Een nieuwe methode zonder organisch oplosmiddel voor gerichte nanodrug voor verbeterde werkzaamheid tegen kanker

Resultaten en discussie

Synthese van het FA-Chitosan-conjugaat

Eerst hebben we FA aan chitosan geconjugeerd door een amideringsreactie tussen de carboxyl-eindgroep van FA en het amidogeen van chitosan (figuur 1). De structuur van de conjugatie (CS-FA) werd bevestigd door Fourier-transformatie infrarood (FT-IR) spectroscopie. Zoals getoond in Fig. 2 werd de piek bij 1605/cm3 sterker in het IR-spectrum van CS-FA dan dat van chitosan, wat overeenkomt met C=O-rektrilling van de nieuwe amidobinding. Het resultaat gaf aan dat FA met succes werd geconjugeerd aan het amidogeen van chitosan via amidobinding. Om het percentage FA in de conjugatie te onderzoeken, werd een standaardcurve opgesteld met ultraviolette spectrofotometrie. En het percentage FA werd berekend op 23,4 ± 2,5%.

Synthetische route van CS-FA-conjugaat

FTIR-spectra van (a ) FA, (b ) chitosan, en (c ) CS-FA

Voorbereiding van HFND's

Het is algemeen bekend dat de oplosbaarheid van HCPT in water extreem slecht is, maar het kan oplossen in alkali. De chitosan is juist het tegenovergestelde:oplosbaar in zuren en onoplosbaar in water. En de CS-FA toonde een vergelijkbare oplosbaarheid als chitosan. Daarom werden de HCPT en de CS-FA opgelost in respectievelijk alkali en zuren. Wanneer de twee oplossingen werden gemengd, zou een neutralisatiereactie plaatsvinden. Het geproduceerde mengsel werd gecontroleerd om neutraal te zijn, wat een slecht oplosmiddel zou zijn voor zowel HCPT als CS-FA. De afname van de oplosbaarheid veroorzaakt door pH-veranderingen bood een mogelijkheid voor de nucleatie van HCPT-nanonaalden en de bijbehorende coprecipitatie van CS-FA op de groeiende HCPT-nanonaalden (figuur 3a). De dynamische kiemvorming en precipitatie van de nanonaalden onder ultrageluid, plus de actieve occlusie van het zachte ingrediënt CS-FA, leidde tot de vorming van HFND's in plaats van bulk-HCPT-kristal. Om de formuleringsomstandigheden te optimaliseren, werd een conditie-experiment ontworpen om het effect van de verhouding van HCPT tot CS-FA, ultrasoon vermogen, pH van het geproduceerde mengsel en concentratie van het geproduceerde mengsel op de morfologie van HFND's te bestuderen (tabel 1).

een Illustratie van de volledig groene methode voor het bereiden van HFND's. b , c De SEM-beelden van HFND's

Figuur 4 toont de morfologie van de deeltjes onder verschillende omstandigheden. Wanneer CS-FA te veel was, zou overtollig CS-FA zich hechten aan het oppervlak van de geproduceerde deeltjes (figuur 4a). Hoewel CS-FA te weinig was, was de CS-FA niet in staat om de groei van de HCPT-nanonaalden te stoppen, die vatbaar waren voor aggregatie (figuur 4b). Omdat de kiemvorming werd veroorzaakt door pH-veranderingen, speelde de pH van het geproduceerde mengsel een belangrijke rol in het bereidingsproces. De pH moet op neutraal worden gehouden, anders zou de kristallisatie worden beschadigd (Fig. 4c). Het ultrasone vermogen had ook een grote invloed op de morfologie van de HFND's. De nanonaalden zouden bij laag vermogen aggregeren (figuur 4d) en bij hoog vermogen uiteenvallen in fragmenten (figuur 4e). Bovendien bleek de concentratie van het geproduceerde mengsel een groot effect te hebben op de grootte van HFND's. De grootte nam af door de concentratie te verhogen (Fig. 3b en 4f).

een –f De SEM-afbeeldingen van HFND's onder verschillende omstandigheden (zie details in tabel 1). g Deeltjesgrootteverdeling van de HFND's. u Zeta-potentiaal van de HFND's

Figuur 3b, c toont de geoptimaliseerde naaldvormige morfologie van de HFND's met een gemiddelde lengte van ongeveer 800 nm en de breedte van ongeveer 80 nm. Het resultaat van de DLS-meting toont een grootte van 104,3 ± 5,7 nm (Fig. 4g) en een zeta-potentiaal van +16,3 ± 1,9 mv (Fig. 4h). Bovendien vertoonde een dispersie van 2 gew.% HFND's een goede stabiliteit gedurende ten minste 2,5 dagen. Aangezien er geen fluorescentiesignalen van CS-FA zijn, kunnen we het HCPT-medicijnladingsgehalte van de HFND's meten met behulp van de fluorescentiekenmerken van HCPT. Het HCPT-medicijnladingsgehalte van de HFND's was 70,2 ± -3,1% en de inkapselingsefficiëntie was 83,1%. En het FA-gehalte van de HFND's was 7,0%, wat werd berekend via het percentage FA in CS-FA.

XRD-analyse

Zoals bekend heeft de vorm van het medicijn grote invloed op de eigenschappen van de nanodeeltjes. Daarom is het van groot belang om de vorm van HCPT in de HFND's te begrijpen. Röntgendiffractie werd gebruikt om de vorm van HCPT in de HFND's te detecteren (figuur 5). Het is duidelijk dat zuiver HCPT veel scherpe kristallijne pieken vertoont, representatief voor de kenmerken van hoge kristalliniteit. Hoewel de brede pieken van semikristallijn chitosan nog steeds bestonden in het XRD-patroon van de HFND's, behoorde een meerderheid van de pieken tot HCPT, wat wijst op de hoge kristalliniteit van HCPT. Kortom, de XRD-resultaten suggereren dat HCPT zich in de kristallijne toestand in HFND's bevindt. Bovendien was de groeikinetiek van HCPT binnen de HFND's veranderd, voornamelijk als gevolg van de actieve occlusie en beperkende effecten van CS-FA. Om het effect van CS-FA in het kristallisatieproces te onderzoeken, werden de HCPT-kristallen bereid zonder het bestaan ​​van CS-FA. Figuur 6 toonde de morfologie van de HCPT-kristallen. Ze waren staafvormig, met een lengte van meer dan 10 μm, wat totaal anders was dan die van HFND's. Dit toonde verder aan dat de CS-FA de groeikinetiek van HCPT binnen de HFND's had veranderd.

De XRD-patronen van (a ) chitosan, (b ) HCPT, en (c ) MHND's

Het SEM-beeld van HCPT-bulkkristallen

In vitro onderzoeken naar geneesmiddelafgifte

Aangezien het geneesmiddelafgiftegedrag een belangrijke eigenschap is voor een geneesmiddelafgiftesysteem, werden de in vitro afgiftestudies van de HFND's uitgevoerd met behulp van een dialysetechniek, samen met gratis HCPT-poeders. Alle monsters werden getest door middel van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). De afgifteprofielen worden getoond in Fig. 7. Het profiel van vrij HCPT toonde aan dat ten minste 30% van het geneesmiddel werd afgegeven bij de eerste bemonsteringstijd van 1 uur en bijna 100% tegen 18 uur. Het afgifteprofiel van de HFND's lijkt echter een opgemerkte langdurige en aanhoudende afgifte van de twee geneesmiddelen gedurende 48 uur te zijn. De verlengde afgifte van het geneesmiddel kan worden toegeschreven aan het feit dat de polymere schil van CS-FA de afgifte van het geneesmiddel in de kern zou kunnen beperken. Deze voordelen kunnen de toepassing van de HFND's voor een langdurig medicijnafgiftesysteem bevorderen.

In vitro geneesmiddelafgifteprofielen van de MHND's in PBS (pH 7,4) bij 37 ° C. (een ) Gratis HCPT; (b ) HFND's

Cellulaire opname

Het maakt niet uit hoe het medicijnafgiftesysteem de doeltumorplaats bereikt, door systemische toediening of door directe lokale toediening, het is van groot belang als ze binnen het tumorgebied zouden kunnen doordringen om op hun intracellulaire doel in te werken. Confocale laser scanning microscopie (CLSM) werd uitgevoerd om de cellulaire opname van HFND's te beoordelen. Om hun efficiëntie van cellulaire opname door HeLa-cellen te evalueren, werden de HFND's en de HCPT-geladen nanonaalden (ND's; medicijnbelading   =-64,7%) gedurende 8 uur bij 37 ° C met HeLa-cellen geïncubeerd (de ND's werden bereid door HCPT en chitosan via dezelfde methode als de HFND's). Zoals getoond in Fig. 8, werd een veel intensere fluorescentie-emissie van HCPT gedetecteerd uit de cellen die waren blootgesteld aan de HFND's dan die van degenen die waren blootgesteld aan ND's na 8 uur incubatie, wat illustreert dat de FA op het oppervlak van de deeltjes sterk zou kunnen verbeteren de cellulaire opname.

Intracellulaire medicijnafgifte gedurende 8 uur bij 37 ° C. Confocale laser scanning microscopie beelden van HeLa cellen geïncubeerd met a HFND's en b ND's

Om verder te bevestigen dat de cellulaire internalisatiesnelheid van de HFND's sneller was, werden fluorescentiemetingen uitgevoerd om het verschil in fluorescentie-emissie-intensiteit van HCPT in de HeLa-cellen te kwantificeren. In overeenstemming met de CLSM-waarnemingen hadden HFND's veel meer de voorkeur dan ND's in het cellulaire internalisatieproces (Fig. 9). Dit heeft de targeting-eigenschap van HFND's verder gevalideerd.

Fluorescentiemetingen van de HeLa-cellen geïncubeerd met HFND's (a ) en ND's (b ) gedurende een incubatieperiode van 8 uur bij 37 ° C; P < 0.05

Cytotoxiciteitstesten

Om de mogelijkheid van het gebruik van de HFND's voor lokale medicijnafgifte verder te onderzoeken, hebben we het dodende vermogen van de HFND's voor kankercellen getest. De cytotoxiciteit van HFND's werd geëvalueerd met behulp van de MTT-assay met de HeLa-cellen. De vrije HCPT en ND's die equivalente concentraties HCPT bevatten, werden als controle gebruikt. De HCPT-concentraties waren 0,50, 1,00, 2,00, 4,00, 8,00 en 16 g/ml. Zoals te zien is in figuur 10, was de cytotoxiciteit van HCPT hoger dan die van ND's, voornamelijk vanwege de veel snellere geneesmiddelafgiftesnelheid van HCPT dan die van ND's. Niettemin was de cytotoxiciteit van de HFND's hoger dan die van HCPT. Dit was waarschijnlijk te wijten aan de targeting-eigenschap van FA op het oppervlak van de HFND's, wat de deeltjes zou kunnen helpen de cellen binnen te gaan en ze te doden. De HFND's vertoonden dus een verrassend goed dodend vermogen voor de kankercellen. Deze resultaten bevestigen dat FA op het oppervlak van de HFND's de cellulaire opname van de deeltjes kan verhogen en zo hun dodend vermogen voor kankercellen kan vergroten door zich te binden aan FA-receptoren.

In vitro cellevensvatbaarheid van HeLa-cellen behandeld met (a ) gratis HCPT, (b ) ND's, en (c ) HFND's na incubatie van 24 uur. P < 0.05

Biodistributie

Om het tumordoelvermogen van dual-drug nanonaalden te evalueren, werd DiR gebruikt als een nabij-infrarood fluorescentieprobe om te worden ingekapseld in vrije HCPT, ND's en HFND's bij de equivalente DiR-concentratie. 0,9% NaCl, DiR-ND's en DiR-HFND's werden intraveneus geïnjecteerd in de muizendragende tumoren afkomstig van HeLa-cellen van het cervixcarcinoom van de mens, en hun in vivo biodistributies werden onderzocht.

Zoals weergegeven in Fig. 11a, terwijl er geen fluorescerende signalen werden gedetecteerd op tumorplaatsen in de groep van DiR-ND's, werd een sterk fluorescerend signaal gevisualiseerd in de DiR-HFND-groep. Toen de totale fluorescentietellingen de hele tijd werden verlaagd, werd de intensiteit van het signaal op de tumorplaats verhoogd van 1 tot 12 uur, wat aangeeft dat de HFND's zich gedurende deze tijd in tumoren ophoopten. Na 24 uur werden de muizen opgeofferd en werden zowel de tumorweefsels als de normale weefsels geïsoleerd voor ex vivo beeldvorming en analyse (Fig. 11b, c). De fluorescentie-intensiteit in het tumorweefsel van met DiR-HFND's behandelde muizen was significant hoger dan de andere muizen. Er werd gevalideerd dat de introductie van FA de nanonaalden een uitstekende tumortargeting-effectiviteit bood, wat leidde tot een hogere, zeer efficiënte kankerbehandeling.

een Distributie en tumoraccumulatie van DiR-nanodeeltjes in HeLa-tumordragende muizen die intraveneuze injectie van de aangegeven formuleringen kregen. b Ex vivo fluorescentiebeeldvorming van de tumor en normale weefsels geoogst van de geëuthanaseerde HeLa-tumordragende naakte muizen. De beelden zijn 24 uur na de injectie genomen. H, Li, Lu, K, S en T vertegenwoordigen respectievelijk het hart, de lever, de longen, de nieren, de milt en de tumor. c DiR-fluorescentie-intensiteit in tumorweefsels verzameld 24 uur na systemische injectie. P < 0.05. (een ) 0,9% NaCl, (b ) DiR-ND's, en (c ) DiR-HFND's

Tumorremming in vivo

Om de in vivo antitumoreffecten te evalueren, hebben we HeLa-tumorxenotransplantaten gegenereerd in Kunming-muizen en de tumorgroei beoordeeld na de intraveneuze toediening van 0,9% NaCl, gratis HCPT, ND's en HFND's met dezelfde concentratie HCPT. Vergeleken met de muizen die werden behandeld met 0,9% NaCl als controle, nam de groeisnelheid van de tumoren bij muizen die gratis HCPT of ND's kregen geleidelijk af (Fig. 12a), wat wijst op de significant effectieve remming van de tumorgroei. Merk op dat de HFND's leidden tot de meest uitgesproken remming van tumorgroei. Aan het einde van het experiment werden de tumoren uitgesneden en gewogen. Zoals getoond in Fig. 12c, werd gevonden dat de dual-drug nanonaalden een superieure therapeutische werkzaamheid hadden in vergelijking met de andere groepen (P < 0.05). Een aanvullend bewijs van het verbeterde antikankereffect van de dual-drug nanonaalden werd getoond in de histologische afbeeldingen (Fig. 12d). Voor elk medicijnafgiftesysteem moet rekening worden gehouden met de systemische toxiciteit die gewoonlijk wordt aangetroffen bij de gratis HCPT-gemedieerde behandeling om de veiligheid en effectiviteit te garanderen. In dit werk resulteerde de toediening van de gratis HCPT in de lusteloosheid/luiheid en ernstig verlies van lichaamsgewicht bij muizen (Fig. 12b), een indicatie van de ongewenste bijwerkingen van chemotherapie. Integendeel, er werden geen duidelijke bijwerkingen aangetoond bij de muizen die werden behandeld met ND's en HFND's. Over het algemeen werd aangegeven dat de HFND's met de superieure antikankereffecten en lagere toxiciteit de werkzaamheid van de kwaliteit van leven therapie aanzienlijk zouden verbeteren.

Antikankereffecten van verschillende (nano)formuleringen. een Volumeverandering van tumor bij muizen tijdens de behandeling. b Gewichtsverandering van de tumordragende muizen tijdens de behandeling. c Gewichten van HeLa-tumoren na behandeling met verschillende formuleringen. d Histologische sectie van de tumor van de muizen na de behandeling. (een ) 0,9% NaCl waterige oplossing, (b ) gratis HCPT, (c ) ND's, en (d ) HFND's. Alle formuleringen gebruikten dezelfde concentratie HCPT in muizendragende HeLa-tumor. P < 0.05