de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld door incuberen in een groeimedium dat 5 mg/ml MTT bevat gedurende 4 uur bij 37 °C. Na aspiratie van het kweekmedium werden de gevormde formazankristallen opgelost met 200 μL organisch oplosmiddel. De absorptie is gemeten op een microplaatlezer bij een golflengte van 570 nm.

In vivo farmacokinetische studie van bufalin-liposomen met behulp van HPLC-methode

De farmacokinetische studie werd uitgevoerd om de absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding van bufaline uit gewone liposomen of lang circulerende liposomen te evalueren en om de verschillen in biologische beschikbaarheid van bufaline te onderzoeken met behulp van HPLC-techniek.

In dit experiment werden jonge, gezonde volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten, met een gewicht van 250 ±   20 g, gekocht bij de Vierde Militaire Medische Universiteit (Xi'an, China). De ratten werden gehuisvest in goed geventileerde kooien bij kamertemperatuur (24 ± -2 ° C) en 40-60% relatieve vochtigheid terwijl ze een normale licht-donkercyclus van 12 uur volgden. Voorafgaand aan het experiment werden de dieren minimaal 3 dagen geacclimatiseerd. Dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Vierde Militaire Medische Universitaire Dierethiekcommissie.

Met bufaline beladen liposomen, met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen en bufaline in waterige suspensie-geassisteerde solubilisatie door ethanol werden bereid zoals eerder beschreven en vervolgens intraveneus toegediend in een equivalente dosis van respectievelijk 0,5 mg/kg. Bloedmonsters werden verzameld uit de fossa orbitalis wein van ratten onder lichte anesthesie met ether in microfugebuisjes die heparine als anticoagulans bevatten op 2, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 600 min post- dosering en vervolgens gecentrifugeerd bij 3500 r/min gedurende 15 min bij 4 ° C. Het afgescheiden plasma werd vóór de test bevroren bewaard bij -20 °C.

Monstervoorbehandeling

Een eenvoudige vloeistof-vloeistofextractiemethode werd gevolgd voor extractie van bufaline en interne standaard uit rattenbloed. Tot 200 L werd een interne standaardoplossing (20 μL van 100 μg/ml cinobufagine werkvoorraad) equivalent aan 10,0 μg toegevoegd en gedurende 10 s gemengd op een cyclomixer, gevolgd door extractie met 3,0 ml ethylacetaat:petroleumether, 1:1(v /v ) en mengsel. Het mengsel werd gedurende 5 minuten gevortext, gevolgd door 15 minuten centrifugeren bij 4000 t/min op Sigma 3-16k (Frankfurt, Duitsland). Een hoeveelheid van 3,0 ml organische laag werd afgescheiden en onder stikstof drooggedampt en vervolgens werd het residu opnieuw opgelost in 200 μL acetonitril. Twintig microliter supernatantvloeistof werd voor analyse op de analytische kolom geïnjecteerd na 15 minuten centrifugeren bij 12.000 r/min.

Farmacokinetische analyse

De waargenomen maximale bloedconcentratie (C _max ) en de halfwaardetijd (T _1/2 ) werden verkregen door visuele inspectie van de experimentele gegevens. De gegevens werden onderworpen aan niet-compartimentele farmacokinetische analyse met behulp van Drug and Statistics (DAS 2.1.1), opgesteld door de wiskundige farmacologische professionele commissie van de Chinese Pharmacological Society voor klinische evaluatie van geneesmiddelen. De gegevens werden geanalyseerd volgens een open model met twee compartimenten.

Statistische analyse

Alle resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (n = 3), en verschillen tussen formuleringen werden vergeleken door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), met behulp van GraphPad Prism 5-software. P < 0,05 geeft in alle gevallen significantie aan.

Resultaten

Fysisch-chemische eigenschappen

Filmrehydratatie gecombineerd met hogedrukhomogenisatietechnologie werd gebruikt voor de bereiding van met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen. Filmrehydratatie is een van de conventionele methoden om liposomen te synthetiseren met volwassen en gecontroleerde processen om lipofiele geneesmiddelen in te sluiten. Bovendien speelt het aantal homogenisatiecycli een sleutelrol om een ​​uniforme en stabiele liposomale suspensie te verkrijgen.

De morfologieën van met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen zijn ofwel bijna bolvormig of ovaal zoals waargenomen door TEM, zoals weergegeven in Fig. 1. Volgens het TEM-beeld zijn de gemiddelde deeltjesgrootten van met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen PEGylated liposomen waren beide onder de 200 nm. De gemiddelde deeltjesgrootte van met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen waren respectievelijk 127,6 ± 3,64 nm en 155,0 ± 8,46 nm (Fig. 1c), gemeten door zeta potentiaalanalysator (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, Californië, VS). Vergeleken met met bufaline beladen liposomen vertoonden met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen een negatieve oppervlaktelading, wat wijst op uitstekende stabiliteit (met bufaline beladen liposomen 2,24 mV; met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen −18,05 mV, aanvullend bestand 2:Tabel S1). Bovendien zijn de uitkeringen van zeta potentieel is te zien in figuur 1b. De invangefficiëntie van bufaline in met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen bepaald door HPLC is echter respectievelijk 76,31 ±-3,40% en 78,40 ± 1,62%.

Fysisch-chemische eigenschappen van met bufaline geladen liposomen en met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen. een TEM-beelden van met bufaline geladen liposomen en met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen met een bijna bolvormige of ovale vorm. b De typische deeltjesgrootte en verdeling van met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen zoals gemeten door dynamische lichtverstrooiing. c De typische oppervlakte zeta potentieel van met bufaline geladen liposomen en met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen

In vitro stabiliteitsonderzoek

De stabiliteitsprofielen van met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen worden weergegeven in tabel 1. Bovendien is ook de liposomale lekkageverhouding berekend. Voor met bufaline beladen liposomen waren de resultaten respectievelijk 0,0, 16,7, 25,2, 27,9 en 30,6% bij 4 °C op dag 0, 7, 15, 30 en 90. Voor met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen waren de resultaten respectievelijk 0,0 , 5,0, 8,8, 14,5 en 18,0% bij 4 °C op dagen 0, 7, 15, 30 en 90.

In vitro afgifteprofiel

Bufaline-afgifteprofiel van met bufaline beladen liposomen of met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen is samengevat in Fig. 2. Uit de experimentele gegevens, in dezelfde oplosmedia, kon bufaline snel en zonder beperkingen diffunderen in PBS met 10% foetaal kalfsserum, gevolgd door bufaline -geladen liposomen en ten slotte met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen.

In vitro afgifte van bufaline uit met bufaline beladen gewone liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen in fosfaatbuffer met oplossingsmedia, pH 7,4. Gegevens zijn gemiddelden ± SD, n = 3

Cytotoxiciteit

De cellevensvatbaarheid van verschillende soorten tumorcellijnen die worden aangetast door bufaline-entiteit worden getoond in Fig. 3a wanneer getest met MTT-assay, en hun halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀ ) worden ook berekend in Aanvullend bestand 2:Tabel S2. Bufalin veroorzaakte de remming van de groei in meerdere tumorcellen op een dosisafhankelijke manier, terwijl de resultaten van IC₅₀ onthulde dat bufaline gevoeliger was voor respectievelijk U251- en U87-glioomkankercellen dan de andere geteste kankercellen. Wanneer toegepast met bufaline-entiteit, met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen, worden de cellevensvatbaarheid van U251 uitgevoerd door MTT-assay getoond in Fig. 3b. Bij 12 uur kweken vertoonden de cellevensvatbaarheid van bufaline-entiteit, met bufaline geladen liposomen en met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen anders, terwijl die van blanco liposomen en blanco gePEGyleerd liposoom niet veranderden. Zoals beschreven was bij hetzelfde concentratieniveau de cellevensvatbaarheid van U251 in de met bufaline beladen gePEGyleerde liposoomgroep altijd lager dan die in de met bufaline beladen liposoomgroep; ondertussen waren de effecten van de bufaline-entiteit op de levensvatbaarheid van cellen minimaal.

In vitro cytotoxiciteit van blanco liposomen, blanco gepegyleerde liposomen, bufaline-entiteit, met bufaline geladen liposomen en met bufaline geladen gepegyleerde liposomen tegen tumorcellen. een Cellevensvatbaarheid van verschillende soorten tumorcellijnen bij verschillende concentraties van bufaline-entiteit. b Cellevensvatbaarheid van U251-cellen bij verschillende concentraties van blanco liposomen, blanco gePEGyleerde liposomen, bufaline-entiteit, met bufaline geladen liposomen en met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen

In vivo farmacokinetisch onderzoek

Methodevalidatie

De kalibratiecurve werd uitgezet op basis van lineaire regressieanalyse van bezwaar tegen interne standaard piek-oppervlakverhouding (y ) versus concentraties (x , g/mL) bufaline in de standaardoplossing in zeven verschillende concentraties. Regressievergelijking was y = 0.4238 x + 0,2429 (lineair bereik 0,05–10,0 μg/ml) en correlatiecoëfficiënten (R ² ) waren 0,9965. De detectielimiet (LOD)-waarde was 0,01 μg/ml, wat werd berekend als de hoeveelheid van het geïnjecteerde monster die een signaal-ruisverhouding van 3 (S/N) opleverde. = 3).

Specificatie, precisie en herstel

De mate van interferentie door endogene stoffen werd beoordeeld door inspectie van chromatogrammen afgeleid van bewerkte blanco plasmamonsters. Aanvullend bestand 3:Afbeelding S2 toont typische chromatogrammen van blanco plasma, blanco plasma verrijkt met bufaline, blanco plasma verrijkt met bufaline en resibufogenine (als interne standaard), plasmamonsters verrijkt met resibufogenine 30 min na intraveneuze toediening van bufaline, plasmamonsters verrijkt met resibufogenine 30 min na intraveneuze toediening van met bufaline geladen liposomen en plasmamonsters verrijkt met resibufogenine 30 min na intraveneuze toediening van met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen. Bufalin en resibufogenine werden geëlueerd bij respectievelijk ongeveer 7,191 en 10,131 min. Er werden geen pieken van interfererende en liposoommembraanmaterialen gevonden bij de retentietijd van bufaline of interne standaard. De resultaten van de precisie- en hersteltests worden geïllustreerd in tabel 2.

Farmacokinetiek

De bloedconcentratie-tijdprofielen van met bufaline beladen liposomen, met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen en de vergelijking met bufaline-entiteit in waterige suspensie worden getoond in Fig. 4. De gemiddelde farmacokinetische parameters worden weergegeven in Tabel 3. De resultaten toonden aan dat er significante verschillen in de meeste van deze parameters onderling, en de C _max van met bufaline beladen liposomen was minder dan de bufaline-entiteit, terwijl die van met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen het minst was. Bovendien is de T _1/2z verhouding van met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen tot bufaline-entiteit en met bufaline beladen liposomen tot bufaline-entiteit waren ongeveer 2,15-voudig (87,84 min/40,52 min) (P < 0,01) en 1,34-voudig (54,40 min/40,52 min) (P <-0,05), respectievelijk. De AUC_{(0–t )} verhouding van met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen tot bufaline-entiteit en met bufaline beladen liposomen tot bufaline-entiteit waren ongeveer 5,49-voudig (139.157,83 ng/(mL min)/25.334,27 ng/(mL min)) (P <0,01) en 2,28-voudig (57751,88 ng/(mL min)/25.334,27 ng/(mL min)) (P < 0,01), respectievelijk. Het onthulde dat de bufaline-entiteit snel in de bloedbaan werd geklaard en dat het liposoompreparaat de geneesmiddelconcentratie in het plasma verhoogde en de klaring weerstond. Bovendien zou modificatie van PEG dit effect kunnen vergemakkelijken.

Concentratie-tijdcurve van bufaline in plasma bij ratten

Discussie

Deze studie bereidde met bufaline beladen liposomen en met bufaline beladen gePEGyleerde liposomen met succes door de rehydratatiemethode van de homogenisatiefilm, die beide een optimaal groottebereik en een lage polydispersiteit hadden en gemakkelijk konden worden gereproduceerd in een grote batchgrootte. Uit deze studie bleek dat liposomale formulering de oplosbaarheid van bufaline aanzienlijk verbeterde.

Met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen vertoonden een negatieve oppervlaktelading met een grotere absolute waarde dan de met bufaline geladen liposomen met een positieve oppervlaktelading. De zeta potentiaal wordt voornamelijk bepaald door de oppervlakte-eigenschappen. De ongewijzigde met bufaline beladen liposomen waren neutraal en hun potentieel lag over het algemeen binnen ±  5 mV. DSPE wordt echter niet geladen onder neutrale omstandigheden, maar het bereidingsproces kan niet volledig neutraal zijn, dus DSPE is negatief geladen. Ondertussen is de zeta potentiaal van macromolecuul PEG is ongeveer negatief voor enkele millivolt, bijna neutraal negatief potentiaal. Daarom, na de oppervlaktemodificatie van DSPE-PEG₂₀₀₀ op met bufaline geladen liposomen, de zeta potentieel van met bufaline geladen PEGylated liposomen is negatief. Deze bevindingen suggereren dat de oppervlaktemodificatie van DSPE-PEG₂₀₀₀ verandert de elektrische oppervlaktepotentiaal van liposomen, wat hun stabiliteit verbeterde. Het was bevestigd door een in vitro stabiliteitstest. Li et al. [12] maakte gebruik van een liposoom-co-delivery-systeem dat anti-CD40-mAb's koppelde aan het oppervlak van gePEGyleerde liposomen omwikkeld met bufaline. De liposomen werden gesynthetiseerd met een samenstelling van bufaline, cholesterol, EPC, DSPE-PEG₂₀₀₀ , en DSPE-PEG₂₀₀₀ -Mal in een molverhouding van respectievelijk 20:55:5:5:15. Vervolgens werd anti-CD40 monoklonaal antilichaam aan de liposomen geconjugeerd door middel van de maleïmide-thiolreactie voor de bereiding van bufaline liposoom-verankerd anti-CD40. Met betrekking tot het stabiliteitsprofiel wordt alleen vermeld dat de negatieve oppervlaktelading een uitstekende stabiliteit suggereert zonder duidelijke en definitieve gegevensbeschrijving.

Li et al. [13] bereid met bufadienolide geladen liposoom (BU-lipo) bestaande uit Lipoid E-80® 1,25% en cholesterol 0,06%. De efficiëntie van het invangen van bufaline, cinobufagine en resibufogenine was respectievelijk 86,5, 90,0 en 92,1%. Gezien de stabiliteit van fosfolipiden, werd pH 6,5 gekozen voor de BU-lipo-formulering. De eigenschappen van BU-lipo, zoals pH, PSD, zeta het potentiaal en de efficiëntie van de beknelling veranderden niet gedurende ten minste 3 maanden bij 2-8 °C. De bewaarconditie moest echter strikt worden gecontroleerd. Een stabieler preparaat bij neutrale pH moet worden bestudeerd om de transport- en opslagkosten te verlagen, waarmee rekening moet worden gehouden voor de toekomstige klinische toepassing.

Volgens de formulering van het preparaat van de eerdere onderzoeken hebben we de experimenten over met bufaline geladen liposomen gerepliceerd. De stabiliteit van liposomen voldeed echter niet aan de productiebehoeften.

In de huidige studie werden met bufaline geladen PEGylated liposomen gesynthetiseerd met een samenstelling van bufaline, cholesterol, L-α-fosfatidylcholine en DSPE-PEG₂₀₀₀ in een molverhouding van respectievelijk 10:30:55:5. Vooral voordat het werd geëxtrudeerd met een Lipex-extruder met behulp van polycarbonaatmembranen, werd het aldus gevormde mengsel verder verwerkt met homogenisatie onder hoge druk.

Bij opslag in neutrale pH bij 4 ° C gedurende 3 maanden, namen de deeltjesgroottes van beide liposomen iets toe en nam de insluitingsefficiëntie over het algemeen bescheiden af, wat handig zal zijn voor klinische toepassing. Een TEM-foto toonde aan dat een dikke driedimensionale wolkachtige structuur het oppervlak van met bufaline beladen liposomen bedekte, wat aangeeft dat DSPE-PEG₂₀₀₀ speelt een rol bij sterische stabilisatie vanwege de amfifiele lineaire polymeerstructuur.

Een in vitro afgifte-onderzoek onthulde dat de afgifte van bufaline uit met bufaline geladen liposomen en met bufaline geladen gePEGyleerde liposomen vertraagd was in dezelfde oplosmedia, terwijl de bufaline-entiteit snel en zonder beperkingen in PBS diffundeerde. De oppervlaktemodificatie van DSPE-PEG₂₀₀₀ altered the barrier properties of the aqueous boundary layer and the permeability of the membrane, resulting in a low release velocity of bufalin from liposomes.

Regarding cytotoxicity study, bufalin caused an obvious inhibition of growth in multiple tumor cells in a dose-dependent manner, while the results of IC₅₀ indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.